（ATCC VR-469)、乌纳病毒（ATCC VR-374)、 委内瑞拉马脑脊髓炎病毒（ATCC VR-69、ATCC VR-923、ATCC VR-1250ATCC VR-1249、ATCC VR-532)、西马脑脊髓炎病毒（ATCC VR-70、ATCC VR-1251、ATCC VR-622、ATCC VR-1252)、沃 达罗河病毒（ATCC VR-926)和Y-62-33(ATCC VR-375)。包括来自多种不同a病毒的组分 的嵌合a病毒复制子也可以是有用的。
[0035] 自复制RNA分子可具有各种长度，但其通常长5000~25000个核苷酸，如8000~ 15000个核苷酸或9000~12000个核苷酸。因此，该RNA比siRNA递送中所见的要长。
[0036] 本发明可用的RNA分子可具有5'帽（例如7-甲基鸟苷）。该帽可增强RNA的体 内翻译。
[0037] 本发明可用的RNA分子的5'核苷酸可具有5'三磷酸基团。在加帽的RNA中，其 可通过5'-至-5'桥连接至7-甲基鸟苷。5'三磷酸可增强RIG-I结合并因而促进佐剂效 应。
[0038] RNA分子可具有3'聚A尾。其还可在其3'末端附近包括聚A聚合酶识别序列（如 AAUAAA)〇
[0039] 本发明可用的RNA分子通常为单链。单链RNA -般能通过与TLR7、TLR8、RNA解旋 酶和/或PKR结合来起始佐剂效应。以双链形式递送的RNA (dsRNA)可与TLR3结合，并且 该受体还可被单链RNA复制过程中形成或在单链RNA的二级结构中形成的dsRNA触发。
[0040] 本发明可用的RNA分子可通过体外转录（IVT)来方便地制备。IVT可使用（CDNA) 模板，其在细菌中以质粒形式产生和增殖或经合成（例如通过基因合成和/或聚合酶链式 反应（PCR)工程方法）产生。例如，可采用DNA依赖性RNA聚合酶（例如噬菌体T7、T3或 SP6RNA聚合酶）来从DNA模板转录RNA。可按需采用合适的加帽和聚A加成反应（尽管所 述复制子的聚A通常在DNA模板内编码）。这些RNA聚合酶可对转录的5'核苷酸有严格的 要求，且在一些实施方式中这些要求必须与所编码复制酶的要求匹配，以确保IVT-转录的 RNA能作为其自身编码复制酶的底物高效地发挥作用。
[0041] 如W02011/005799中所述，自复制RNA可包括（除任何5'帽结构以外）具有经修 饰核碱基的一个或多个核苷酸。例如，自复制RNA可包括一种或多种经修饰的嘧啶核碱基， 例如假尿苷和/或5-甲基胞苷残基。然而，在一些实施方式中，该RNA包含未经修饰的核 碱基，并可包含未经修饰的核苷酸，即，该RNA中所有核苷酸都是标准的A、C、G和U核糖核 苷酸（除了任何5'帽结构，其可包含7'-甲基鸟苷）。在其它实施方式中，该RNA可包括含 7-甲基鸟苷的5'帽，并且起始1、2或3个5'个核糖核苷酸可在核糖的2'位置被甲基化。
[0042] 本发明所用的RNA理想情况下仅包括核苷之间的磷酸二酯连接，但在一些实施方 式中，其可包含氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或甲基磷酸酯连接。
[0043] 该RNA编码包含来自流感病毒抗原的表位的多肽，如下文更详细描述的那样。该 RNA理想情况下编码包含流感病毒血凝素片段的多肽。其可编码可溶性胞质抗原，而非膜 连接或分泌的抗原（但细胞可在细胞表面上具有胞质抗原作为免疫加工的一部分）。多肽 的原位表达会引发抗流感免疫应答。例如，其可导致生成识别流感病毒颗粒的抗体，例如结 合病毒颗粒表面血凝素的抗体。理想情况下，引发的抗体是中和或保护性抗体。理想情况 下，由原位表达的多肽引发的抗体可免疫特异性结合该表达的多肽以及在本发明的免疫原 性组合物中递送的多肽。
[0044] 多肽组分
[0045] 本发明的免疫原性组合物包含多肽组分，且该多肽包含来自流感病毒抗原的表位 (第一表位）。
[0046] 该多肽组分可以是单个多肽，但也可以是多链多肽结构（如多肽复合物，例如由 两个或多个蛋白形成的复合物）、多亚基蛋白（如三亚基血凝素）或大多肽结构，如VLP (病 毒样颗粒）。类似地，该自复制RNA可编码超过一种流感病毒多肽，例如其可编码两种或多 种不同的多肽（其可彼此相连形成复合物），或者其可表达来自超过一种流感病毒毒株（例 如来自至少一种甲型流感病毒和至少一种乙型流感病毒）的多肽（如HA)。方便起见，理想 情况下自复制RNA表达五种或更少的多肽。
[0047] 理想情况下，组合物中的多肽（第一多肽）和由自复制RNA编码的多肽（第二多 肽）共有至少一个表位。其可共有许多表位，特别是当两个多肽较长（如长度超过80aa) 且各自包含多个表位时。
[0048] 在某些实施方式中，第一多肽和第二多肽共有至少2个、至少3个、至少4个或至 少5个共同的B细胞和/或T细胞表位。在某些实施方式中，第一和第二多肽共有至少一 个优势免疫表位。在某些实施方式中，第一和第二多肽抗原具有相同的优势免疫表位或相 同的主要优势免疫表位。
[0049] 通常，第一和第二多肽共有共同的氨基酸序列，例如第一和第二多肽是相同的，第 一多肽是第二多肽的片段，第二多肽是第一多肽的片段，第一多肽是核心流感序列与第一 融合伙伴的融合体且第二多肽是核心流感序列与第二融合伙伴的融合体，等。共有的氨基 酸序列理想情况下包含多个表位，且其可以是40个氨基酸或更长，例如大于等于60aa、大 于等于80aa、大于等于100aa、大于等于120aa、大于等于140aa、大于等于160aa、大于等于 180aa、大于等于200aa、大于等于220aa、大于等于240aa、大于等于260aa、大于等于280aa、 大于等于300aa、大于等于320aa、大于等于340aa、大于等于360aa、大于等于380aa、大于等 于400aa或更多。共有的氨基酸序列可包含完整的HAl血凝素亚基或其免疫原性片段。
[0050] 在一些实施方式中，第一和第二多肽彼此间具有至少x%氨基酸序列相同性，其中 X的值是80、85、90、92、94、95、96、97、98或99。如果一种多肽短于其他多肽，则应在较短多 肽的长度上计算序列相同性。两个氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比 较的两条序列中相同氨基酸的百分数。可以使用本领域已知的软件程序测定该比对和同源 性或序列相同性百分比。优选的比对通过史密斯-沃特曼（Smith-Waterman)同源性搜索 算法使用仿射缺口搜索确定，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。
[0051] 除流感来源的氨基酸序列外，该多肽还可包括额外的序列，如促进表达、生产、纯 化或检测的序列（例如聚His序列、标签等）。
[0052] 通常对该多肽进行分离或纯化。因此，其不与通常天然存在（若适用）的分子结 合。
[0053] 通常通过在重组宿主系统中表达来制备多肽。合适的重组宿主细胞包括例如， 昆虫细胞（如埃及伊蚊（Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica)、 家香蛾（Bombyx mori)、果幡（Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni))、哺乳动物细胞（如人、非人灵长类、 马、牛、羊、狗、猫和啮齿类（如仓鼠））、禽类细胞（如鸡、鸭和鹅）、细菌（如大肠杆菌 (E.coli)、枯草杆菌（Bacillus subtilis)和链球菌属（Streptococcus spp.))、酵母细 胞（如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌（Candida albicans)、麦芽 糖假丝酵母（Candida maltosa)、多形汉森酵母（Hansenual polymorpha)、脆壁克鲁维 酵母（Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis)、季也蒙毕 赤酵母（Pichia guillerimondii)、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母（Yarrowia Iipolytica))、四膜虫细胞 (如嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila))或其组合。本领域熟知许多合适的昆虫细 胞和哺乳动物细胞。合适的昆虫细胞包括例如，Sf9细胞、Sf21细胞、Tn5细胞、Schneider S2细胞和High Five细胞（源自亲本粉纹夜蛾BTI-TN-5B1-4细胞系的克隆分离物（英杰 公司（Invitrogen)))。合适的哺乳动物细胞包括例如，中华仓鼠卵巢（CHO)细胞、人胚胎 肾细胞（HEK293细胞，通常由剪切的腺病毒5型DNA转化成）、NIH-3T3细胞、293-T细胞、 Vero 细胞、HeLa 细胞、PERC. 6 细胞（ECACC 保藏号 96022940)、H印 G2 细胞、MRC-5 (ATCC CCL-171)、WI-38(ATCC CCL-75)、胎猕猴肺细胞（ATCC CL-160)、Madin-Darby 牛肾（"MDBK"） 细胞、Madin-Darby 狗肾（"MDCK"）细胞（如 MDCK (NBL2)、ATCC CCL34;或 MDCK 33016、DSM ACC 2219)、幼仓鼠肾（BHK)细胞如BHK21-F、HKCC细胞等。合适的禽类细胞包括例如，鸡 胚胎干细胞（如EBx?细胞）、鸡胚胎成纤维细胞、鸡胚胎生殖细胞、鸭细胞（例如Vaccine 27:4975-4982 (2009)和 W02005/042728 中描述的 AGEL CR 和 AGEL CR. pIX 细胞系）、EB66 细胞等。
[0054] 合适的昆虫细胞表达系统如杆状病毒系统为本领域技术人员已知，描述于例如 Summers和 Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555(1987)〇 杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法是以药盒的形式市售可得的。类似地，细菌和 哺乳动物细胞表达系统也是本领域已知的。
[0055] 可使用常规方法在合适的载体中制备编码多肽的重组构建体。昆虫或哺乳动物 细胞中用于重组蛋白表达的许多合适载体为本领域熟知且常用。合适的载体可含许多组 分，包括但不限于以下一种或多种：复制起点；可选的标记基因；一种或多种表达控制元件 如转录控制元件（如启动子、增强子、终止子），和/或一种或多种翻译信号；和选择的宿主 细胞（如哺乳动物起源的或来自异源哺乳动物或非哺乳动物物种）中用于靶向分泌途径 的信号序列或前导序列。例如，为了在昆虫细胞中表达，使用合适的杆状病毒表达载体如 PFastBac(英杰公司）生产重组杆状病毒颗粒。该杆状病毒颗粒经扩增，用于传染昆虫细胞 以表达重组蛋白。为了在哺乳动物细胞中表达，使用会驱动构建体在所需哺乳动物宿主细 胞（如中华仓鼠卵巢细胞）中表达的载体。
[0056] 多肽可使用任何合适方法进行纯化。例如，本领域已知通过免疫亲和层析纯化多 肽的方法。本领域已熟知纯化所需蛋白的合适方法，包括沉淀和各种类型的色谱如疏水相 互作用、离子交换、亲和、螯合和尺寸排阻。可用两种或更多这些或其它合适方法实现合适 的纯化方案。如果需要，该多肽可包括有助于纯化的"标签"，如表位标签或HIS标签。此类 带标签的多肽可通过螯合层析或亲和层析方便地从例如条件培养基中纯化。
[0057] 本发明中使用的多肽抗原可以是重组多肽，如Flublok?产品中观察到的那样。该 产品含有纯化的HA多肽，其表达于草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda) Sf9细胞来源的 连续昆虫细胞系中，生长于由化学限定的脂质、维生素、氨基酸和矿物盐组成的无血清培养 基中。该多肽经由杆状病毒载体（苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica)核多面体病病 毒）在该细胞系中表达，并随后使用曲通X-100?(叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）从细胞中 提取并通过柱色谱纯化。单次剂量的Flublok?产品含有45 y g HA/流感菌株，即135 y g/3 价剂量。其还含有氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和聚山梨酯20。
[0058] 作为一种使用在重组宿主系统中表达的多肽的有用替代方法，使用包含来自流感 病毒颗粒的血凝素的常规流感疫苗。因此，本发明可使用自复制RNA与常规流感疫苗，从而 改进后者。病毒颗粒来源的流感疫苗是基于活病毒或灭活病毒，且灭活疫苗可基于完整病 毒颗粒、"裂解"病毒颗粒或纯化的表面抗原。病毒颗粒来源的HA也可以病毒体的形式呈 递。本发明可使用所有这些类型的流感疫苗。病毒颗粒来源的流感疫苗组合物可以不含佐 剂或者可包含佐剂，例如水包油乳液，如含角鲨烯的乳液MF59和AS03。
[0059] 采用灭活病毒时，该含多肽组合物可包含全病毒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗 原（包括血凝素，且通常也包括神经氨酸酶）。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一 种或多种试剂处理：去污剂、甲醛、丙内酯、亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯（C60)、二元 乙胺、乙酰基乙烯亚胺或其组合。本领域已知病毒灭活的非化学方法，例如UV射线或Y