发明背景生物活性玻璃是已知的生物活性和生物相容性材料。生物活性玻璃作为能与骨键合，甚至化学键合在一起的骨填充材料已被研究几十年。最近发现的生物活性玻璃的优异特性使这些材料更加适合于这些应用。例如，一些生物活性玻璃以例如和的商品名进行销售。医学应用采用不同形式的生物活性玻璃，例如用于骨科和颅颌面骨腔填充以及骨重建的颗粒和片状物。生物活性玻璃用作骨移植替代材料的主要益处在于能够避免在继发性部位获得骨移植物。在一定的组成范围内，生物活性玻璃刺激骨生长，并显示抑制细菌生长的性质。为了使玻璃具有生物活性以及上述性质，玻璃必须可溶并具有一定的溶解速率和一定的组成。HenchL.在Bioactiveceramics:Theoryandclinicalapplications.Bioceramics1994；7:3-14中描述了组成与生物活性之间的关系，这给本领域技术人员提供了足够的方法来设计生物活性玻璃。影响玻璃颗粒的溶解速率和因此的总降解时间的一个因素是粒径，或者表面积与体积比(A/V)。换言之，颗粒越小并且A/V比越高，则溶解越快并且总降解时间越短。例如，可采用粒径范围为90-710μm的市售玻璃并且据称它可在不到一年的时间里溶于体内。以商品名称销售的玻璃S53P4的化学组成为53wt％的SiO2、23wt％的Na2O、20wt％的CaO和4wt％的P2O5，并且该玻璃的溶解明显慢于组成为45wt％的SiO2、24.5wt％的Na2O、24.5wt％的CaO和6wt％的P2O5的45S5玻璃。为了增加对生物活性玻璃的使用并扩大其手术治疗的范围，人们研制了可模制糊剂或油灰(putty)类型的组合物。在理想情况下，油灰制剂应该容易服用、操作并且可直接施用于骨缺损患者，而没有交叉污染、溢出或过量用药的风险。实际上，医生亲自配药，形成油灰，并用手指和/或药刀或类似工具填充骨腔。然而，由于例如操作过程中的污染风险，这种制剂具有很多实际的缺点，因此其不是患者或医生能够使用的最佳制剂。从US2008/0226688可知悉一种在商业上称为油灰的合成油灰/糊剂制剂。该文献描述了骨组织填充类型的糊剂或油灰，即适用于骨缺损部位的无菌可成形植入物组合物，其包含溶于载体水溶液中的生物活性玻璃颗粒。将生物活性玻璃颗粒以约68％至约76％(wt/wt)的浓度添加至粘性载体。载体包括浓度为24％至32％(wt/wt)的甘油和中分子量聚乙二醇(PEG)的混合物，混合物中甘油与聚乙二醇的比例为约45:55至约65:35。除了全合成骨组织填充油灰或糊剂，本领域已知并且广泛使用一些油灰或糊剂制剂形式的半合成混合物，例如，同种异体移植骨、脱矿骨基质和牛胶原蛋白/羟磷灰石的混合物。然而，这种同种异体移植物制剂具有很多缺点，其中最大的缺点是传播疾病的风险，并且该缺点永远无法完全排除。此外，假体关节(PJI)以及其他非生物植入物感染是医疗系统关注的重要问题，它也会给患者造成很多不便，例如住院时间延长、需要额外的具有较高并发症风险的外科手术以及长时间的抗菌治疗。虽然PJI的发生率相对较低(1-2％)，但与之相关的经济影响仍很巨大。由于很多微生物能够在假体材料上产生生物膜，在很多情况下这会导致治疗的高致死率。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、凝固酶阴性葡萄球菌(coagulasenegativestaphylococci)和革兰氏阴性杆菌(gram-negativerods)是PJI最常见的病原体。PJI发病机制的第一步是细菌细胞附着于植入物，随后形成生物膜基质。生物膜是基质包附的微生物种群，其特征在于微生物和非生物表面之间的细胞间附着力。生物膜形成是原核细胞周期的古老和完整组成并且是细菌在环境中生存的重要因素。生物膜相关感染的共同特征是它们对宿主免疫力、常规抗菌剂和杀菌剂的固有耐药性。已知生物膜结构中包附的细菌对抗生素的耐受水平实际上要比相应浮游生物形式的最低抑制浓度高10至1000倍。一般而言，与细菌感染相关的其他问题是细菌对抗生素产生耐药性的能力。这并不是一个最近才发现的现象，但是其是当今重要的健康问题。几十年来，引起常见感染的细菌对各种新抗生素产生了不同程度的耐药性，并且根据美国疾病预防控制中心和世界卫生组织(CenterforDiseaseControlandPreventionintheUSandtheWorldHealthOrganization)的统计，抗菌剂耐药性已经演变成全球健康威胁问题。实际上，当今由耐药细菌产生的感染太常见了，一些病原体甚至对多种类型或种类的抗生素产生耐药性。现今，大多数医院都遇到抗生素耐药性问题，据估计到2020年有70％的细菌会产生抗生素耐药性。BAGS53P4对从感染慢性骨髓炎的患者分离的甲氧西林耐药性(methicillinresistant)金黄色葡萄球菌(S.aureus)(MRSA)、甲氧西林耐药性表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(MRSE)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)和鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)的体外细菌生长抑制活性已被证实(DragoL,RomanòD,DeVecchiE等人，BioactiveglassBAG-S53P4fortheadjunctivetreatmentofchronicosteomyelitisofthelongbones.AninvitroandprospectiveclinicalstudyBMCInfect.Dis.10,13:584(2013))。然而，虽然人们已知该生物活性玻璃的小颗粒具有抗菌作用，但它们与实际使用的混合物的其他组分的相互作用尚不清楚。文献“Antibacterialeffectofbioactiveglassesonclinicallyimportantanaerobicbacteriainvitro”,J.Mat.Sc.:Mat.inMedicine,Vol19,no.2,10July2007公开了粒径等于或小于45微米的生物活性玻璃S53P4粉末具有良好的抗菌作用。本申请人的文献EP2322134公开了包含不同类型的聚乙二醇和生物活性玻璃球的可植入糊剂。然而，如下文所示，这些糊剂并不是抗菌剂。定义如果未另外规定，本申请中使用的术语与1987和1992年的生物材料共识会议保持一致，参见Williams,DF(编辑)：Definitionsinbiomaterials:ProceedingsofaconsensusconferenceoftheEuropeanSocietyforBiomaterials,Chester,England.March3-5,1986.Elsevier,Amsterdam1987和WilliamsDF,BlackJ,DohertyPJ.Secondconsensusconferenceondefinitionsinbiomaterials.In:DohertyPJ,WilliamsRL,WilliamsDF,LeeAJ(eds).Biomaterial-TissueInterfaces.Amsterdam:Elsevier,1992。在本申请中，生物活性材料是指设计用来诱发或调节生物活性的材料。生物活性材料往往是能够与哺乳动物组织化学键合的表面活性材料。本上下文中，术语可吸收是指当材料插入哺乳动物体内并且开始与生理学环境接触时，经长时间植入，材料崩解，即分解。尤其是，术语可吸收玻璃是指在与生理学环境接触时，在它的表面上并不形成羟基-碳酸盐磷灰石层的富含二氧化硅的玻璃。可吸收玻璃通过再吸收从体内消失并且在它的分解过程中并不显著激活细胞或细胞生长。生物材料是指意图与生物系统连接以评价、治疗、扩增或代替身体的任何组织、器官或功能的材料。生物相容性是指医疗器械中使用的材料通过在特定部位产生适当的宿主反应而安全、适当地运行的能力。再吸收是指生物材料由于单纯的溶解而分解的过程。复合材料是指包含至少两种不同成分的材料，例如有机聚合物和诸如玻璃的陶瓷材料。发明目的和概述本发明的目的是提供可用作骨组织填充物的组合物，其操作简单、安全并且具有骨填充效果所期望的性质，同时具有抗菌性。本发明的另一个目的是提供用于预防在植入物表面上形成生物膜的组合物。因此，本发明的一个目的也是提供用于植入手术以预防局部感染的材料。本发明的再一个目的是提供细菌不能产生耐药性的材料。本发明涉及可植入糊剂，其包含具有0.5-45μm的粒度分布的生物活性玻璃颗粒和具有100-4000μm的粒度分布的生物活性玻璃颗粒。生物活性玻璃的组成为45-55wt％的SiO2、20-25wt％的Na2O、18-25wt％的CaO和3-6wt％的P2O5。糊剂还包含具有200-700g/mol的分子量的低分子量聚乙二醇、具有700-2500g/mol的分子量的中分子量聚乙二醇、具有2500-8000g/mol的分子量的高分子量聚乙二醇和甘油，条件是低分子量聚乙二醇和中分子量聚乙二醇的分子量彼此相差至少80g/mol且中分子量聚乙二醇和高分子量聚乙二醇的分子量彼此相差至少300g/mol。本发明还涉及本发明的糊剂在制备用于骨形成的植入物中的用途。本发明还涉及本发明的糊剂在包覆植入物中的用途。本发明还涉及用本发明的糊剂包覆的植入物。发明详述本发明涉及可植入糊剂，其包含(a)具有0.5-45μm的粒度分布的生物活性玻璃粉末，(b)具有100-4000μm的粒度分布的生物活性玻璃颗粒，(c)具有200-700g/mol的分子量的低分子量聚乙二醇，(d)具有700-2500g/mol的分子量的中分子量聚乙二醇，(e)具有2500-8000g/mol的分子量的高分子量聚乙二醇，以及(f)甘油，其中，生物活性玻璃的组成为45-55wt％的SiO2、20-25wt％的Na2O、18-25wt％的CaO和3-6wt％的P2O5，条件是低分子量聚乙二醇和中分子量聚乙二醇的分子量彼此相差至少80g/mol且中分子量聚乙二醇和高分子量聚乙二醇的分子量彼此相差至少300g/mol。因此，本发明提供了具有骨引导、生物活性、抗菌性和可模制性的组合物。糊剂包含在粘性有机载体溶液或基质中的生物活性玻璃颗粒。因此，糊剂包含与合成粘合剂混合的钙-磷-钠-硅酸盐颗粒，合成粘合剂包含充当颗粒的临时粘合剂的聚乙二醇。通常，以预混合粘结材料形式提供颗粒和粘合剂。在植入时，粘合剂被吸收以允许颗粒之间的组织浸润和允许与颗粒结合的骨的正常愈合过程(生物活性玻璃的再吸收和骨再生)。如果粘合剂在植入之后立即被吸收，其只留下生物活性玻璃颗粒。所有这些组分是医学、制药学和化妆品领域以及食品和饮料领域熟知、广泛使用和可接受的。因此，本发明及其各个实施方案即使不能全部实现，但可实现至少部分上述目的。实际上，当小的生物活性颗粒的粉末与聚乙二醇的混合物组合时，生成的材料具有出人意料的抗菌作用，同时改善骨长入(ingrowth)。专利EP2322134公开了类似的组合物，其包含生物活性玻璃小球和不同聚乙二醇(低、中和高分子量PEG)的混合物。然而，人们观察到，这种组合物由于其中生物活性玻璃为生物活性玻璃而不具有明显的抗菌作用。另一方面，已证实单独的生物活性玻璃甚至对抗生素耐药性细菌具有抗菌作用，该抗菌作用与其粒径无关。然而，小的生物活性颗粒的粉末(平均直径小于45μm)同样不能结合在哺乳动物组织中(即，单独地)，因为其反应速率太高并甚至可能是危险的。由于它的反应速率太高，因此它也不会促进骨生长。当与类似粒径的生物活性玻璃粉末相比时，本发明的包含聚乙二醇的材料具有另外的优点，即它可通过管子进行应用，这也允许它用于微创手术。该材料是粘性的，因此相比于能自由流动的干粉，它能以可控、渐进的方式填充缺损部位。因此，它还能控制糊剂均匀分布在缺损部位。还可将小粒径粉末与较大颗粒形式的生物活性玻璃组合，这对材料的流动性质及其骨长入性质有影响。还可调整聚乙二醇的选择以满足流动性质的要求。在本说明书中，缩写wt％代表重量百分比，并且通常以总重量的重量百分比形式表示。分子量是指平均分子重量，这里是指数均分子量，并且以g/mol的形式表示。通过过筛确定生物活性玻璃颗粒的粒度分布。关于颗粒，它是指除了球形之外的具有任何规则或不规则形状的颗粒。生物活性玻璃的粉末也由颗粒制成。根据优选的实施方案，糊剂还包括(g)治疗活性剂。根据一个实施方案，生物活性玻璃颗粒具有500-800μm的粒度分布。根据另一个实施方案，生物活性玻璃颗粒具有100-350μm的粒度分布。根据另一个实施方案，生物活性玻璃颗粒具有315-500μm的粒度分布。根据另一个实施方案，生物活性玻璃颗粒具有1000-2000μm的粒度分布。例如，组合物可包含粉末形式的生物活性玻璃且颗粒具有315-500μm的粒度分布。例如，这种组合物可用于牙科手术。另一种可能的组合物是粉末和具有500-800μm的粒度分布的颗粒的组合。该组合物可用于颅颌面手术和手部手术。其他可能的组合是具有1000-2000μm的粒度分布的颗粒的粉末。该组合物可用于整形外科手术、创伤手术和脊椎手术。因此，组合物可包含粉末即具有1-44μm的粒度分布的颗粒形式的生物活性玻璃。例如，粒度分布可为1、5、10、15、20、25、30、35或40μm至至多5、10、15、20、25、30、35、40或45μm。组合物另外包括较大的颗粒，例如，其可具有100-350μm或100-200μm或150-250μm或200-300μm或250-350μm的粒度分布。例如，这些较大颗粒的粒度分布还可为315-500μm或350-500μm或400-500μm。例如，较大颗粒的粒度分布甚至还可为500-800μm或500-700μm或550-800μm或600-800μm或650-750μm。例如，在一些实施方案中，粒度分布还可为1000-2000μm或1000-1500μm或1300-1800μm或1500-2000μm或2000-3150μm。通过过筛确定玻璃颗粒的粒度分布。例如，玻璃颗粒的粒度分布还可为100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2900、3000或3150μm至至多150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2900、3000、3100、3150、3200、3300、3400、3450、3550、3600、3700、3800、3900或4000μm。聚乙二醇(PEG)，还称为聚氧化乙烯，包含重复单元(-CH2CH2O-)，并通过向包含反应性氢原子的化合物逐步添加氧化乙烯来制备。通过向乙二醇添加氧化乙烯以产生双官能聚乙烯结构HO(CH2CH2O)nH来制备聚乙二醇，其中取决于聚乙二醇的分子量，n为不同大小的整数。本发明中使用的聚乙二醇通常是线性聚乙二醇，即具有100至8000g/mol的分子量。也可使用支化和星形聚乙二醇以降低或进一步调整糊剂的粘度。通常将聚乙二醇命名为带数字的PEG，数字表示以g/mol计的平均分子量。因此，PEG400是指具有400g/mol的平均分子量的聚乙二醇且PEG2000是指具有2000g/mol的平均分子量的聚乙二醇。使用聚乙二醇(PEG)以通过粘合和润湿生物活性玻璃颗粒来形成糊剂样材料。为了获得合适粘度的糊剂，应将至少两种PEG混合在一起。当选择适当分子量的PEG时，应该牢记低分子量(<600g/mol)的PEG在室温下为液体，而高分子量PEG为蜡状或固体。为了使糊剂在其使用温度(室温和体温)保持糊剂样，通常应在高温下将至少三种PEG混合在一起。由于高分子量PEG是晶体物质，因此它们的使用将提高糊剂使用温度的上限并且增加糊剂的粘度、防止在储存过程中生物活性玻璃颗粒在室温下的沉降。为了降低使用温度的下限，即扩大使用温度范围，可使用低分子量PEG来避免凝固(即糊剂在较低温度下的硬化)，因为高分子量PEG在低温下倾向于结晶。如果只使用一种分子量的蜡状或固体PEG，则实际应用的使用温度将太狭窄。PEG600(即，平均分子量为600g/mol的聚乙二醇)显示约17至22℃的熔程，因此它在室温下可能是液体，但在较低环境温度下是糊状；而具有800至2000的平均分子量的PEG为具有低熔程的糊状物质。大于3000的分子量的聚乙二醇通常为固体。甘油，即丙烷-1,2,3-三醇，通常称为甘油或丙三醇。它是无色、无味、粘性液体并广泛用于药物制剂。由于PEG和甘油之间的物理相互作用，可将甘油添加至糊剂以改善其光滑度，并且通过增强热性质和粘性可进一步提供润滑作用。PEG和甘油彼此相容。PEG400能以各种比例混溶于甘油，但PEG在甘油中的溶解能力和溶解度随其摩尔质量增加而降低。然而，通过适当加热可改善上述两种性质，并且在室温下溶于PEG400的物质能以大致相同的程度溶于熔融的PEG4000中(即，在60-70℃的温度下)。根据本发明的一个实施方案，生物活性玻璃的总量为糊剂的总重量的50-80wt％。在糊剂中，具有0.5-45μm的粒度分布的生物活性玻璃颗粒(a)的量为生物活性玻璃的总重量的10-30wt％且具有100-4000μm的粒度分布的生物活性玻璃颗粒(b)的量为生物活性玻璃的总重量的90-70wt％。优选地，聚乙二醇的总量为糊剂的总重量的20-50wt％。例如，低分子量PEG(c)的量为2-15wt％且中分子量PEG(d)的量为糊剂的总重量的8-48wt％。高分子量PEG(e)的量为糊剂的总重量的1-10wt％。在使用甘油的实施方案中，它的量多达糊剂的总重量的10wt％。一些合适的糊剂具有下列组成：-PEG(c+d+e)23-45wt％，-甘油(f)0-10wt％以及-生物活性玻璃(a+b)55-67wt％。一些优选的糊剂具有下列组成范围：根据本发明的一个实施方案，治疗活性剂(g)的量为糊剂总重量的至多30wt％。治疗活性剂可选自生长因子、蛋白质、肽、抗生素、黏多糖即透明质酸、非人源干细胞(即，不包括人干细胞)、过氧化物及其混合物；并且其可用于促进骨生长或者具有进一步的抗微生物作用，例如抗菌作用。然而，应注意在没有抗生素的情况下本材料也有效。在本发明的一个实施方案中，生物活性玻璃的组成为45-54wt％的SiO2、22-25wt％的Na2O、19-25wt％的CaO和3.5-6wt％的P2O5。在本发明的另一个实施方案中，生物活性玻璃的组成为53wt％的SiO2、23wt％的Na2O、20wt％的CaO和4wt％的P2O5。这种生物活性玻璃也称为S53P4并以商品名称出售。该实施方案提供了快速体内溶解的粘合剂组合物，其允许与S53P4颗粒(生物活性玻璃的再吸收和骨再生)和粉末缔合的骨的正常愈合过程。由于S53P4生物活性玻璃的溶解速率慢及其化学组成和粒径，自然地实现了长期骨生长效果。根据另一个实施方案，生物活性玻璃的组成为45wt％的SiO2、24.5wt％的Na2O、24.5wt％的CaO和6wt％的P2O5。该生物活性玻璃也称为45S5并以商品名称出售。包含在上述范围的端点值的所有成分的糊剂不一定提供最佳的流动性质和产品性质。例如，结合高浓度的高分子量PEG而不含足够的低分子量PEG和/或甘油可提供高粘性产品，这种产品不适合在室温或体温下注射。然而，针对每组的期望性质，本领域技术人员通过一些简单实验能够计算出各成分的理想比例。合适组合的一些实例也在下面实验部分中给出。本发明还提供了制备具有抗菌性质的可模制骨组织填充糊剂的方法，该方法包括在受控条件下熔化和混合原材料，以及冷却、包装和条件化最终的产品。通常，在保护气体或真空条件下或者在大气条件中，在25至95℃的温度下，通过在间歇式混合器中将各成分混合和/或熔融在一起5至60min来制备糊剂。然后，将混合物冷却至25-45℃，转移至涂药器和/或储存备用。可备选地，可通过使用任何类型的混合设备来实施混合、熔融和/或转移，所述混合设备例如开口或封闭的间歇式混合器、连续搅拌罐反应器或混合器、挤出机、注塑成型机、管式反应器或本领域已知的其他标准熔融加工或熔融混合设备。本发明还提供了本发明的糊剂在制备如在骨缺损部位用于骨形成的植入物中的用途，即用作骨组织填充糊剂。本发明还提供了本发明的糊剂用于包覆植入物的用途。实际上，已确定本发明的糊剂具有预防和治疗在植入物表面上形成生物膜的能力。它也能用于治疗生物膜相关的假体感染，因为它对大多数假体感染的细菌问题都有抗菌功效。此外，根据本说明书的糊剂可用于处理伤口，其中糊剂被敷在开放性伤口上并覆盖伤口。本发明还提供了使用本发明的糊剂包覆的植入物。植入物可为例如髋关节植入物、膝盖植入物或任何其他假体关节，或融合到哺乳动物体内的任何其他植入物。在植入到人类或动物体内之前，使用本发明的糊剂来包覆植入物。此外，本发明提供了抗菌骨生长促进组合物，其包含上述具有活性剂的制剂。活性剂可为用于人类或动物的任何药物活性剂。现在，在下面实验部分中更详细地描述本发明的不同实施方案。实验部分油灰的一般制备方法使用100RPM(转数每分钟)混合速度将甘油和PEG400加入至热反应器(60℃)，随后加入PEG1500和PEG3000。PEG由Clariant提供，甘油由Uniqema或Sigma-Aldrich提供。将生物活性玻璃的颗粒加入至熔融混合物，混合直至混合物均匀。在搅拌下将获得的油灰冷却至室温(RT)，从容器卸料、包装、储存在干燥器中以备用和测试。参考生物活性玻璃的抗菌活性如下测试本说明书描述的单独的和具有基质的生物活性玻璃的杀菌能力，该测试作为比较实施例。测试中使用的细菌在表1中列出。MetR代表甲氧西林耐药。测试的各种玻璃在表2中列出。如上所述，玻璃S53P4和玻璃具有相同组成。油灰组成PEG代表聚乙二醇，其后面的数字表示以g/mol计的平均分子量。对于油灰，使用甘油、PEG400、PEG1500和PEG3000的相同混合物(即，糊剂样粘合剂)作为参考样品油灰1至油灰6。表1.菌株表2.测试的产品、对照和参考材料用表皮葡萄球菌和绿脓杆菌测试组合物油灰1至油灰6，针对表1中列出的所有菌株，测试所有其他组合物。体外测试(比较实施例1-4、11-14)将细菌和不同产品一起在无菌胰蛋白胨大豆肉汤(TSB，包含酪蛋白的酶消化物、大豆粕的酶消化物、氯化钠、磷酸氢二钾和葡萄糖)中孵育(5ml无菌试管，BectonDickinson)。研究中使用的产品浓度在表3中列出。将颗粒、参考材料和对照称重(MettlerAE50)并与2ml的TSB适当混合。除了油灰产品的六个复制品之外，将各个产品的三个复制品称重。将油灰产品的三个复制品在室温下孵育2小时，之后将具有溶解聚合物的TSB替换成新的2mlTSB批次。最后，将细菌接种体(通过光密度测定法测定已知量，ThermoGeneSys20)加入至混合物。没有添加产品和纯TSB的细菌培养物用作对照。S53P4粉末用作阳性对照，因为从早期研究可知浓度为100mg/ml的粉末足以有效抑制细菌。所包含的Iittala玻璃和磷酸三钙(TCP)用作参考材料。在研究前，将惰性Iittala非生物活性玻璃研磨成小颗粒(精确粒径未限定)。表3.研究中使用的产品浓度使用商业、固体血琼脂平板(具有5％羊血的胰酪胨大豆琼脂II，BectonDickinson)来评价用不同产品孵育的细菌悬浮液的生存力(viability)。在连续24h培养点，直接从悬浮液中取出10μL样品制板(如在VuorenojaK,JalavaJ,LindholmL.等人(2011)DetectionofStreptococcuspneumoniaecarriagebytheBinaxNOWtestwithnasalandnasopharyngealswabsinyoungchildren.EurJClinMicrobialInfect.EPubPMID:21800217中描述的)。此外，将样品的1:10000稀释物的一个复制品和细菌对照制板以确保可量化的单菌落形成。在琼脂板上培养(+37℃，16h)后，通过与对照样品比较，评价细菌的生长。在板上没有生长是给定产品能够防止细菌定植能力的指示。除了绿脓杆菌培养5天时间之外，将体外培养实施7天时间，不能超过上述培养时间，否则会形成黏液，妨碍10μL样品的精确采集。使用pH试纸(pH范围7.5-14MerckAlkalit81.09532和范围6.4-8.0Nacherey-Nagel，REF90210)估算试管中样品的pH。将一片试纸浸入培养基，之后通过将试纸颜色与制造商提供的比色卡(scale)进行比较来估算pH值。分别在培养金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌8天之后、在培养MRSA7天之后和在培养绿脓杆菌5天之后估算pH。体外测试(比较实施例5-10)使用一个表皮葡萄球菌菌株和一个绿脓杆菌菌株。在37℃，通过在生长培养基中将各个产品(最终浓度400mg/ml)孵育48小时实现条件化。按一定时间间隔检测pH值。认为pH值等于或大于10提示最佳条件化。通过杀菌曲线评价抗菌活性。在含有条件致病菌(conditionedproducts)的试管中接种细菌悬浮液的等分。在单独的生长培养基中实施生长对照的细菌接种。在37℃，在有氧环境中孵育试管。在孵育0、24、48和72小时之后，通过在琼脂板上将适当稀释的细菌悬浮液制板，并将其在37℃孵育24小时来实施微生物计数。参考材料的结果(比较实施例)比较实施例1-4、11-14制板后，阴性对照给出大量的一致性结果。这能够在所有菌株和所有时间点观察到，表明细菌在整个研究期间可存活。没有接种体的纯TSB用作对照，以表明实施的所有研究工作是无菌的。在任何时间点，纯TSB中都没有细菌生长。测试的所有颗粒产品(单独的)都影响细菌生长。产生效果所需的时间和水平依赖粒径而变化。效果还随细菌种类而变化。过筛至<45μm的粒径的粉末能够抵抗所有所研究的细菌的生长。油灰产品不影响所研究的任何病原体的生长。表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌MetR和绿脓杆菌的结果显示在测试中期几乎没有效果，而油灰对金黄色葡萄球菌ATCC29213没有效果。在测试期间，每日均有变化。在测试末期，纯聚合物(油灰粘合剂)对表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌MetR有一些影响，但每日的生长情况均有变化。无论何时，TCP对革兰氏阴性绿脓杆菌都没有影响；在测试末期，它对金黄色葡萄球菌ATCC29213也没有影响。观察到对两种其他革兰氏阳性球菌有轻微影响。因此，可以得出结论，在该测试期间，油灰产品不能够预防四种临床上重要的病原体的定植。油灰和聚合物的每日变化和波动(shifty)结果可至少部分地通过所使用的体外测试设置来解释。此外，聚合物的物理和化学特性可能对移液质量有一定影响。细菌生长的所有结果在表4-7中列出。列出的数字表示细菌对照和用样品孵育的细菌之间的差值(log10)(0＝与细菌对照没有差值，1＝与细菌对照的log10差值，5是大于4logs的差值)，0是指不抑制细菌生长。表4.表皮葡萄球菌(S.epidermidis)表5金黄色葡萄球菌(S.aureus)表6金黄色葡萄球菌(S.aureus)MetR表7.绿脓杆菌(P.aeruginosa)表8概述了孵育末期(表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌为8天、金黄色葡萄球菌MetR为7天、绿脓杆菌为5天)的pH值。表8.pH值比较实施例5-10比较实施例5-10的结果在表9中示出。油灰组合物显示轻微的pH变化(pH8)，但对金黄色葡萄球菌或绿脓杆菌都没有抗菌作用。表9.比较实施例5-10的结果根据本发明的糊剂的抗菌活性测试具有表10所示的组成的糊剂(组合物1)的抗菌活性。参考样品为上述伽马灭菌的粒径(fractionsize)小于45μm的生物活性玻璃粉末(组合物2)和具有500-800μm的粒径的生物活性玻璃颗粒(组合物3)。类似尺寸的惰性玻璃的三个样品(R1350Iittala透明、Iittala、Finland)用作阴性对照：表9所示的具有PEG和甘油的<45μm的颗粒(参考1)、<45μm的颗粒(参考2)和500-800μm的颗粒(参考3)。在胰酪胨大豆培养基(TSB；Biomerieux,Marcyl’Etoile,France)中制备最终浓度为400mg/ml(相应于5％的临床操作溶液)的所有样品，并将4.8ml的每个溶液放置在无菌6孔聚苯乙烯微孔板中(JetBiofil；Guangzhou,China)。在37℃孵育生物活性玻璃样品，组合物1孵育4小时、组合物2孵育7小时且组合物3孵育24小时。用pH计检测一定时间间隔的pH值以确定提议条件化的离子释放和pH变化。认为pH值等于或大于11提示最佳条件化。如果达到最佳条件化，就开始使用各个孔的内含物。表10.测试的本发明糊剂的组成材料量(g)甘油16PEG40012.8PEG150025.6PEG30009.6S53P4颗粒，500-800μm76.8S53P4粉末，<45μm19.2使用一个甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌菌株和一个绿脓杆菌菌株，它们是在IRCCSGaleazzi整形外科研究所的微生物学实验室，从患者的感染膝盖假体分离而得，患者的感染膝盖假体源自相同研究所针对植入物翻修的骨关节感染重建手术中心(C.R.I.O.)。选择这些菌株是因为它们具有能在体外的假体材料上产生生物膜的强大功能。直径为25mm、厚度为5mm的无菌喷砂钛盘(AdlerOrtho,Cormano(Milan),Italy；BATCHJ04051)用作生物膜形成和生长的底物。将金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的过夜培养物以1.0×108CFU/ml的最终密度再悬浮于TSB中并在包含钛盘和4.8ml新鲜TSB的6孔聚苯乙烯微孔板中将每个操作溶液的等分(200μl)接种。在37℃有氧孵育24h之后，去除包含非粘附性细菌的耗尽生长培养基，并用5ml的新鲜培养基替换。将板孵育另外48h以获得成熟的生物膜，然后使用无菌盐水洗涤三次去除可能存在的培养基和剩余的非粘附性细菌。在条件化时间之后，将细菌生物膜覆盖的钛盘放入包含条件生物玻璃或阴性对照(惰性玻璃)的新无菌6孔聚苯乙烯微孔板。在孵育24、48和72小时之后评价每个钛盘上的生物膜的量。结晶紫测定结晶紫测定用作初步试验以评价对抗金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌生物膜应使用的S53P4玻璃的最佳配方和最佳孵育时间。为评价测试的玻璃对生物膜结构的影响，根据Christensen等人(ChristensenGD,SimpsonWA,YoungerJJ等人，Adherenceofcoagulase-negativestaphylococcitoplastictissuecultureplates:aquantitativemodelfortheadherenceofstaphylococcitomedicaldevices.J.Clin.Microbiol.22(6),996-1006(1985))的描述进行处理之后检测每个盘上存在的整个生物质。在孵育末期，将钛盘上生长的生物膜风干并通过将盘浸入5％结晶紫溶液15分钟来进行染色。然后，在洗涤几次之后，将盘再次风干，放入3ml的96％乙醇中以洗脱附着于生物膜的结晶紫。将每个乙醇-染料溶液的三个等分(100μl)放入96多孔板，并用微孔板酶标仪(MultiskanFC,ThermoScientific；Milan,Italy)读取595nm下的吸光度，每个盘重复三次。统计学分析将结晶紫测定法检测的生物膜数量表示为平均值±SD。根据情况，通过双因素方差(TwowayANOVA)分析，随后采用Bonferronit-试验和学生t-试验(Student’st-test)实施统计学分析。将P值的显著性极限设置在小于0.05。结果S53P4的抗生物膜活性，即两种细菌在595nm的吸光度值，在表11和12中示出。S53P4处理的盘和惰性玻璃处理的盘(对照)在处理后，所有钛盘上存在的生物膜的量有显著性差异(P<0.05)。虽然生物活性玻璃的暴露时间似乎并不显著影响生物膜的量，但相比于处理24和48小时之后，处理72小时之后观察到生物膜的量减少。在测试的三种制剂中，S53P4的抗生物膜活性没有显著性差异。表11.金黄色葡萄球菌(S.aureus)MetR在595nm的吸光度表12.绿脓杆菌(P.aeruginosa)在595nm的吸光度绿脓杆菌24小时48小时72小时组合物11.60.80.7组合物21.50.70.5组合物31.50.70.4参考13.53.83.9参考23.43.73.9参考33.23.73.8因此，结果显示，不论生物活性玻璃自身是否具有抗菌活性，在将其与乙二醇和PEG混合时，它并没有抗菌作用，除非其以具有0.5-45μm的粒度分布的粉末形式来使用。因此，EP2322134教导与该种类的生物活性玻璃粉末具有抗菌活性的事实的组合对于本领域技术人员而言并不是显而易见的，因为生物活性玻璃的这种形式(即，粉末)是其具有出人意料的效果的唯一形式。当前第1页1 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