防治流感及病毒性肺炎的中药复方制剂的制作方法

本发明属中药领域，涉及中药复方，具体涉及防治流感及病毒性肺炎的中药复方制剂，尤其是用于治疗病毒诱导急性肺损伤的复方药物。

背景技术：

研究报道，病毒性肺炎(viralpneumonia)是由多种病毒感染而引起的肺部炎症，通常是由上呼吸道病毒感染向下蔓延所致。研究显示，引起肺炎的病毒以流感病毒为常见，还包括副流感病毒，巨细胞病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒和某些肠道病毒等也可导致病毒性肺炎。甲型流感病毒是引起人和禽类呼吸道疾病的重要病原体。流感病毒侵入细支气管上皮引起细支气管炎，感染波及肺间质与肺泡而致肺炎；流感病毒一方面在呼吸道上皮细胞和血管内皮细胞内复制，损伤肺组织，破坏气体交换屏障；另一方面，通过巨噬细胞、分叶核中性粒细胞、淋巴细胞以及内皮细胞等释放大量细胞因子，宿主免疫机制被过度激活并失控，导致急性肺损伤(孙婉容，吴琦，邵世峰.国际呼吸杂志，2011，14:1094-1096)。研究报道，在机体抗病毒感染免疫的过程中，早期起作用的是以巨噬细胞、干扰素和nk细胞为主的非特异性免疫，后期则是特异性的细胞免疫和体液免疫起作用；在流感病毒感染的过程中，单核/巨噬细胞活化产生多种细胞因子，以网络的形式在调节机体的免疫应答和炎症反应中起着重要作用(侯佩莉，张茂林，李影，关振宏.动物医学进展，2010,10：108-112)。

甲型h1n1流感是由a型流感病毒(influenzaavirus，iav)引起的一种急性呼吸道传染病，该a型流感病毒是病毒性肺炎的常见病原微生物，调查显示，人群对甲型h1n1流感病毒普遍易感，通常表现为流感样症状，少数病例病情进展迅速，出现呼吸衰竭，病情严重者可以导致死亡。在流感重症临证中，中医颜乾麟认为疫疠之邪，从口鼻侵犯人体，病势强悍，传变迅猛的特点，尤为强调攻邪不伤正；在临证中寒温药物同用，扶正达邪，一则提高机体卫外抗邪能力，再则注意顾护人体脾胃之气；运用此法，在长期临床过程中反复实践，每获殊效， 故创制寒温药物并用的中药复方羌英方。

流感病毒诱导的病毒性肺炎主要病理改变是肺泡水平的气体交换障碍，病毒感染后所致的急性肺损伤(acutelunginjury,ali)可引发患者出现呼吸窘迫和严重的低氧血症。研究表明单核细胞浸润、肺泡水肿是形成肺毛细血管通透性增高及肺水肿的病理基础，病毒感染诱发的肺损伤，临床表现为呼吸困难，严重的可以导致急性呼吸窘迫综合征，甚至死亡。本发明证实了羌英汤对甲型流感病毒诱导的急性肺损伤小鼠具有保护作用。

综观国内外的研究，均未见报道羌英汤治疗病毒诱导急性肺损伤的药效及其药物研究。本申请的发明人拟提供中药羌英汤在用于制备防治甲型流感及病毒性肺炎的药物中的新的药用用途。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种防治流感及病毒性肺炎的中药复方制剂，具体涉及防治甲型流感及病毒性肺炎的中药复方制剂，尤其是用于治疗病毒诱导急性肺损伤的复方药物。

本发明所述的复方制剂由羌活，苍术，蒲公英，黄芩，生黄芪，防风，鱼腥草，天花粉八味中药材制成；其中，羌活为君，发汗达邪，祛风燥湿；蒲公英，黄芩，鱼腥草，天花粉为臣，清热解毒燥湿；黄芪，防风，苍术为佐使药，益气固表。全方发汗达邪，清热解毒，补脾实卫，发汗而不峻猛，达邪不伤正，清热解毒但顾护脾胃之本，以李东垣《内外伤辨惑论》中指出“脾胃一虚，肺气先绝”为指导，活用黄芪、苍术，一来托表达邪，再则“先安未受邪之地”。所述的复方制剂集中体现了内外因兼顾，标本同治，散中寓补，补内兼疏的治疗思路。

本发明的实施例中，所述的复方制剂的中药材按下述重量比例配伍组成：羌活5g；苍术10g；蒲公英20g；黄芩10g；黄芪20g；防风5g；鱼腥草10g；天花粉15g，进一步制备本发明复方制剂冻干粉。

基于中医在流感重症临证中，认为重症h1n1流感属邪盛正虚，虚实夹杂之证，湿热毒邪为其病理因素，自拟益气固表，清热燥湿解毒进行治疗。

本发明采用复方制剂中药材水提物，经整体动物模型试验证实，其针对h1n1甲型流感病毒毒株诱导的小鼠肺急性损伤模型，具有显著增加病毒感染 鼠的存活率，改善体重，减轻肺部的炎性损伤，降低病毒效价，抑制炎性细胞因子、趋化因子及nfκb炎性转录因子的表达的药效，能显著治疗流感病毒诱导的急性肺损伤。

本发明实验证实，所述的复方制剂不仅能抑制流感病毒在鼠肺内的复制，还能减轻病毒感染造成的炎性免疫损伤；其保护病毒诱导肺损伤的作用机制与抗病毒、抗炎有关，通过降低肺毛细血管通透性、减少淋巴细胞浸润及炎性蛋白的招募发挥的抑制肺部炎症。

本发明所述的复方制剂可用于治疗甲型流感及其诱导的病毒性肺炎。

本发明中，所述的甲型流感包括但不限于h1n1，h3n2等病毒株。

进一步，本发明所述的复方制剂可用于制备预防流感及病毒性肺炎的药物。

本发明中，所述的病毒性肺炎，包括但不限于甲型流感病毒诱导的肺炎，也可用于其它病毒诱导的病毒性肺炎。

附图说明

图1，本发明的复方制剂对h1n1病毒感染生存保护及体重的的影响。

图2，本发明的复方制剂对h1n1病毒感染鼠肺病理形态学的影响；

其中，a：正常组；b：利巴韦林组；c：本复方制剂组；d：拆方组；e：模型组。

图3，本发明的复方制剂汤对h1n1病毒感染鼠指数的影响。

图4，本发明的复方制剂对h1n1病毒感染鼠肺血凝滴度的影响。

图5，本发明的复方制剂对h1n1病毒感染鼠匀浆tnf-α的作用。

图6，本发明的复方制剂对h1n1病毒感染鼠匀浆il-6的作用。

图7，本发明的复方制剂对h1n1病毒感染鼠肺匀浆ccl5的作用。

图8，本发明的复方制剂汤对h1n1病毒感染鼠肺nfκb表达的抑制作用，

其中，a：正常组；b：利巴韦林组；c：本复方制剂组；d：拆方组；e：模型组。

具体实施方式

实施例1制备本发明复方制剂冻干粉：

取中药材羌活5g；苍术10g；蒲公英20g；黄芩10g；黄芪20g；防风5g；鱼腥草10g；天花粉15g，按常规方法制成中药饮片；

取中药饮片置于电动煎药壶内，加相当于药材量5倍的矿泉水浸泡1小时，大火煮沸30min，纱布过滤。药渣再加6倍重量矿泉水继续煎煮，煮沸20min，过滤；合并两次滤液，经旋转蒸发仪(0.095mpa，50℃)真空减压浓缩，浓缩蒸干至浸膏；再将浸膏放入冷冻干燥机(133pa，-25℃)，制备冻干粉，提取率为24％，分装，-80℃冻存。

实施例2动物实验

balb/c小鼠60只(16-18g),按体重随机分为5组(a、b、c、d，e)：a组为正常对照组，b组为h1n1病毒模型组，c组为本复方制剂组(40mg/kg)，d组为拆方对照组(mg/kg)，e组为利巴韦林100mg/kg，每组12只；除a组外的所有组动物经乙醚麻醉，滴鼻感染10ld50h1n1病毒液30μl，a组滴鼻感染1640培养液30μl作为对照；c、d、e组感染h1n1后2小时灌胃给药，剂量分别为羌英方和利巴韦林100mg/kg；同时a组与b组给予0.5％cmc灌胃给药，作为正常和病毒对照，一天给药一次，连续给药七天，停药观察到14天，每天记录动物的体重、存活数量及死亡数，计算药物对重症流感感染鼠的生命保护率及体重变化。

实施例3动物实验

balb/c小鼠40只(16-18g)，实验分组、感染剂量及给药方案同实施例2；除a组外的所有组动物经乙醚麻醉，滴鼻感染10ld50h1n1病毒液30μl，c、d、e组感染h1n1后2小时灌胃给药，剂量分别为羌英方、拆方和利巴韦林100mg/kg；同时a组与b组给予0.5％cmc灌胃给药，一天给药一次，连续给药四天，h1n1病毒攻击96h后，称量体重，摘眼球取血，取全肺标本常规处理后称重记录；其中右肺上叶置于10％福尔马林中；右肺中叶、下叶及左肺右肺下叶，用生理盐水漂洗干净，置于-80℃保存；冻存的肺组织之后 使用预冷的pbs，用匀浆器在冰浴中匀浆，收获匀浆液，离心，收集上清，分装，-80℃保存，用于检测炎性细胞因子及趋化因子等指标。

实施例4本复方制剂对重症h1n1甲型流感病毒感染鼠的生存保护试验：

选用balb/c小鼠，以h1n1甲型流感病毒滴鼻感染，建立流感病毒诱导重症肺损伤模型，给药7天，停药观察7天，观察本复方制剂对重症流感感染鼠的14天观察期的生命保护作用，结果证实，口服本复方制剂后，能提高重症流感病毒感染鼠的生命率，增加小鼠体重，具有生命保护作用。

实施例5治疗h1n1甲型流感病毒诱导急性肺损伤试验

选用balb/c小鼠，以h1n1甲型流感病毒滴鼻感染，建立流感病毒诱导的急性肺损伤模型，本复方制剂灌胃给药，96h后观察动物肺炎性损伤程度及炎性细胞因子、趋化因子，nfκb蛋白表达等指标，结果证实口服本复方制剂后，对h1n1流感病毒诱导急性小鼠肺损伤有显著的保护作用。

实施例6对病毒诱导鼠肺急性损伤的抗炎相关研究指标检测方法

1)肺指数

病毒感染第四天，动物称重，常规处理取肺脏称重，以此为肺湿重；计算肺指数，肺指数＝肺湿重(mg)/体重(g)，实验结果显示，与模型组相比，本复方制剂可显著抑制小鼠肺指数的增高(p<0.01)；

2)肺匀浆血凝效价测定

根据流感病毒上的血凝素ha能与鸡红细胞发生凝集反应的原理，评价病毒毒力的强弱；取肺匀浆液，高速离心获得上清液，将等倍系列稀释的匀浆液与u型96孔板内1％鸡红血球混合，静置观察，记录发生鸡红细胞发生凝集的稀释度即该肺组织匀浆的血凝效价，实验结果显示，与模型组相比，20mg/kg和40mg/kg本复方制剂可显著抑制病毒感染鼠肺中血凝素的效价升高(p<0.05，p<0.01)，说明能有效抑制病毒在鼠肺中的复制；

3)肺匀浆tnf-α、il-6、ccl5测定

小鼠肺匀浆液，高速离心收获上清，分装，冻存。应用elisa法，将匀浆上 清按tnf-α、il-6、ccl5试剂盒说明书测定，结果显示，与模型组相比，本复方制剂可显著降低鼠肺中干促炎因子/趋化因子tnf-α、il-6、ccl5水平的升高(p<0.05)；

4)肺组织nfkb蛋白表达的检测

将切好的4um厚的肺组织白片放在玻片架上置于烘箱烘烤30分钟，脱蜡入水，将玻片架用0.01m的pbs浸泡5分钟，然后放在97℃水浴加热的edta抗原修复液ph8.0里进行抗原修复12分钟，将放置室温的玻片用pbs浸泡5分钟，然后放入pbs浸泡5分钟，之后3％h2o2的甲醇溶液中10分钟；将玻片架放置在pbs浸泡5分钟，反复3次，然后将玻片上过多的水分用吸水纸擦去，加100ul的血清37℃孵育30分钟，擦去过多的血清，加入磷酸化nfkb一抗4℃孵育过夜，室温复温45分钟，然后用pbs浸泡5分钟，反复3次，再滴加hrp标记的二抗，37℃孵育30分钟。用pbs清洗5分钟，反复3次，滴加dab显色，再用苏木素复染30-45秒，冲洗后，用0.5％-1％的盐酸酒精分化1-2秒，迅速放置流水里冲洗，将玻片架分别放在70％酒精，80％酒精，90％酒精，100％酒精；二甲苯，二甲苯，二甲苯；用中性树胶封片，镜下观察结果，甲型流感病毒感染可以导致p-nfkb大量的表达，表明口服本复方制剂能显著抑制炎性转录因子的表达。

本发明实验结果显示，本复方制剂对流感病毒h1n1诱导的急性肺损伤均有显著治疗作用；可显著提高重症流感病毒感染小鼠的生存率，降低肺指数(肺组织湿重/体重比值)和血凝素效价、抑制肺内细胞因子、趋化因子(包括tnf-α、il-6、ccl5)的释放，并且抑制炎症核转录因子nfκb的表达。