一种肝脏组织模拟结构的成形方法与流程

本发明属于生物体复杂组织器官的人工制造技术领域，涉及利用细胞、合成高分子材料、细胞基质材料制备复杂组织人工肝脏的工艺方法，不同于以往组织工程工艺。

背景技术：

组织工程学的提出为人工组织和器官的制造与培养指明了一条前进的道路。尤其是在今天器官移植技术越来越成熟，而相应的器官来源却越来越紧缺的情况下，发展人工组织器官制造就成了造福人类的当务之急。

虽然人工组织器官移植还是一个相对不成熟的领域，需要长期的积累与探索，且涉及其他伦理道德问题，但目前已经发展出了诸如骨骼、软骨、皮肤等结构相对简单的人造组织，并已经得到了一定的临床应用。本发明在前人工作的基础上，通过不断地实践，摸索出一套新的人工肝脏的制造方法，使复杂器管，如肝脏、心脏、肾脏、乳房，的制造大大向前迈进了一步。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种肝脏组织模拟结构及其成形方法，使其在功能和结构上模拟天然的动物体肝脏，为器官制造、移植等领域提供新的可能性。

本发明的技术方案如下：

一种肝脏组织模拟结构，其特征在于：所述肝脏组织模拟结构包括主体结构、动脉血管系统、静脉血管系统、神经系统和胆管系统；

所述的动脉血管系统、静脉血管系统和神经系统设置在主体结构内部，部分胆管系统分布在主体结构内，另一部分分布在主体结构外；所述主体结构从里至外依次为含血管种子细胞的水凝胶层、含肝脏种子细胞水凝胶层、含干细胞的水凝胶层和保护层；

所述动脉血管系统和静脉血管系统为含血管种子细胞的水凝胶构成的分支管状结构；所述神经系统(103)为含神经种子细胞的水凝胶构成的分支纤维束结构,所述胆管系统为含胆管上皮细胞的导管；胆管系统与血管系统间隔排列在主体结构中。

本发明所述主体结构的外轮廓呈动物体肝脏的形状、纺锤体状、球体形状或椭球体形状。所述的保护层为合成高分子材料。

本发明所述的水凝胶均采用质量百分浓度为0.1～20％的海藻酸钠、活性肽、胶原、肝素、硫酸软骨素、透明质酸、粘多糖、糖蛋白、基质胶、右旋糖、壳聚糖、明胶和纤维蛋白原溶液中的至少一种。所述肝脏种子细胞为肝细胞，或干细胞和肝细胞混合物，或干细胞与生长因子混合物；干细胞为脂肪干细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的至少一种；所述血管种子细胞为脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的至少一种；所述神经种子细胞为神经元，或雪旺氏细胞，或干细胞与生长因子混合物。所述的合成高分子材料采用聚乙烯、聚己内酯、聚氨酯、聚四氟乙烯、聚乳酸、聚酯以及乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物。

本发明提供的一种肝脏组织模拟结构的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

1)制备专用模具：利用机加工或三维打印的方法制备所述专用模具，该模具包括下模具、内模具、模拟胆管系统模具和上模具；所述的内模具包括模拟动脉血管系统内模具、模拟静脉血管系统内模具和模拟神经系统的内模具；

2)将模拟动脉、静脉和神经系统的三个内模具由第一级上模具顶部的三个孔插入并固定好，然后一起放置于下模具的第一级台阶上固定；将模拟胆管系统模具穿过下模具上的孔洞固定；之后将含血管种子细胞的水凝胶灌注到内模具和第一级上模具之间的缝隙中，并采用交联剂使含血管种子细胞的水凝胶交联，去除第一级上模具，形成稳定的含血管种子细胞的水凝胶层；

3)使用直径比第一级大的第二级上模具放置在下模具的第二级台阶上固定，将含肝脏种子细胞的水凝胶灌注到含血管种子细胞的水凝胶层和第二级上模具之间的缝隙中，并采用交联剂使含肝脏种子细胞的水凝胶交联，去除第二级上模具，形成稳定的含肝脏种子细胞水凝胶层；

4)依照步骤3)的方法，使用直径比第二级上模具大的第三级上模具放置在下模具的第三级台阶上固定，将含干细胞的水凝胶灌注到肝脏种子细胞水凝胶层和第三级上模具之间的缝隙中，并采用交联剂使含干细胞的水凝胶交联，得到含干细胞的水凝胶层；

5)去除内模具和下模具，在模拟动脉和模拟静脉血管系统内模具留下的缝隙中分别灌注血管内皮细胞，形成动脉血管系统和模拟静脉血管系统，在模拟神经系统内模具留下的缝隙中灌注雪旺氏细胞悬浮液，形成分支神经系统；

6)将裸露在主体结构外的部分胆管系统用一层含肝细胞的水凝胶包裹，并采用交联剂使含细胞的水凝胶交联；

7)将合成高分子材料溶于有机溶剂中制成质量百分浓度为5％～30％的合成高分子溶液，并置于喷雾瓶中，在成形的主体结构表面均匀喷涂一层合成高分子材料，然后放入PBS溶液中萃取，最终得到稳定的肝脏组织模拟结构。

本发明的方法中，所述上模具、下模具、模拟动脉血管系统内模具、模拟静脉血管系统内模具、模拟神经系统内模具和模拟胆管系统内模具采用金属或合成高分子材料；所述金属采用铝合金、黄铜或不锈钢材料；合成高分子材料采用聚四氟乙烯、PBS塑料、光敏树脂、橡胶、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物塑料、聚笨乙烯塑料、聚甲基丙烯酸甲酯塑料、聚甲醛塑料、聚丙烯塑料、聚乙烯塑料、聚氯乙烯、聚酰胺塑料、聚碳酸酯塑料、环氧树脂、聚己内酯、聚氨酯或有机硅塑料。

本发明与现有技术相比，有以下优点及突出性的技术效果：①本发明的肝脏组织模拟结构，具有动脉、静脉、神经和胆管组织网络，比以往任何人工器官都复杂，更接近人体器官的真实形貌，并能完成肝脏的各种生理功能。②本发明的成形方法保证了不同走向的动脉、静脉、神经和胆管系统在同一结构体内的有机排列。③该方法制作简便，成本低。

附图说明

图1为肝脏组织模拟结构示意图。

图2为制备肝脏组织模拟结构的模具结构示意图。

图中：101-动脉血管系统；102-静脉血管系统；103-神经系统；104-保护层；105-含干细胞的水凝胶层；106-含肝脏种子细胞水凝胶层；107-含血管种子细胞的水凝胶层；108-胆管系统。

201-下模具；202a-模拟动脉血管系统内模具；202b-模拟静脉血管系统内模具；202c- 模拟神经系统内模具；203第一级上模具；204-第二级上模具；205-模拟胆管系统内模具。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的说明。

如图1所示，本发明提供的一种肝脏组织模拟结构包括主体结构、动脉血管系统101、静脉血管系统102、神经系统103和胆管系统108；所述的动脉血管系统101、静脉血管系统 102和神经系统103设置在主体结构内部，部分胆管系统108分布在主体结构内，另一部分分布在主体结构外；所述主体结构外轮廓呈动物体肝脏的形状、纺锤体状、球体形状或椭球体形状。

所述主体结构从里至外依次为含血管种子细胞的水凝胶层107、含肝脏种子细胞水凝胶层 106、含干细胞的水凝胶层105和保护层104；所述动脉血管系统和静脉血管系统为含血管种子细胞的水凝胶构成的分支管状结构；所述神经系统103为含神经种子细胞的水凝胶构成的分支纤维束结构,所述胆管系统为含胆管上皮细胞的导管；胆管系统与血管系统间隔排列在主体结构中。

所述的水凝胶均采用质量百分浓度为0.1～20％的海藻酸钠、活性肽、胶原、肝素、硫酸软骨素、透明质酸、粘多糖、糖蛋白、基质胶、右旋糖、壳聚糖、明胶和纤维蛋白原溶液中的至少一种。

所述肝脏种子细胞为肝细胞，或干细胞和肝细胞混合物，或干细胞与生长因子混合物；干细胞为脂肪干细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的至少一种；所述血管种子细胞为脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的至少一种；所述神经种子细胞为神经元，或雪旺氏细胞，或干细胞与生长因子混合物。

所述的保护层104为合成高分子材料，合成高分子材料采用聚乙烯、聚己内酯、聚氨酯、聚四氟乙烯、聚乳酸、聚酯以及乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物。

本发明提供的一种肝脏组织模拟结构的制备方法，该方法包括如下步骤：

1)制备专用模具：利用机加工或三维打印的方法制备所述专用模具，该模具包括下模具 201、内模具、模拟胆管系统模具和上模具；所述的内模具包括模拟动脉血管系统内模具、模拟静脉血管系统内模具和模拟神经系统的内模具；上模具、下模具、内模具和外模具的材料可采用金属或合成高分子材料，如铝合金、黄铜、不锈钢、聚四氟乙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS)塑料、光敏树脂、橡胶、聚笨乙烯(PS)塑料、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA) 塑料(有机玻璃)、聚甲醛(POM)塑料、聚丙烯(PP)塑料、聚乙烯(PE)塑料、聚氯乙烯 (PVC)、聚酰胺(PA)塑料(尼龙)、聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚碳酸酯(PC)塑料、环氧树脂(EP)或有机硅塑料(IS)。

下模具内部为从内至外依次变大的阶梯状，台阶的级数可根据需要制作的基质层数而定。下模具的材料为硬质合成高分子材料，如图2所示(以四级台阶为例)。

不同直径的上模具与下模具中相同直径的台阶相对应。不同直径的上模具的外壳厚度与下模具中各级台阶宽度相对应。

2)将模拟动脉、静脉和神经系统的三个内模具202由第一级上模具203顶部的三个孔插入并固定好，然后一起放置于下模具201的第一级台阶上固定；将模拟胆管系统模具205 穿过下模具201上的孔洞固定；之后将含血管种子细胞的水凝胶灌注到内模具202和第一级上模具203之间的缝隙中，并采用交联剂使含血管种子细胞的水凝胶交联，去除第一级上模具203，形成稳定的含血管种子细胞的水凝胶层107；

3)使用直径比第一级大的第二级上模具204放置在下模具201的第二级台阶上固定，将含肝脏种子细胞的水凝胶灌注到含血管种子细胞的水凝胶层107和第二级上模具204之间的缝隙中，并采用交联剂使含肝脏种子细胞的水凝胶交联，去除第二级上模具204，形成稳定的含肝脏种子细胞水凝胶层106；

4)依照步骤3)的方法，使用直径比第二级上模具大的第三级上模具放置在下模具201 的第三级台阶上固定，将含干细胞的水凝胶灌注到肝脏种子细胞水凝胶层和第三级上模具之间的缝隙中，并采用交联剂使含干细胞的水凝胶交联，得到含干细胞的水凝胶层；

5)去除内模具和下模具，在模拟动脉和模拟静脉血管系统内模具留下的缝隙中分别灌注血管内皮细胞，形成动脉血管系统和模拟静脉血管系统，在模拟神经系统内模具留下的缝隙中灌注雪旺氏细胞悬浮液，形成分支神经系统；

6)将裸露在主体结构外的部分胆管系统用一层含肝细胞的水凝胶包裹，并采用交联剂使含细胞的水凝胶交联；

7)将合成高分子材料溶于有机溶剂中制成质量百分浓度为5％～30％的合成高分子溶液，并置于喷雾瓶中，在成形的主体结构表面均匀喷涂一层合成高分子材料，然后放入PBS溶液中萃取，最终得到稳定的肝脏组织模拟结构。

下面举出几个具体的实施例，以进一步理解本发明。

实施例1

1)使用聚四氟乙烯制以机加工的方式备含两级台阶的上模具，用聚氨酯制备含一级分支的模拟动脉血管系统、模拟静脉血管系统和模拟神经系统的内模具，用聚乙烯制备带微孔的含一级分支的模拟胆管系统内模具；配制1％纤维蛋白原溶液，将模拟动脉、静脉、神经和胆管系统的四个内模具分别由第一级上模具顶部的三个孔和下模具的孔洞插入固定，然后一起在下模具的第一级台阶上固定。在内模具与第一级上具间注入纤维蛋白原与血管内皮细胞的混合物，细胞密度为1×10⁷个/mL，然后加入凝血酶溶液(20IU/mL)浸泡成形物2分钟聚合，去除第一级上模具，形成稳定的含血管内皮细胞的水凝胶层；

2)使用直径比第一级大的第二级上模具套在底座模具的第二级台阶上。将纤维蛋白原/ 肝细胞混合物(细胞密度为1×10⁵个/mL)，灌注到含血管内皮细胞的水凝胶层和第二级上模具之间的缝隙中，然后加入凝血酶溶液(20IU/mL)使含肝细胞的水凝胶中纤维蛋白原聚合，去除上模具，形成稳定的含肝细胞的水凝胶层；

3)使用直径比第二级大的第三级上模具套在底座模具的第三级台阶上。将纤维蛋白原/ 脂肪干细胞混合物(细胞密度为1×10⁴个/mL)，灌注到含肝细胞的水凝胶层和第三级上模具之间的缝隙中，然后加入凝血酶溶液(20IU/mL)使含肝细胞水凝胶中纤维蛋白原聚合，去除上模具，形成稳定的含脂肪干细胞的水凝胶层；

4)去除模拟动脉血管系统、模拟静脉血管系统和模拟神经系统的内模具和下模具，在模拟动脉和模拟静脉血管系统内模具留下的缝隙中分别灌注血管内皮细胞，形成动脉血管系统和模拟静脉血管系统，在模拟神经系统内模具留下的缝隙中灌注雪旺氏细胞悬浮液，形成分支神经系统；

5)将裸露在主体结构外的部分胆管系统用一层含肝细胞的水凝胶包裹，并采用交联剂使含细胞的水凝胶交联；

6)将合成高分子聚氨酯溶于有机溶剂中制成质量百分浓度为5％的合成高分子溶液，并置于喷雾瓶中，在成形的主体结构表面均匀喷涂一层聚氨酯，然后放入PBS溶液中萃取，最终得到稳定的肝脏组织模拟结构。

实施例2：

1)用ABS为原料以3D打印的方式制备含三级台阶的下模具，上模具与内模具，用聚乙烯制备含二级分支的内模具；

2)配制1％海藻酸钠溶液，将模拟血管、神经和胆管系统的三个内模具和一个外模具由第一级内模具顶部的三个孔插入并固定好，然后一起放置于下模具的第一级台阶上固定，并将内模具的分支插入下模具的阵列孔之中固定。在内模具与第一级上模具间注入含1％紫杉醇的海藻酸钠内皮细胞生长因子(EGF10ng/mL)/脂肪干细胞混合物(细胞密度为1×10³个/mL)，然后加入重量体积比为1％的氯化钙2分钟使海藻酸钠交联，去除第一级上模具，形成稳定的含内皮细胞生长因子/脂肪干细胞的水凝胶层；

3)使用直径比第一级大的第二级上模具套在下模具的第二级台阶上。将海藻酸钠/肝细胞生长因子(HGF0.5ng/mL)/脂肪干细胞混合物(细胞密度为1×10⁴个/mL)灌注到含脂肪干细胞的水凝胶层和第二级上模具之间的缝隙中，然后加入重量体积比为1％的氯化钙2分钟使海藻酸钠交联，去除上模具，形成稳定的含肝细胞生长因子/脂肪干细胞的水凝胶层；

4)使用直径比第二级大的第三级上模具套在下模具的第三级台阶上。将海藻酸钠/脂肪干细胞混合物，灌注到含肝细胞生长因子/脂肪干细胞的水凝胶层和第三级上模具之间的缝隙中，然后加入重量体积比为1％的氯化钙2分钟使海藻酸钠交联，去除上模具，形成稳定的含脂肪干细胞的水凝胶层；

6)去除上、下、中模具，模拟神经系统内模具留下的缝隙中灌注雪旺氏细胞悬浮液，形成分支神经系统；

7)配备浓度为10％(W/V)的PLGA/四乙二醇(Tetraglycol)溶液，加入1％(W/W) 的紫杉醇，注入喷雾瓶中，在成形的人工肝脏表面均匀喷涂一层PLGA，然后放入PBS溶液中萃取，得到最终的稳定的肝脏组织模拟结构。

实施例3：

1)使用可降解金属镁为原料以三维(3D)打印的方式备含两级台阶的上模具，底模具，内模具与外模具；配制0.1％胶原溶液，将模拟动脉、静脉、神经和胆管系统的四个内模具由下模具上的孔洞固定。在内模具与第一级上模具间注入胶原溶液、骨髓干细胞与内皮细胞生长因子(EGF0.5ng/mL)混合物，其中骨髓干细胞密度为1×10³个/mL，然后加入0.01M的氢氧化钠溶液2分钟使胶原聚合成形，去除第一级上模具，形成稳定的含骨髓干细胞与内皮细胞的水凝胶层；

2)使用直径比第一级大的第二级上模具套在底座模具的第二级台阶上。将纤维蛋白原/ 骨髓干细胞混合物(细胞密度为1×10³个/mL)，加入肝细胞生长因子(HGF0.5ng/mL)、人血小板衍化生长因子(BB或PDGF-BB 50ng/mL)、转化生长因子β1(TGFβ1 10ng/mL)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF 205ng/mL)，灌注到含骨髓干细胞与内皮细胞的水凝胶层和第二级上模具之间的缝隙中，然后加入凝血酶溶液(20IU/mL)使细胞基质溶液中的纤维蛋白原聚合，去除上模具及内模具，形成稳定含骨髓干细胞与生长因子的水凝胶层；

3)去除上、下、中模具，模拟神经系统内模具留下的缝隙中灌注雪旺氏细胞悬浮液，形成分支神经系统；

4)配备浓度为20％(W/V)的PCL/四乙二醇(Tetraglycol)溶液，加入1％(W/W)的肝素，注入喷雾瓶中，在成形的人工肝脏表面均匀喷涂一层PCL，然后放入PBS溶液中萃取，得到最终的稳定的肝脏组织模拟结构。