流感病毒免疫原性组合物及其应用
【专利说明】
[0001] 本专利申请要求2013年1月10日提交的美国临时申请第61/751，077号的权益， 其全部内容通过引用纳入本文。
[0002] 政府资助的声明
[0003] 本发明部分是在国防部高级研宄计划署（DARPA)授予的第HR0011-12-3-0001号 协议的政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。
技术领域
[0004] 本发明的领域是用于针对流感病毒进行免疫的RNA和蛋白混合物的非病毒递送。
【背景技术】
[0005] 基于核酸的疫苗是诱人的免疫方案。例如，W02012/006369公开了为实现该目的 使用自复制RNA分子，且W02013/006842描述了一种方法，其中共同递送第一多肽与编码 第二多肽的自复制RNA。这两种多肽来自相同病原体，但其不需要是相同的多肽。因此， W02013/006842公开了其可共有表位或可具有不同表位，但其必须来自相同病原体。这提供 了一种组合物，其递送两种不同形式的表位（来自病原体的第一表位，以RNA编码的形式； 以及来自相同病原体的第二表位，以多肽的形式），与单独使用RNA或单独使用多肽免疫相 比，该组合物能够增强针对该病原体的免疫应答。
[0006] 本发明的一个目的是提供使用自复制RNA的其他免疫方法。
【发明内容】
[0007] 本发明通常涉及包含RNA组分和多肽组分的免疫原性组合物。该RNA组分是自复 制RNA，如下文更详细描述的那样。该多肽组分包含来自流感病毒抗原的表位（第一表位）， 且该RNA组分编码也包含来自流感病毒抗原的表位（第二表位）的多肽。如W02013/006842 中所示，与单独使用RNA或单独使用多肽进行免疫相比，以这两种不同方式递送表位的免 疫原性组合物可增强对病原体（流感病毒）的免疫应答。
[0008] 因此，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含（a)包含来自流感病毒抗原的 表位的多肽，以及（b)编码包含来自流感病毒抗原的表位的多肽的自复制RNA。
[0009] 本发明还提供了一种药盒，其包含（a)包含多肽的第一药盒组分，所述多肽包含 来自流感病毒抗原的表位，以及（b)包含自复制RNA的第二药盒组分，所述自复制RNA编码 包含来自流感病毒抗原的表位的多肽。
[0010] 本发明还提供了用于治疗和/或预防流感病毒疾病和/或感染的方法、用于诱导 针对流感病毒的免疫应答的方法，以及用于为对象接种疫苗的方法，所述方法是通过共同 递送上文所述的RNA分子和多肽分子（共同给药）来进行的。
[0011] 本发明还提供了用于治疗和/或预防流感病毒疾病和/或感染的方法、用于诱导 针对流感病毒的免疫应答的方法，以及用于为对象接种疫苗的方法，所述方法是通过依次 给予上文所述的RNA分子和多肽分子（初免-加强）来进行的。
[0012] 在本发明的第一实施方式中，该第一和第二表位都来自流感血凝素（HA)。
[0013] 在第二实施方式中，该第一和第二表位都来自甲型流感病毒。理想情况下，其都来 自具有相同HA亚型的甲型流感病毒毒株，例如都来自H5亚型的甲型流感病毒。在该实施 方式的特定方面中，该第一和第二表位都是来自相同HA亚型的血凝素表位。然而，该第一 和第二多肽也可能来自具有不同HA亚型的甲型流感病毒毒株，例如一种来自Hl毒株且一 种来自H5毒株。
[0014] 在第三实施方式中，该第一表位和该第二表位都来自乙型流感病毒。在该实施方 式的特定方面中，该第一和第二表位都是来自乙型流感病毒的血凝素表位。
[0015] 在第四实施方式中，该第一表位和该第二表位都来自B/Yamagata/16/88样谱 系中的乙型流感病毒毒株。在该实施方式的特定方面中，该第一和第二表位都是来自B/ Yamagata/16/88样谱系中的乙型流感病毒毒株的血凝素表位。
[0016] 在第五实施方式中，该第一表位和该第二表位都来自B/Victoria/2/87样谱系 中的乙型流感病毒毒株。在该实施方式的特定方面中，该第一和第二表位都是来自B/ Victoria/2/87样谱系中的乙型流感病毒毒株的血凝素表位。
[0017] 流感病毒抗原
[0018] 流感病毒具有三种类型一一甲型、乙型和丙型。甲型流感病毒是最常见的感染人、 动物和鸟类的流感病毒。乙型流感病毒大部分发生在人中。丙型流感病毒的感染不在人或 哺乳动物中引起任何严重症状。
[0019] 流感病毒毒株可随季节而变。在目前的大流行间期，目前的季节性三价疫苗包括 两种甲型流感毒株（一种HlNl毒株和一种H3N2毒株）和一种乙型流感毒株。大流行流感 毒株的特征是：(a)与目前流行的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即十年以上 在人群中未见的血凝素（如H2)，或者从未在人群中发现的血凝素（如通常只出现在鸟群 体中的H9)，以至于疫苗接受者和普通人群未曾免疫接触过该毒株的血凝素；(b)它能够在 人群中横向传播；和（c)它对人有致病性。大流行毒株通常是H2、H5、H6、H7或H9亚型甲 型流感病毒毒株，例如H5N1、H5N3、H9N2、H2N2、H6N1、H7N1、H7N7和H7N9毒株。在H5亚型 内，病毒可以属于不同进化支。
[0020]甲型流感病毒目前显示 17 种 HA 亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、 1112、1113、1114、1115、1116和1117。其还显示九种嫩（神经氨酸酶）亚型以1、吧、吧、财、阳、 N6、N7、N8 和 N9。
[0021] 乙型流感病毒目前不显示不同的HA亚型，但乙型流感病毒毒株属于两种不同的 谱系。这些谱系出现于1980年代晚期，并且具有在抗原/遗传上可彼此区分的HA [Rota等 (1992) J Gen Virol 73:2737-42]。当前的乙型流感病毒毒株是 B/Victoria/2/87 样或 B/ Yamagata/16/88样。通常可从抗原性区分这两种谱系中的毒株，但氨基酸序列的差异也可 以区分这两种谱系，例如B/Yamagata/16/88样毒株常常（但并非总是）具有氨基酸残基 164缺失（相对'Lee40'HA序列进行编号）的HA蛋白（GenBank序列GI: 325176)。
[0022] 在一些实施方式中，该第一和第二表位都来自流感病毒血凝素。例如：(a)该第一 表位可来自甲型流感病毒血凝素且该第二表位可来自乙型流感病毒血凝素；(b)该第一表 位可来自甲型流感病毒血凝素且该第二表位可来自甲型流感病毒血凝素；或者（C)该第一 表位可来自乙型流感病毒血凝素且该第二表位可来自乙型流感病毒血凝素。理想情况下， 这两种表位都来自相同的流感病毒类型，例如都来自甲型或都来自乙型。
[0023] 在其中第一和第二表位都来自甲型流感病毒的实施方式中，理想情况下其都是血 凝素表位，且来自具有相同HA亚型的甲型流感病毒毒株。例如，两种表位可以都来自Hl血 凝素、H2血凝素、H3血凝素、H4血凝素、H5血凝素、H6血凝素、H7血凝素、H8血凝素、H9血 凝素、HlO血凝素、Hll血凝素、H12血凝素、H13血凝素、H14血凝素、H15血凝素、H16血凝 素或Hl7血凝素。在一个特定实施方式中，两种表位都来自Hl血凝素、H3血凝素或H5血凝 素。然而，如上文所述，该第一和第二表位可能都是甲型流感病毒血凝素表位，但其来自具 有不同HA亚型的甲型流感病毒毒株（其中这两种表位还可能被相同的抗HA抗体所识别， 例如当两种HA亚型共有交叉反应性表位时）。
[0024] 在其中第一和第二表位都来自乙型流感病毒的实施方式中，理想情况下其都 是血凝素表位，且来自相同谱系中的乙型流感病毒毒株。例如，两种表位可以都来自B/ Victoria/2/87样谱系中的毒株，或者两种表位可以都来自B/Yamagata/16/88样谱系中的 毒株。
[0025] 在所有实施方式中，通常该第一表位和该第二表位来自相同的流感病毒毒株。在 一个特定的实施方式中，该第一表位和该第二表位是相同的表位。然而，在一些实施方式 中，该第一表位和该第二表位来自不同的流感病毒毒株，其可以是例如具有相同HA亚型的 甲型流感病毒毒株（如2x Hl毒株或2x H3毒株）或具有不同HA亚型的甲型流感病毒毒 株（如Hl毒株和H5毒株）。
[0026] 自复制RNA
[0027] 本发明的免疫原性组合物包含编码多肽的RNA组分，所述多肽包含来自流感病毒 抗原的表位（第二表位）。给予人后，该RNA在细胞内翻译以在原位提供流感病毒多肽。
[0028] 该RNA应为+_链，因而其无需任何干预性的复制步骤（例如逆转录）即可由细胞 翻译。有利地，其还可结合至免疫细胞表达的TLR7受体，由此启动佐剂效应。优选的+-链 RNA是自复制的。自复制RNA分子（复制子）即使在无任何蛋白质的情况下递送至脊椎动 物细胞时，能通过从其自身（通过从其自身产生的反义拷贝）转录而导致多种子RNA生成。 因此，自复制RNA分子通常是+-链分子，其可在递送至细胞之后直接翻译，而该翻译提供 RNA依赖性的RNA聚合酶，该酶随后由所述经递送的RNA生成反义转录本和正义转录本。因 此，递送的RNA导致生成多个子RNA。这些子RNA以及共线亚基因组转录本可以自身翻译以 提供编码的多肽的原位表达，或可转录以进一步提供与所递送RNA同义的转录本，其经翻 译提供多肽的原位表达。此转录序列的总体结果是引入的复制子RNA数量大幅扩增，因此 编码的多肽变为细胞的主要多肽产物。
[0029] 实现自复制的一种合适系统是使用基于a病毒的RNA复制子。这些+_链复制子 在递送至细胞之后翻译以得到复制酶（或复制酶-转录酶）。该复制酶被翻译成多聚蛋白， 其自动切割产生复制复合物，该复制复合物生成+_链经递送RNA的基因组链拷贝。这 些一-链转录本可自身转录以得到+_链亲本RNA的更多拷贝并产生编码该多肽的亚基因 组转录本。该亚基因组转录本的翻译因此导致感染的细胞原位表达多肽。合适的a病毒 复制子可采用来自辛德毕斯病毒、西门利克森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病 毒等的复制酶。可采用突变体或野生型病毒序列，例如，已用于复制子的VEEV减毒TC83突 变体（TO2005/113782)。
[0030] 因此优选的自复制RNA分子编码⑴可从自复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性 RNA聚合酶和（ii)感兴趣的多肽。该聚合酶可以是a病毒复制酶，例如包括a病毒蛋白 nsPl、nsP2、nsP3和nsP4中的一种或多种。
[0031] 虽然天然a病毒基因组除编码非结构复制酶多聚蛋白以外还编码结构病毒体蛋 白，但是本发明的自复制RNA分子优选不编码a病毒结构蛋白。因此，优选的自复制RNA 可导致细胞中产生其自身的基因组RNA拷贝，但不产生含RNA的病毒体。无法生成这些病 毒体说明，不同于野生型a病毒，自复制RNA分子自身不能以感染形式永存。野生型病毒 永存必需的a病毒结构蛋白在本发明的自复制RNA中缺失，且其位置被编码感兴趣的多肽 的基因占据，从而亚基因组转录本编码多肽而不是结构a病毒病毒体蛋白。
[0032] 因此，本发明可用的自复制RNA分子可具有两个开放阅读框。第一（5'）开放阅读 框编码复制酶；第二（3'）开放阅读框编码多肽。在一些实施方式中，该RNA可具有额外的 (例如，下游）开放阅读框用于例如编码其它多肽（见下文）或编码辅助多肽。
[0033]自复制RNA分子可具有与所编码复制酶相容的5'序列。
[0034] 该自复制RNA分子可源自或基于a病毒以外的病毒，具体而言是正链RNA病毒， 且特别是小RNA病毒、黄病毒、风瘆病毒、瘟病毒、丙型肝炎病毒、萼状病毒或冠状病毒。但 优选a病毒，且合适的野生型a病毒序列为人熟知并可从序列保藏机构如美国典型培养 物保藏中心（American Type Culture Collection)获得。合适a病毒的代表性示例包 括奥拉病毒（ATCC VR-368)、贝巴鲁病毒（ATCC VR-600、ATCC VR-1240)、犰狳病毒（ATCC VR-922)、基孔肯雅病毒（ATCC VR-64、ATCC VR-1241)、东方马脑脊髓炎病毒（Eastern equine encephalomyelitis virus) (ATCC VR-65、ATCC VR-1242)、摩根堡病毒（ATCC VR-924)、格塔病毒（ATCC VR-369、ATCC VR-1243)、克泽拉格齐病毒（ATCC VR-927)、马亚 罗（Mayaro) (ATCC VR-66)、马亚罗病毒（ATCC VR-1277)、米德尔堡病毒（Middleburg) (ATCC VR-370)、穆坎博病毒（ATCC VR-580、ATCC VR-1244)、恩杜姆病毒（Ndumu) (ATCC VR-371)、 皮春纳病毒（ATCC VR-372、ATCC VR-1245)、罗斯河病毒（ATCC VR-373、ATCC VR-1246)、 西门利克森林病毒（ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、辛德比斯病毒（ATCC VR-68、ATCC VR-1248)、托纳特（ATCC VR-925)、特里尼蒂病毒