用HER3靶向纳米粒子靶向曲妥珠单抗抗性HER2+乳腺癌的制作方法

本申请要求由LaliK.MEDINA-KAUWE等人于2014年4月4日提交并且标题为“TARGETINGTRASTUZUMABRESISTANTHER2+BREASTCANCERWITHAHER3-TARGETINGNANOPARTICLE”的美国临时申请序列号61/975,687的优先权，该临时申请的全部公开内容以引用的方式并入本文中，包括图式。序列表本申请含有序列表，其已经由EFS-Web以ASCII格式提交并且以全文引用的方式并入本文中。所述ASCII副本创建于2015年4月4日，命名为EOS006PCT_SEQLISTING.txt，并且大小为17千字节。政府权力本文所公开的主题是在政府支持下根据由国家卫生研究所/国家癌症协会(NationalInstitutesofHealth/NationalCancerInstitute)授予的授权NIH/NCIR01CA140995和NIH/NCIR01CA129822而完成。美国政府具有所公开主题中的某些权利。发明领域本发明属于治疗剂领域，并且更具体地说属于治疗癌症的领域。本公开的背景众所周知HER家族受体(例如HER1(EGFR)、HER2、HER3以及HER4受体)在细胞中的过表达导致细胞中的强而恒定的增殖性信号传导，这最终导致发生某些类型的癌症，例如乳腺癌。HER2-阳性乳腺癌代表几乎1/4的侵袭性乳腺癌并且指示不良患者存活。曲妥珠单抗(Trastuzumab)为干扰HER2/neu受体的单克隆抗体。其当前以若干商标名出售，诸如其用于治疗某些乳腺癌。帕妥珠单抗(Pertuzumab)为用于癌症治疗中的另一单克隆抗HER2抗体。拉帕替尼(Lapatinib)为在乳腺癌中发挥治疗作用的小分子有机化合物。这些治疗通常在其他治疗方案失败之后用作针对癌症的最后一道防御。不幸地，虽然许多HER2-阳性乳腺癌患者最初对这些抗HER2治疗起反应，但是其中相当一部分对这些治疗产生抗性。一旦对晚期治疗剂产生抗性，治疗选择实际上变得非常少。因此，对研制针对对这些治疗不具反应性或已变得具抗性这些HER2+肿瘤有效的新药存在极大的需要。发明概述本文公开治疗患者的癌症的方法，所述方法包括鉴别对用抗HER2治疗进行治疗具抗性的患者；以及向所述患者施用药物递送分子，所述药物递送分子包含适合于靶向和/或穿透一种细胞类型的多肽分子；经由静电相互作用与所述多肽序列结合的核酸分子；以及与所述核酸序列非共价连接的化学剂。还公开诱导抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞凋亡的方法，所述方法包括使所述抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞与所述药物递送分子接触。本文进一步公开治疗患者的癌症的方法，所述方法包括鉴别对抗HER2治疗具抗性的患者；以及向所述患者施用治疗有效量的药物递送分子，所述药物递送分子包含适合于靶向和/或穿透一种细胞类型的多肽分子；以及与所述多肽序列结合的磺化咔咯分子。最后，本文公开诱导抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞凋亡的方法，所述方法包括使抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞与药物递送分子接触，所述药物递送分子包含适合于靶向和/或穿透一种细胞类型的多肽分子；以及与多肽序列结合的磺化咔咯分子。附图简述图1说明根据本发明的一个实施方案的递送系统。图2说明根据本发明的一个实施方案被配置成用于将Dox递送至HER2+乳腺癌细胞的递送系统。步骤(1)说明在细菌中以重组融合蛋白形式产生并纯化的HERPBK10。步骤(2)说明通过非共价嵌插相互作用形成的DNA-Dox。步骤(3)说明DNA-Dox通过非共价电荷相互作用结合HerPBK10(阴离子DNA磷酸盐亲电结合阳离子聚赖氨酸)。图3说明根据本发明的一个实施方案被配置成用于将Dox递送至HER2+乳腺癌细胞的递送系统的操作的示意图，所述操作包括(1)受体在细胞膜处的结合，(2)复合物的内化，(3)经由嵌插相互作用与dsDNA非共价键结的化学治疗剂(Dox)的胞质释放，以及(4)化学治疗剂和dsDNA进入核。图4(A)说明在DNA-Dox组装期间滤液中的相对Dox。将通过将互补30bp寡核苷酸退火制备的ds-寡核苷酸在室温下以1:16摩尔比DNA:Dox与Dox一起温育一个小时。游离Dox是通过经10MW截止离心柱过滤来移除。在第一次Dox移除旋转(洗涤1)之后，再将过滤器用HEPES缓冲盐水(HBS)洗涤4次(洗涤2-5)。图4(B)说明在DNA-Dox组装期间滤液和截留物的UV/V吸光度。图5说明HerDox组装。将DNA-Dox以9:1摩尔比HerPBK10:DNA-Dox与HerPBK10在冰上一起温育2h。对混合物进行尺寸排阻HPLC，并且在6-10分钟时收集用于SDS-PAGE和免疫墨点分析的级分。收集6min峰的HerDox。HerDox中的Dox浓度是通过在480nm(Dox吸收波长)下测量吸光度来评估。HerDox级分1-5的HPLC纯化对应于在6-10分钟时所收集的样品。还使用用于鉴别HerPBK10的五邻体基底抗体来展示级分1-5的免疫墨点。图6(A)说明在不同储存条件下或在血清中的缀合物稳定性。将HerDox在4℃、室温或37℃下温育长达12天。每隔一天将样品通过超滤离心柱过滤。在480nm下测量截留物和滤液吸光度，以分别测定相对Dox截留率或从缀合物中的释放。图6(B)模拟HerDox长期暴露于培养基中的细胞。将固定在Ni-NTA珠粒上的HerDox与牛血清在DMEM中在37℃下一起温育所指示的时间，然后使各样品沉淀。在480nm下测量上清液(滤液)和珠粒洗出液(截留物)的吸光度以检测Dox。将血清中的相对Dox释放或截留率以针对对照(缺少血清的对应样品)正规化的形式来表示。每个时间点N＝3。样品与对照相比较的T检验(P<0.05)显示无显著差异。图7说明靶向毒性。使各细胞系在37℃下在完全(即含血清)培养基中暴露于rHerDox(0.5μMDox浓度)、单独Dox(0.5μM)或单独HerPBK104小时，随后吸出以移除游离缀合物，并且添加新鲜培养基，同时使细胞继续生长。细胞效价是通过代谢(即MTT)分析来测定。图7上部图说明HerDox对MDA-MB-231(HER2-)和MDA-MB-435(HER2+)细胞存活率的影响。相对存活细胞数目是以占对应的未处理细胞的百分比来表示。图7下部图说明HerDox、单独Dox或单独HerPBK10关于HER2-和HER2+细胞存活率的比较。示出治疗第3天的相对存活率(呈占未处理细胞的百分比形式)。图8说明受体特异性。将MDA-MB-435(HER2+)细胞与游离配体(eHRG)以HerDox10倍摩尔过量在4℃下一起温育一个小时。将培养基吸出以移除游离eHRG并且将含有HerDox(0.5μM)的新鲜培养基添加到细胞中。细胞存活率是通过MTT测量并且以占相对未处理细胞数目的％来表示。图9(A)说明混合细胞培养物中的靶向作用。将相等数目的MDA-MB-435和GFP(+)MDA-MB-231细胞用单独Dox(0.5μM)、Her-Dox(含有0.5μMDox)或HerPBK10(1.2μg/孔，等效于HerDox中的HerPBK10)处理。分析各孔的GFP荧光(以测定相对MDA-MB-231数目)和结晶紫染色(以测定总细胞数目)。图9(B)进一步说明混合细胞培养中的靶向作用。细胞存活率是基于结晶紫染色(总细胞)和GFP荧光(MDA-MB-231细胞)通过计算实验(exp)细胞的根据对照(con)细胞正规化的相对倍增时间(DT)来测定。MDA-MB-435的DT是通过从总细胞DT中扣除MDA-MB-231的DT来测定。示出治疗第2天的相对存活率。图9(C)说明在细胞培养物中存在稳定性。将含有HerDox的培养基(在37℃下温育所指示的时间之后)的等分试样在2％琼脂糖凝胶上进行电泳。平行地加工在37℃下在HEPES缓冲盐水中温育的缺少血清的HerDox。通过UV激发目视观测Dox荧光。游离Dox(单独Dox)不保留在凝胶中，而合并在HerDox中的Dox保留在凝胶中。为将发荧光的条带与HerPBK10进行比对并且评估每条泳道的加载情况，将凝胶用考马斯蓝(Coomassieblue)染色，此还鉴别来自培养基样品的血清蛋白。图10说明GFP-Her对HER2+肿瘤的优先靶向。经由尾部静脉为带有肿瘤的小鼠注射3nmol的GFP-Her。在注射之后3.5h收获组织并且使用Xenogen小动物成像器进行目视观测。GFP荧光为假红色(假蓝色指示无荧光，而GFP强度是通过色标中的色值移向红色来反映)。图11(A)说明HerDox对HER2+肿瘤的优先靶向。经由尾部静脉为带有肿瘤的小鼠注射0.75nmol的HerDox或Dox并且用常规小动物成像器成像。图11(A)展示在IV递送HerDox之后的活小鼠的成像。肿瘤由箭头指示。图11(B)进一步说明HerDox对HER2+肿瘤的优先靶向。经由尾部静脉为带有肿瘤的小鼠注射0.75nmol的HerDox或Dox并且用常规小动物成像器成像。图11(B)展示在注射HerDox或Dox之后3小时收获的肿瘤和组织的成像。根据色标，来自Dox的荧光信号为假彩色，并且移向100指示高荧光强度。图11(B)说明使用根据本发明的一个实施方案的递送系统在向其他器官和组织的递送最少的情况下将Dox靶向递送至HER2+乳腺癌细胞(左侧图)与单独施用Dox(右侧图)相比的比较。图12(A)说明HerDox和Dox关于肿瘤生长的比较。图12(B)说明HerDox和Dox关于动物重量的比较。图12(C)说明HerDox和Dox关于心脏组织的比较。图12(D)说明HerDox和Dox关于心脏功能的比较。图13说明小鼠全血中的稳定性。在与HerDox或Dox一起在37℃下温育长达1小时之后通过经10KMW截止膜超滤来加工新收集的全血。由于使用0.5mMEDTA作为抗凝剂，平行地加工含于单独的EDTA(-血液)中的HerDox。柱状物以占各样品的总荧光的百分比的形式表示保留(截留物)或释放(滤液)的Dox的荧光。将Y轴的制度加以调整以显示滤液样品的存在。每次处理N＝3。图14(A)说明HerDox和Dox在活细胞中的细胞内转位和靶标的比较。将MDA-MB-435细胞与HerDox或游离Dox(0.5μM)在37℃下一起温育。活(未固定)细胞是通过明视野和荧光显微术来成像。图14(B)说明HerDox和Dox在活细胞中的细胞内转位和靶标的比较。将MDA-MB-435细胞与HerDox或游离Dox(0.5μM)在37℃下一起温育。活(未固定)细胞是通过DIC和共焦荧光显微术来成像。图15说明在乳腺癌细胞中的HerDox运输。在所指示的时间点将在37℃下与HerDox一起温育的细胞固定并且针对HerPBK10的抗体进行加工以获得免疫荧光。图像是使用共焦显微镜在荧光和明视野下捕获。n，细胞核；标尺，～8微米。图16说明HerPBK10与来自HER2+或HER2-乳腺癌患者的人类血清中的MDA-MB-435细胞结合。将细胞在含有来自5个HER2+乳腺癌患者或年龄匹配的HER2-对照(两者均获得预先化学治疗处理)中之每一者的人类血清的培养基中用HerPBK10(1.2μg/孔)处理。将细胞使用针对HerPBK10的抗体进行加工以用于ELISA分析。接收含HerPBK10的含有不含或含有10O倍摩尔过量竞争性配体抑制剂(+Her)的牛血清的培养基的对照(C)孔是由空心柱状物指示。患者血清是由位于Cedars-SinaiMedicalCenter的WCRI组织库提供。每次处理N＝3个孔。图17(A)说明基于细胞类型的相对细胞表面HER亚基水平和细胞毒性。使用标准程序将细胞依次与抗HER亚基抗体和HRP缀合型二次抗体一起温育。相对细胞数目是通过结晶紫染色来测量并且通过测量在590nm下的结晶紫吸光度来定量。相对亚基水平是以根据相对细胞数目正规化的各细胞群的ELISA信号或Abs450nm/590nm的形式加以报导。图17(A)展示如通过ELISA所测量的相对细胞表面HER亚基水平的图形。图17(B)展示对呈现不同的HER2的细胞的毒性。来自一系列HerDox剂量的细胞毒性是在各细胞系上通过代谢分析来评估并且通过结晶紫染色来确认。以对数刻度示出的CD50值是通过使用科学绘图程序对HerDox剂量曲线进行非线性回归分析来测定并且使用计算器来确认。各细胞系的相对HER2水平是挨着各CD50值示出。图18说明HerPBK10的最佳化。修饰过的蛋白质HerPBrgdK10的递送能力是在非病毒基因转移复合物的情形下测试，并且递送效率是通过在MDA-MB-453人类乳腺癌细胞中的转基因(荧光素酶)表达来评估。如通过2尾T检验所测定，*＝与等效浓度的HerPBK10相比P<0.005。该图证实本发明决不限于HerPBK10，因为可能引入将改进蛋白质的靶向、受体结合、细胞进入和/或细胞内运输的各种突变。图19说明证实DS-寡核苷酸长度不影响Dox合并到所靶向的复合物中的图。该图证实使用30或48碱基对双螺旋在Dox合并方面不存在可感知的差异。图20(A)说明HerDox对神经胶质瘤细胞是毒性的。图20(A)展示U251人类神经胶质瘤细胞上的HER免疫荧光。图像是使用激光扫描荧光共焦显微镜捕获。图20(B)展示HerDox与Dox对U251细胞的毒性的图。显著差异是通过2尾检验来测定。图21(A)说明抗性增强HerDox毒性。(A)在没有膜透化的情况下通过ELISA在亲本和曲妥珠单抗抗性乳腺癌细胞系上检测到的HER3(和HER2)的相对表面水平。N＝3。*＝与亲本相比p<0.05。图21(B)说明与曲妥珠单抗单独、帕妥珠单抗单独以及曲妥珠单抗-帕妥珠单抗组合处理相比，由HerDox(到处理之后48-72小时)产生的肿瘤细胞杀灭作用。N＝3。图22是示出HerDox在体内杀灭曲妥珠单抗抗性肿瘤的图。带有JIMT-1肿瘤的雌性裸鼠在肿瘤达到～100mm3时按所指示的剂量通过静脉(尾部静脉)注射接收所指示的试剂(每周两次注射持续4-6周)。肿瘤体积是通过卡尺测量。第0天对应于处理的第一天。每次处理N＝10个肿瘤。图23是示出曲妥珠单抗预处理增大HerDox毒性的图。在HerDox处理之前4小时和24小时将亲本或无抗性细胞(A-C)和曲妥珠单抗抗性细胞(D-F)按所指示的浓度(参见上部X轴)用曲妥珠单抗处理，并且在处理之后48-72h分析其存活率。N＝3。图24(A)展示通过非共价、血清稳定自组装形成的HerDox的图，示出具有所描绘的功能结构域的HerPBK10，以及与Dox嵌插型ds-寡核苷酸的亲电结合。图24(B)展示HerDox粒子的CryoEM图像。图24(C)是HerDox的示出Dox吸光度的溶离型态的HPLC色谱图。图24(C)进一步示出HPCE收集的级分的SDS-PAGE。图24(D)说明HerPBK10防止ds-寡核苷酸发生血清核酸酶消化。将ds-寡核苷酸在100％小鼠血清(Abcam,Cambridge,MA,USA)中温育20min，然后进行PAGE和EtBr染色以目视观测DNA。图24(E)说明HerDox在血液中保持稳定。将Dox或HerDox在小鼠血液中在37℃下温育一个小时，随后超滤以分离任何从复合物(截留物)释放的Dox(滤液)。N＝3。*，与相应截留物相比p<0.05。图25表明HerDox介导体外和体内肿瘤靶向递送。图25-A比较了在用HerDox或Dox(0.5μM最终Dox浓度)处理的单独培养物中对HER2+(MDA-MB-435)和HER2-(MDA-MB-231)细胞的细胞毒性。在处理的第3天的相对细胞存活率(呈占未处理的细胞的％形式)。(+Her)，在接收HerDox之前将MDA-MB-435细胞与受体阻断配体(重组调蛋白)一起预温育。N＝3。图25-B比较了HerDox和Dox在具有表达不同的HER2-3的肿瘤的小鼠中的生物分布。组织是从独立注射的在注射之后所指示的时间点安乐死的小鼠收获而来，并且使用多模式成像器来采集荧光强度/组织。图25-C说明在HerDox摄入之后一个小时HerPBK10和Dox定位于MDA-MB-435细胞中。n，细胞核。标尺，约4μm。图25-D基于肿瘤生长(每次处理N＝8-10个肿瘤)比较了HerDox和Dox。第0天＝尾部静脉注射之前3天(小鼠每天接受注射持续7天)。按照IACUC政策，归因于肿瘤溃破将对照(生理盐水注射)小鼠在早期安乐死。图25-E基于脱靶组织比较了HerDox和Dox。第0天＝尾部静脉注射之前3天(小鼠每天接受注射持续7天)。按照IACUC政策，归因于肿瘤溃破将对照(生理盐水注射)小鼠在早期安乐死。图25-E中的显微照片(20倍放大)示出所处理的小鼠的心肌的代表性H&E染色标本和肝脏的免疫荧光标本。核中的绿色荧光指示凋亡(阳性TUNEL染色)。上部图，TUNEL染色的定量；下部图，注射之后25天时的超声心动描记术测量。*，与生理盐水(模拟)相比P<0.05。图26-A示出与固定HER3(人类ErbB3细胞外结构域；Prospec)结合-/+与作为竞争性抑制剂(HER3阻断物)的可溶性HER3肽一起预温育的HerPBK10的ELISA。Un，无HerPBK10。图26-B示出与HER2+细胞结合-/+与作为竞争性抑制剂的以下物质一起预温育的HerPBK10的ELISA：1倍和10倍摩尔比的可溶性HER3肽、可溶性HER4肽(ERBB4肽，Abnova)、β细胞素(10μg/mL)或帕妥珠单抗(Pz)。HerPBK10与HER3结合不受患者血清抑制。图27-A说明抗性增强HerDox毒性。图27-A示出在没有膜透化的情况下通过ELISA在亲本和Tz抗性乳腺癌细胞系上检测到的HER3(和HER2)的相对表面水平。N＝3。*，与亲本相比p<0.05。图27-B说明抗性增强HerDox毒性。图27-B示出与Tz、Pz、Tz+Pz以及单独Dox相比由HerDox(处理之后48-72h)产生的肿瘤细胞杀灭作用。N＝3。图27-C说明HER3对靶向毒性的贡献。将亲本和抗性细胞系用HerDox-/+HER3阻断肽(ErbB3人类；Prospec)处理，并且在48小时后测试细胞存活率。具体地说，将HerDox在冷PBS中按等摩尔比率HER3:HerPBK10用HER3肽吸附一个小时，然后以0.1μM(JIMT-1，天然地对曲妥珠单抗处理具抗性)、0.125μM(BT-474)或1μM(SKBR3)的最终HerDox浓度添加到细胞中。将各处理与模拟(生理盐水)处理相比较。N＝3。*，与模拟物相比p<0.05。图27-D说明在没有膜透化的情况下通过ELISA在亲本和Tz抗性乳腺癌细胞系上检测到的HER3(和HER2)的相对表面水平。N＝3。*，与亲本相比p<0.05。图27-E说明与Tz、Pz、Tz+Pz以及单独Dox相比由HerDox(处理之后48-72h)引起的肿瘤细胞杀灭作用。N＝3。图28证实HerDox在体内消除曲妥珠单抗抗性肿瘤生长。带有JIMT-1肿瘤的雌性裸鼠在肿瘤达到～100mm3时以所指示的剂量通过静脉内(尾部静脉)注射接收所指示的试剂(每周两次注射持续4周)。肿瘤体积是通过卡尺测量。第0天对应于处理的第一天。每次处理N＝10个肿瘤。图29-A说明曲妥珠单抗预处理增大HerDox毒性。图29-A示出由Tz诱导的HER3升高和因HerPBK10而增强的结合。将亲本细胞系用0.5mg/mLTz预处理24小时，然后测试这些细胞的表面HER3水平。图29-B说明曲妥珠单抗预处理增大HerDox毒性。图29-B示出由Tz诱导的HER3升高和因HerPBK10而增强的结合。将亲本细胞系用0.5mg/mLTz预处理24小时，然后测试这些细胞的HerPBK10结合。图29-C表明曲妥珠单抗预处理增大HerDox毒性。在HerDox处理之前4小时和24小时将SKBR3亲本细胞以所指示的浓度(参见上部X轴)用Tz处理，并且在处理之后48-72h分析存活率。N＝3。图29-D表明曲妥珠单抗预处理增大HerDox毒性。在HerDox处理之前4小时和24小时将SK-474亲本细胞以所指示的浓度(参见上部X轴)用Tz处理，并且在处理之后48-72h分析存活率。N＝3。图29-E表明曲妥珠单抗预处理增大HerDox毒性。在HerDox处理之前4小时和24小时将MDA-MB-435无抗性细胞以所指示的浓度(参见上部X轴)用Tz处理，并且在处理之后48-72h分析存活率。N＝3。图29-F表明曲妥珠单抗预处理增大HerDox毒性。在HerDox处理之前4小时和24小时将Tz抗性细胞以所指示的浓度(参见上部X轴)用Tz处理，并且在处理之后48-72h分析存活率。N＝3。图29-G表明曲妥珠单抗预处理增大HerDox毒性。在HerDox处理之前4小时和24小时将Tz抗性细胞以所指示的浓度(参见上部X轴)用Tz处理，并且在处理之后48-72h分析存活率。N＝3。图29-H表明曲妥珠单抗预处理增大HerDox毒性。在HerDox处理之前4小时和24小时将Tz抗性细胞以所指示的浓度(参见上部X轴)用Tz处理，并且在处理之后48-72h分析存活率。N＝3。图30-A比较了HerPBK10和Tz的生物分布和细胞内运输。图30-A示出由标记过的HerPBK10、Tz以及BSA产生的生物分布的精诺真成像和荧光定量。图30-B示出MDA-MB-435细胞在由HerPBK10(绿色)和Tz(绿色)产生的细胞表面结合之后的不同时间点的荧光共焦显微照片。图形示出通过细胞表面ELISA定量并且通过细胞密度正规化的HER2(左侧柱状物)和HER3(右侧柱状物)的相对细胞表面水平。图31-A示出与原代人类肿瘤细胞结合。探测获自HER2+患者的手术标本的原代肿瘤细胞的细胞表面受体水平。图31-B示出与原代人类肿瘤细胞结合。探测获自HER2+患者的手术标本的原代肿瘤细胞的HerPBK10结合。图32-A为人类(SEQIDNO:13)和小鼠HER3(SEQIDNO:14)的结构域I-II(调蛋白-结合结构域)的氨基酸序列比对。图32-B比较了使用与人类与小鼠HER3交叉反应的抗HER3抗体(1B2E；CellSignalingTechnologies)通过ELISA(在没有透化的情况下)在不同细胞系上检测到的相对HER3水平。图32-C说明HerPBK10与4T1小鼠乳房肿瘤细胞的结合。N＝3。*，与单独HerPBK10相比p<0.05。图33-A示出金属化(S2Ga、S2MN)和非金属化(S2FB)磺化咔咯的化学结构，以及与HerPBK10非共价组装以形成分别指定为HerFB、HerGa以及HerMn的圆形粒子的示意图。表格汇总了三种咔咯的突出特征。图33-B示出HerGa的CryoEM图像。图33-C示出溶液中HerMn的动态光散射测量。插图示出HerMn粒子的TEM。图34-A表明S2FB而不是金属化咔咯抑制SOD1。测量来自XOD-/+SOD的过氧化物产量的体外分析。仅S2FB(1μM)影响SOD活性，使其降低约三分之一。图34-B表明S2FB吸收峰因与SOD一起温育而发生位移(箭头)。图34-C表明CuCl2猝灭S2FB荧光。图35-A说明概述突变五邻体基底文库的随机诱变和生物淘选的流程。图35-B说明由生物淘选分离的全长克隆和截短克隆的示意图，与野生型HerPBK10比对。图35-C示出使用针对N端组氨酸标签的抗体检测到的亚细胞级分(20μg/泳道)的免疫墨点。图35-D示出MDA-MB-435细胞在摄入所指示的重组蛋白(10μg/孔，12孔盘)30min时的免疫荧光。标尺，～10μm。图36-A说明S2Ga与TSPO相互作用。图36-A示出将可溶性重组TSPO蛋白与S2Ga以等效摩尔浓度(1μM)在室温下一起温育～20min，随后超滤以移除游离、未结合的S2Ga。通过测量吸光度和荧光光谱来评估截留物中蛋白质结合型咔咯的存在。在所指示的情况下，使用PK11195作为TSPO上卟啉结合位点的竞争性抑制剂。图36-B进一步说明S2Ga与TSPO相互作用。图36-B示出将可溶性重组TSPO蛋白与S2Ga以等效摩尔浓度(1μM)在室温下一起温育～20min，随后超滤以移除游离、未结合的S2Ga。通过测量吸光度和荧光光谱来评估截留物中蛋白质结合型咔咯的存在。在所指示的情况下，使用PK11195作为TSPO上卟啉结合位点的竞争性抑制剂。图36-C示出HerGa与TSPO原位相互作用的证据。在将MDA-MB-435细胞用HerGa处理之前24小时将细胞用表达外源性TSPO的质粒转染，并且检查HerGa介导的粒线体破坏，这是通过线粒体中红色荧光染料累积减少和绿色荧光在细胞质中累积来证明。图36-D示出图36-C中所见的红色荧光的定量。*，p<0.05图37示出HerMn对人类HER2+和HER2-肿瘤细胞的毒性。各细胞系接收所指示浓度的HerMn或S2Mn，并且在24小时后经由结晶紫(CV)染色评估存活率。每一浓度N＝3，来自3次单独实验。图38-A示出HerMn细胞毒性的机制。共焦荧光图像示出HerMn对MDA-MB-435细胞的影响。比例尺＝10μm。图38-A示出接收10μMS2Mn或HerMn随后在24小时后接收TMRM(30nM)的HBSS溶液的细胞中的线粒体膜电位的降低。对照，PBS处理的。图38-B示出HerMn细胞毒性的机制。共焦荧光图像示出HerMn对MDA-MB-435细胞的影响。比例尺＝10μm。图38-B示出在细胞上温育24小时之后由HerMn(5μM)引起的过氧化物介导的肌动蛋白(红色)和微管蛋白(绿色)的崩溃。S2Mn(5μM)、HerPBK10(在与HerMn等效的蛋白质浓度下)以及PBS充当对照。其他细胞在HerMn处理之前接收钛试剂(Tiron)(5mM)持续一个小时。图39示出带有肿瘤的小鼠中的生物分布。在尾部静脉注射之后Alexa680标记过的HerMn、Tz以及BSA(各12nmol)的精诺真成像和定量。图形，平均荧光-/+SEM。图40-A为HerMn的治疗功效的说明。图40-A示出每天接受HerMn或S2Mn(5nmol咔咯/注射)静脉注射(经由尾部静脉)每天一次持续6个连续日的雌性裸鼠中的HER2+MDA-MB-435肿瘤生长。对照组以与HerMn等效的浓度接收生理盐水或HerPBK10。处理是在～200mm3平均肿瘤体积时开始。肿瘤体积是在注射试剂之前(第1天)、期间(第3天)以及之后(第8、15以及22天)测量。N＝8-10个肿瘤/组。*p<0.05(单因素ANOVA)。图40-B示出暴露于HerMn、S2Mn、HerPBK10或阿霉素(doxorubicin)(Dox)48小时之后的人类CDC活力。每一浓度N＝3，来自3次单独实验。图41-A说明HerMn增强MRI对比度。图41-A示出在溶液中T1弛豫缩短。图41-B说明HerMn增强体内MRI对比度。图像(左)示出带有肿瘤的小鼠在每天接受全身性HerMn或S2Mn(IV)注射(每次注射8nmol)持续8天以允许信号累积或在成像之前10min注射一次0.1mmol/kg钆之后的截面。肿瘤是通过加框区域来描绘，并且放大(右)。图42-A示出在没有膜透化的情况下通过ELISA在亲本和Tz抗性乳腺癌细胞系上检测到的HER3和HER2的相对表面水平。N＝3。*，与亲本相比p<0.05。图42-B示出在没有膜透化的情况下通过ELISA在JIMT-1乳腺癌细胞系上检测到的HER3和HER2的相对表面水平。N＝3。*，与亲本相比p<0.05。图42-C示出由Tz诱导的HER3升高和因HerPBK10而增强的结合。将亲本细胞系用0.5mg/mLTz预处理24小时，然后测量细胞表面HER3水平。图42-D示出由Tz诱导的HER3升高和因HerPBK10而增强的结合。将亲本细胞系用0.5mg/mLTz预处理24小时，然后测试这些细胞的HerPBK10结合。图42-E示出了获自HER2+患者的手术标本的原代肿瘤细胞上的细胞表面受体水平。图42-F示出HerPBK10结合于获自HER2+患者的手术标本的原代肿瘤细胞上。图43说明诸如HerGa等咔咯纳米生物粒子在体外和体内对Tz抗性肿瘤细胞展现增强的毒性。图43-A示出在没有膜透化的情况下通过ELISA在亲本和曲妥珠单抗抗性乳腺癌细胞系上检测到的HER3的相对表面水平。N＝3。*，与亲本相比p<0.05。图43-B示出与Tz相比由HerGa(到处理之后48-72小时)产生的肿瘤细胞杀灭作用。N＝3。图43-C示出与Tz+Pz组合处理相比由HerGa(到处理之后48-72小时)产生的肿瘤细胞杀灭作用。N＝3。图43-D示出体内肿瘤生长的消除。带有BT474肿瘤的雌性裸鼠在肿瘤达到～100mm3时以所指示的剂量通过静脉注射(尾部静脉)接收所指示的试剂(每周两次注射持续4-6周)。肿瘤体积是通过卡尺测量。第0天对应于处理的第一天。每次处理N＝10个肿瘤。图43-E示出体内肿瘤生长的消除。带有BT474肿瘤的雌性裸鼠在肿瘤达到～100mm3时以所指示的剂量通过静脉注射(尾部静脉)接收所指示的试剂(每周两次注射持续4-6周)。肿瘤体积是通过卡尺测量。第0天对应于处理的第一天。每次处理N＝10个肿瘤。实施方案的详细描述处理方法在一个方面中，本文公开治疗患者的癌症的方法，所述方法包括：鉴别对用抗HER2治疗进行治疗具抗性的患者；以及向所述患者施用治疗有效量的药物递送分子，所述药物递送分子包含：多肽分子，其适合于靶向和/或穿透一种细胞类型；核酸分子，其经由静电相互作用与所述多肽序列结合；以及化学剂，其与所述核酸序列非共价连接。本文公开的方法中所用的药物递送分子在其他地方有描述。举例来说，国际公布WO2009/009441和美国专利申请公布US2010/0331273A1详细描述了药物递送分子的组分以及其制备方法。这两个公布的内容均以全文引用的方式并入本文中，包括图式。具体地说，公布US2010/0331273A1的段落[0055]-[0094]、图式和其描述以及序列表以引用的方式并入本文中。如本文所用的“治疗有效量”是指能够在癌症患者中实现有益结果的量。治疗有效量可在个体基础上测定并且将至少部分基于以考虑因素：哺乳动物的生理特征、所用递送系统或治疗技术的类型以及施药相对于疾病进展的时间。当发生以下情况时获得有益结果：1)癌性肿瘤尺寸缩小；2)癌性肿瘤停止生长；或3)与施用治疗之前的时间段相比癌性肿瘤的生长速度减慢。在一些实施方案中，抗HER2治疗包括抗体治疗。在这些实施方案中，向患者施用针对HER2有效的抗体。这些抗体的实例包括曲妥珠单抗和帕妥珠单抗，或其生物类似物。在其他实施方案中，抗HER2治疗包括小分子治疗。在这些实施方案中，向患者施用有机小分子(即不是多肽、核酸或聚合物的化合物)，所述化合物针对HER2有效。小分子治疗剂的实例为拉帕替尼。在一些实施方案中，多肽分子包含靶向配体。在某些实施方案中，多肽分子包含带正电荷的结构域。在其他实施方案中，多肽为重组融合蛋白。在这些实施方案中的一些中，重组融合蛋白包含Her区段。在某些实施方案中，重组融合蛋白包含五邻体基底区段。在一些实施方案中，多肽分子包含受体结合结构域，其在一些实施方案中为调蛋白-α。在某些实施方案中，多肽分子包含內体溶解结构域。在这些实施方案中的一些中，內体溶解结构域包含Arg-Gly-Asp基序，而在其他实施方案中，內体溶解结构域包含Glu-Gly-Asp基序。在某些实施方案中，多肽分子包含聚赖氨酸基序，其在一些实施方案中为十赖氨酸(K10)。在一些实施方案中，多核苷酸序列为SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9或其组合。在某些实施方案中，多肽序列为HerPBK10。如本文所用，“PB”是指五邻体基底区段，其通常介导腺病毒血清型5在早期感染期间的细胞结合、进入以及胞质穿透。五邻体基底蛋白的实例在本文中是以SEQIDNO:10形式提供。这种五邻体基底蛋白通常具有RGD基序(Arg-Gly-Asp)。如本文所用，“K10”是指十赖氨酸基序，其具有通过亲电相互作用结合核酸的能力，在本文中以SEQIDNO:11形式提供。编码HerPBK10的核苷酸序列的实例在本文中以SEQIDNO:4加上其补体链SEQIDNO:5的形式提供。类似地，可使用RGD基序的点突变来产生EGD基序(Glu-Gly-Asp)，从而产生HerPBrgdK10多肽分子(而不是HerPBK10)。在一些实施方案中，核酸分子为双链寡核苷酸。在这些实施方案中的一些中，双链寡核苷酸通过静电相互作用与重组融合蛋白结合。在一些实施方案中，化学剂为毒素。在一些实施方案中，化学剂为化学治疗剂，其在某些实施方案中为阿霉素，或其药学等效物。在某些实施方案中，化学剂嵌插有核酸分子。如本文所用，“嵌插”是指插入诸如多核苷酸序列等现有结构中的能力。如本文所用的“化学治疗剂”是指具有破坏、杀灭癌细胞或肿瘤、防碍其生长和/或以其他方式对其具有有害作用的能力的药剂。这些可包括但决不限于烷基化剂(例如白消安(busulfan)、顺铂、卡铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、达卡巴嗪(dacarbazine)、甲基二氯乙胺、美法仑(melphalan)以及替莫唑胺(temozolomide))、亚硝基脲(例如链佐星(streptozocin)、卡莫司汀(carmustine)以及洛莫司汀(lomustine))、蒽环类和相关药物(例如阿霉素、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)以及米托蒽醌(mitoxantrone))、拓扑异构酶I和II抑制剂(例如拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、依托泊苷(etoposide)以及替尼泊苷(teniposide))以及有丝分裂抑制剂(例如紫杉烷，诸如帕西他赛(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)，以及长春花生物碱，诸如长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)以及长春瑞滨(vinorelbine))。其他化学治疗剂将为本领域技术人员了解的并且可结合本文所公开的替代实施方案通过常规努力加以使用。在一些实施方案中，细胞类型为抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞。通常，HER2+乳腺癌细胞对例如通过抗HER2抗体(诸如曲妥珠单抗或帕妥珠单抗)或通过小分子向(诸如拉帕替尼)进行的治疗起反应。对治疗“起反应”意谓在通过在体内向癌症患者全身地施用抗体或通过使细胞在体外与抗体接触而向癌细胞施用抗体后，样品中或患者中的细胞的数目例如通过诱导的凋亡而减少，或样品中或患者中的细胞生长减慢或停止。在患者中，这被看作癌性肿瘤缩小、缺乏肿瘤生长或与施用抗体之前的时间相比肿瘤生长减慢。“抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞”为对通过抗体或小分子治疗不起反应的那些细胞。这些细胞甚至在施用治疗剂之后仍继续生长。一些细胞固有地对治疗具抗性。这些细胞从不对治疗起反应。其他细胞后天获得对治疗的抗性。这些细胞最初对治疗起反应，但在一段时间之后停止起反应。因此，患者变成所述治疗难以治疗的。在一些实施方案中，HER2+乳腺癌细胞具有高于非治疗抗性HER2+乳腺癌细胞上的表面HER3水平的表面HER3水平。“非治疗抗性HER2+乳腺癌细胞”意谓对用诸如抗HER2抗体或小分子等治疗剂治疗起反应并且尚未变得难治的的HER2+癌细胞。在其他实施方案中，抗性乳腺癌细胞显示与在非治疗抗性HER2+乳腺癌细胞上所见相同的表面HER3表达水平。在某些实施方案中，抗HER2抗体为曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。在一些实施方案中，HER2+乳腺癌细胞固有地对抗HER2治疗具抗性，而在其他实施方案中HER2+乳腺癌细胞对抗HER2治疗具有获得性抗性。在一些实施方案中，本文所描述的方法进一步包括与药物递送分子共施用抗HER2治疗剂的步骤。在这些实施方案中的一些中，治疗剂和药物递送分子为同时施用。在所述实施方案中的一些中，治疗剂与药物递送分子呈相同可施用剂型。在其他实施方案中，治疗剂与药物递送分子在不同时间施用。在一些实施方案中，患者为初次接受治疗剂治疗。在其他实施方案中，患者已经历治疗剂治疗一些时间，并且然后将药物递送分子治疗添加到治疗方案中。在一些实施方案中，患者为选自以下的哺乳动物：小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、绵羊、山羊、奶牛、猴、黑猩猩、猿以及人类。在某些实施方案中，患者为人类。在另一个方面中，本文公开诱导抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞凋亡的方法，所述方法包括：使所述抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞与药物递送分子接触，所述药物递送分子包含：多肽分子，其适合于靶向和/或穿透一种细胞类型；核酸分子，其经由静电相互作用与所述多肽序列结合；以及化学剂，其与所述核酸序列非共价连接。在这个方面的实施方案中，药物递送分子如上文和本文其他地方所描述。在一些实施方案中，接触为体外的。举例来说，在这些实施方案中，细胞是在实验室中生长并且接触是作为实验室实验的一部分而进行。在一些实施方案中，接触为体内的。在这些实施方案中，向患者施用药物递送分子或其前药。若施用前药，则前药转化为药物递送分子，并且接触是在患者体内进行。在一些实施方案中，抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物任选选自小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、绵羊、山羊、奶牛、猴、黑猩猩、猿以及人类。在第三方面中，本文描述一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括：鉴别对抗HER2治疗具抗性的患者；以及向所述患者施用治疗有效量的药物递送分子，所述药物递送分子包含：多肽分子，其适合于靶向和/或穿透一种细胞类型；以及磺化咔咯分子，其与所述多肽序列结合。在这个方面的一些实施方案中，磺化咔咯分子包括金属，诸如但不限于锰(Mn)、铁(Fe)和/或镓(Ga)。在一些实施方案中，药物递送分子为HerMn、HerFe或HerGa。在一个实施方案中，抗HER2治疗包括抗体治疗。在这些实施方案中的一些中，抗体为曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。在另一个实施方案中，抗HER2治疗包括小分子治疗。在这些实施方案中的一些中，小分子为拉帕替尼。在一些实施方案中，多肽分子包含靶向配体。在一些实施方案中，多肽分子包含带正电荷的结构域。在一些实施方案中，多肽为重组融合蛋白。在这些实施方案中的一些中，重组融合蛋白包含Her区段。在其他实施方案中，重组融合蛋白包含五邻体基底区段。在一些实施方案中，多肽分子包含受体结合结构域。在这些实施方案中的一些中，受体结合结构域为调蛋白-α。在一些实施方案中，多肽分子包含內体溶解结构域。在这些实施方案中的一些中，內体溶解结构域包含Arg-Gly-Asp基序。在其他实施方案中，內体溶解结构域包含Glu-Gly-Asp基序。在一些实施方案中，多肽分子包含聚赖氨酸基序。在这些实施方案中的一些中，聚赖氨酸基序为十赖氨酸。在一个实施方案中，多核苷酸序列为SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9或其组合。在一个实施方案中，多肽序列为HerPBK10。编码HerPBK10的核苷酸序列的实例在本文中以SEQIDNO:4加上其补体链SEQIDNO:5的形式提供。在一个实施方案中，细胞类型为抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞。在这些实施方案中的一些中，HER2+乳腺癌细胞具有高于对治疗起反应的HER2+乳腺癌细胞上的表面HER3水平的表面HER3水平。在一些实施方案中，HER2+乳腺癌细胞固有地对抗HER2治疗具抗性。在其他实施方案中，HER2+乳腺癌细胞对抗HER2治疗具有获得性抗性。在一些实施方案中，患者为选自以下的哺乳动物：小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、绵羊、山羊、奶牛、猴、黑猩猩、猿以及人类。在本文所描述的第四方面中为诱导抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞凋亡的方法，所述方法包括：使所述抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞与药物递送分子接触，所述药物递送分子包含：多肽分子，其适合于靶向和/或穿透一种细胞类型；以及磺化咔咯分子，其与所述多肽序列结合。在这个方面的一些实施方案中，磺化咔咯分子包括金属，诸如但不限于锰(Mn)、铁(Fe)和/或镓(Ga)。在一些实施方案中，药物递送分子为HerMn、HerFe或HerGa。在一个实施方案中，抗HER2治疗包括抗体治疗。在这些实施方案中的一些中，抗体为曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。在另一个实施方案中，抗HER2治疗包括小分子治疗。在这些实施方案中的一些中，小分子为拉帕替尼。在一些实施方案中，多肽分子包含靶向配体。在一些实施方案中，多肽分子包含带正电荷的结构域。在一些实施方案中，多肽为重组融合蛋白。在这些实施方案中的一些中，重组融合蛋白包含Her区段。在其他实施方案中，重组融合蛋白包含五邻体基底区段。在一些实施方案中，多肽分子包含受体结合结构域。在这些实施方案中的一些中，受体结合结构域为调蛋白-α。在一些实施方案中，多肽分子包含內体溶解结构域。在这些实施方案中的一些中，內体溶解结构域包含Arg-Gly-Asp基序。在其他实施方案中，內体溶解结构域包含Glu-Gly-Asp基序。在一些实施方案中，多肽分子包含聚赖氨酸基序。在这些实施方案中的一些中，聚赖氨酸基序为十赖氨酸。在一个实施方案中，多核苷酸序列为SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9或其组合。在一个实施方案中，多肽序列为HerPBK10。编码HerPBK10的核苷酸序列的实例在本文中以SEQIDNO:4加上其补体链SEQIDNO:5的形式提供。在一个实施方案中，细胞类型为抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞。在这些实施方案中的一些中，HER2+乳腺癌细胞具有高于对治疗起反应的HER2+乳腺癌细胞上的表面HER3水平的表面HER3水平。在一些实施方案中，HER2+乳腺癌细胞固有地对抗HER2治疗具抗性。在其他实施方案中，HER2+乳腺癌细胞对抗HER2治疗具有获得性抗性。在一些实施方案中，患者为选自以下的哺乳动物：小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、绵羊、山羊、奶牛、猴、黑猩猩、猿以及人类。在一些实施方案中，使抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞与药物递送分子接触为体外的。在其他实施方案中，接触为体内的。在一些实施方案中，抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞为哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物选自小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、绵羊、山羊、奶牛、猴、黑猩猩、猿以及人类。药物递送分子本文公开包括用于使化学剂靶向细胞的自组装复合物的递送系统。递送系统能够在体外和体内靶向患病的细胞，避开心脏组织(在需要这样做的情况下)，并且结合并穿透到靶细胞中。此外，复合物是非共价组装(即不需要例如化学治疗剂与所靶向的载体的化学偶联)，并且它使用小核酸载体作为桥来将药物与所靶向的蛋白质载体媒剂组装。根据本文所描述的各个实施方案可使用许多多核苷酸序列或小双链核酸。举例来说，在一个实施方案中，使用SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9或其组合作为多核苷酸序列或双链核酸。根据本文所描述的各个实施方案可使用许多靶向配体。举例来说，当靶向诸如αvβ3等整合素时，PB本身可充当PBK10的靶向配体。如本领域技术人员已知的，整合素在各种类型的转移性肿瘤中过度表达。因此，结合本文所描述的各个实施方案，可使用PBK10来靶向具有高整合素表达的转移性肿瘤和细胞。所公开的递送系统包括可通过各种施用途径向哺乳动物施用的复合物，在施用后其锁定在靶细胞(例如癌细胞)上以将诸如显像剂或治疗剂等分子递送至细胞中。在一个实施方案中，复合物将治疗剂递送至癌细胞，同时避开正常、健康的细胞。如图1中所示，所公开的递送系统的一个实施方案包括三种组分，所述三种组分自组装成一种靶向缀合物。第一组分(“单元A”)为独特的细胞穿透蛋白，其靶向并穿透特定类型的细胞。其包括配体(受体结合结构域)、膜穿透结构域以及DNA结合结构域。第二组分(“单元B”)为小核酸(例如双链寡核苷酸)，其经由静电相互作用与单元A结合。第三组分(“单元C”)为化学剂，其经由嵌插相互作用结合单元B。在一个实施方案中，化学剂为毒性分子。在一个实施方案中，细胞类型为癌细胞，并且化学剂为化学治疗剂。在另一个实施方案中，细胞类型为HER2+乳腺癌细胞，并且化学剂为Dox，或其药学等效物。在一个实施方案中，HerPBK10与含有嵌插的阿霉素(Dox)的小30-碱基对双链核酸(ds-寡核苷酸)混合。在一些实施方案中，这引起如通过cryoEM所观测10-50nm直径圆形粒子的非共价组装(图24B)，从而在超滤、HPLC期间保留Dox(图24C)，延长在不同温度下的储存，并且抵抗药物在血清(图24D)和血液(图24E)中的释放。在这些实施方案中的一些中，ds-寡核苷酸的序列对Dox加载无影响，并且更长的ds-寡核苷酸(诸如48-bp片段)未必展示改进的加载能力。在一些实施方案中，一个30-bp寡核苷酸可结合多达50个并且包括50个阿霉素分子。在一个实施方案中，包含蛋白质、DNA以及Dox的组装后的纳米粒子结合多达10个并且包括10个蛋白质复合物HerPBK10分子。在另一个实施方案中，组装后的粒子的UV/Vis光谱学证实各ds-寡核苷酸片段结合约5、6、7、8个或更多个HerPBK10分子和约10-40个Dox分子。这与所预测的为用嵌插的Dox中和DNA并且使其饱和所需的摩尔比相符合。在一些实施方案中，HerDox在体外和体内展现对HER2+细胞的受体依赖性靶向。在那些实施方案中的一个中，如图25-A中所说明，在分开的细胞培养物(图25-A)与混合细胞培养物(图9)两者中，HerDox粒子优先对HER2+而不是HER2-细胞具毒性。在另一个实施方案中，HerDox粒子对过表达HER3的诸如三阴性乳腺癌(TNBC)细胞等HER2-细胞为毒性的。细胞毒性因受体阻断而受抑制。图25-B表明HerDox呈现对在体内具有较高(与较低相比)受体水平的肿瘤细胞优先的生物分布。在图25-C中所示的一个实施方案中，肿瘤靶向和细胞内运输研究表明Dox不展现从HerDox粒子释放，直到进入细胞之后，此时Dox快速在细胞核中累积，而HerPBK10保留在核周边。图25-D和25-E表明体内全身递送在极低药理学剂量(0.004mg/kg的Dox)下引起HER2+肿瘤细胞死亡，同时避免肝脏和心脏毒性。这与非靶向型Dox形成对比，所述非靶向型Dox需要较高剂量来引发类似肿瘤毒性，同时造成肝脏组织和心肌损伤。在一个实施方案中，对HER2抑制的抗性使得肿瘤特别倾向于受HerDox攻击。尽管如此，抗性不是HerDox功效必须的(HerDox对曲妥珠单抗敏感性与抗性肿瘤细胞均有效)，并且对两者，但尤其是抗性细胞比信号抑制具有优势。在各个实施方案中，所公开的递送系统被合并到药物组合物中，所述药物组合物可被调配成用于经由任何施用途径来递送。“施用途径”可指本领域中已知的任何施用途径，包括但不限于气溶胶、鼻内、口腔、经粘膜、经皮或肠胃外。“肠胃外”是指通常与注射相关的施用途径，包括眶内、动脉内、囊内、心内、皮内、肌肉内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网腹下、包囊下、皮下、经粘膜或经气管输注。经由肠胃外途径，组合物可呈用于输注或用于注射的溶液或悬浮液的形式，或呈冻干粉末的形式。在一些实施方案中，药物组合物还含有任何药学上可接受的载体。如本文所用的“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，其参与将所关注的化合物从一个组织、器官或身体部分运载或转运至另一组织、器官或身体部分。举例来说，载体可为液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料，或其组合。载体的各组分必须为“药学上可接受的”，因为其必须与调配物的其他成分相容。其还必须适合于与其可能接触的任何组织或器官接触使用，这意味着其不能带有过分地超过其治疗益处的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或任何其他并发症的危险。在一些实施方案中，药物组合物被封装、制成片剂或制成乳液或糖浆以便经口施用。可添加药学上可接受的固体或液体载体以增强或稳定组合物，或有助于组合物的制备。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、生理盐水、酒精以及水。固体载剂包括淀粉、乳糖、硫酸钙、二水合物、石膏粉、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石、果胶、阿拉伯胶、琼脂或明胶。载体还可以包括持续释放材料，诸如单独或加上蜡的单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯。药物制剂是遵循常规制药技术而制得，所述常规制药技术对于片剂形式涉及研磨、混合、造粒以及压制(必要时)；或涉及研磨、混合以及填充以制备硬明胶胶囊形式。当使用液体载体时，制剂将呈糖浆、酏剂、乳液或水性或非水性悬浮液的形式。此类液体制剂可直接口服施用或填充至软明胶胶囊中。本文所公开的药物组合物可以治疗有效量递送。精确治疗有效量为组合物将在给定受试者中就治疗功效来说产生最有效结果的量。这个量将视包括但不限于以下的多种因素而变化：治疗性化合物的特征(包括活性、药代动力学、药效动力学以及生物利用率)、受试者的生理条件(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、总身体状况、对给定剂量的反应性以及药物类型)、调配物中的药学上可接受的载体的性质以及施用途径。临床和药理学领域的熟练人员将能够通过常规实验确定治疗有效量，例如通过监测受试者对施用化合物和相应地调整剂量的反应。关于其他指导，参见Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(Gennaro编,第20版,Williams&WilkinsPA,USA)(2000)。所公开的递送系统和更具体地说治疗剂(例如化学治疗剂)、特别是Dox和/或由其递送的显像剂的典型剂量在制造商在使用已知治疗性化合物或显像剂的情况下所建议的和另外如通过体外反应或在动物模型中的反应向熟练技工所指示的范围内。实际剂量将视医师的判断、患者的病状以及治疗方法的有效性而定。还公开通过向有需要的哺乳动物施用治疗有效量的包括适合于治疗疾病的治疗剂的所公开的递送系统来治疗疾病的方法。在一个实施方案中，疾病为癌症并且治疗剂为化学治疗剂。在另一个实施方案中，疾病为乳腺癌和/或HER2+乳腺癌，并且治疗剂为Dox。药物的递送在一个实施方案中，本文所公开的药物递送分子促进将现有化合物递送至肿瘤位点。在这些实施方案中的一些中，使用本文所公开的药物递送分子来改进已知展现治疗功效的化合物的递送。在一些实施方案中，化合物由美国食品和药物管理局(U.S.FoodandDrugAdministration，FDA)批准用于治疗疾病。在某些实施方案中，FDA批准的药物是用于标示外用途。在一个实施方案中，药物为阿霉素。在一些实施方案中，将药物稳定捕获于HerDox复合物中促成药物在药物递送分子中的功效和安全性。这一方法比以下方法有优势：将药物装载到胶囊中，这倾向于通过扩散而渗漏；或通过共价缀合对药物进行化学修饰，这倾向于影响药物的活性和效能。与HER2抑制剂比较.与对HER2和EGFR抑制的抗性相关的HER3升高刺激研制抗HER3抗体来抑制通过HER3进行的信号传导。HerDox比此类抑制剂具有若干优势。在一个实施方案中，HerPBK10不依靠信号衰减来获得其治疗活性，而是替代地使用HER3作为入口来快速内吞进入肿瘤细胞并且通过递送毒性分子从里面杀灭细胞。在一些实施方案中，不同于HerPBK10，抗体不触发摄入。替代地，抗体被动地、缓慢地并且以低水平内化。作为一个实例，在HerDox与近来被批准用于临床用途的曲妥珠单抗缀合型依酯(T-DM1)之间存在重大差异。第一，T-DM1是靶向HER2并且因此它不以对HER2抑制具抗性的肿瘤为目标。第二，虽然T-DM1意在经历内化来递送有丝分裂抑制剂依酯，但是HER2自己不发生内吞，而是替代地依赖于通过受体周转进行被动的细胞进入或与HER3结合型配体共摄入。因此，曲妥珠单抗(Tz)缀合物的摄入为缓慢的(约数小时)并且与由HER-配体结合触发的稳健性进入相比之下为相对低的。这一结果在将HerPBK10摄入与Tz摄入相比较的图30中示出。第三，对T-DM1的抗性是通过诱导HER3和药物外排转运体来介导。另一方面，Dox直到细胞摄入并且朝向细胞核运输之后仍在HerDox粒子中被保护，在核中药物被释放以便进行核累积。这种粒子运输避免了药物外排转运体。HerDox与其他抗体之间的作用机制之间的这些差异影响为治疗功效所需的剂量。作为一个实例，本发明人的研究已表明约0.004mg/kgHerDox足以靶向并且消除肿瘤生长，同时避开小鼠中的正常组织，诸如心脏和肝脏。这与对脱靶组织引发熟知有害作用的为T-DM1(约3.6mg/kg)以及患者(约1-5mg/kg)和小鼠(超过0.04mg/kg)中的非靶向型Dox所需的治疗剂量形成对比。在一个实施方案中，本文所描述的治疗癌症的方法是用于治疗三阴性乳腺癌(TNBC)。TNBC固有地为HER2-抗性的。这些肿瘤上缺乏雌激素、孕酮以及HER2受体限制可使用的靶向治疗的类型。当前研究表明，TNBC表达HER3。虽然已针对这些肿瘤探索了EGF-R抑制剂，但升高的HER3也促成了对此类抑制剂的抗性。本文所描述的治疗癌症的方法适用于此类固有HER2-抗性肿瘤。类似地，本文所描述的方法还适用于乳房、胃、结肠、肺脏以及卵巢中的肿瘤，其中响应于EGFR、HER2以及PI3K激酶抑制剂鉴别到HER3上调。HERDOX作用机制在一些实施方案中，对HER2抑制剂具有获得性抗性的HER2+肿瘤对HerDox敏感，这是归因于(i)HER3介导的靶向作用，(ii)由粒子内吞和胞内裂解引起的受体隐蔽和下调，和/或(iii)提供有效负荷保护并且避免药物外排的内体和粒子运输。在这些实施方案中的一些中，由HerDox诱导的HER3群集、内吞以及胞内裂解使HER3与HER2活化隔离开并且使信号传导内体钝化。在一个实施方案中，除升高的HER3有助于靶向抗性细胞之外，HerPBK10纳米粒子的多价性诱导HER3同源寡聚化和隔离远离HER2(以及任何其他酪氨酸激酶)，因此防止HER3磷酰化和活化。在另一个实施方案中，HER3升高还有助于形成配体诱导的HER3同型寡聚物，并且因此此类现象是抗性细胞所特有的。此外，通过使得能够进入细胞质中的胞内裂解作用对受体隐蔽囊泡的破坏使内体信号传导停止，同时支持Dox递送至细胞内毒性靶标，因此为总细胞毒性作贡献。在一些实施方案中，内体和粒子运输保护药物外排的有效负荷。内吞转运、通过HerPBK10进行的药物封装以及HerDox运输至核周边的组合有助于避免药物外排。在一些实施方案中，与组合治疗相比，HerDox对对HER2抑制剂具有获得性抗性的HER2+肿瘤产生改进的靶向毒性。这些HER2单一疗法和组合治疗包括但不限于Tz、Tz-Pz、Tz-Lp以及T-DM1。在一些实施方案中，当用作对初次接受试验的HER2+肿瘤进行HerDox治疗的佐剂时HER2-抑制剂的功效增大。在这些实施方案中的一些中，HER2-抑制剂在体内诱导HER3并且使初次接受试验的肿瘤对HerDox敏感。在其他实施方案中，HerPBK10经由HER3与HER2+患者的肿瘤组织结合。在一个实施方案中，HER2-抑制不诱导对人类CDC的HerDox毒性。在本文所描述的一些实施方案中，HER2-乳房肿瘤(包括TNBC)为可由HerDox经由HER3靶向的并且通过用EGF-R抑制剂进行辅助治疗而进一步敏感化。在这些实施方案中的一些中，EGF-R抑制剂在体外诱导HER3升高并且使TNBC细胞对HerDox敏感。在一些实施方案中，HerDox在转移性与免疫活性环境中对TNBC模型均为治疗有效的。作为新颖有效负荷的咔咯咔咯在本领域中定义并且描述于例如美国专利申请公布号US2014/03350251A1中，该专利申请的全部公开内容以本文引用的方式并入本文中，包括图式。本文公开治疗患者的癌症的方法，所述方法包括鉴别对抗HER2治疗具抗性的患者；以及向患者施用治疗有效量的药物递送分子，所述药物递送分子包含适合于靶向和/或穿透一种细胞类型的多肽分子；以及与多肽序列结合的磺化咔咯分子。本文还公开诱导抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞凋亡的方法，所述方法包括使抗HER2治疗抗性HER2+乳腺癌细胞与药物递送分子接触，所述药物递送分子包含适合于靶向和/或穿透一种细胞类型的多肽分子；以及与多肽序列结合的磺化咔咯分子。咔咯在结构上类似于卟啉。在一些实施方案中，咔咯为磺化咔咯。在一些实施方案中，磺化咔咯为两亲的，可溶于生理溶液并且/或者通过非共价相互作用与多肽结合。在一些实施方案中，非共价相互作用为静电相互作用。在一些实施方案中，多肽为重组蛋白。在一些实施方案中，重组蛋白为重组融合蛋白。阴离子磺酸酯基团因由带负电荷的细胞膜产生的排斥作用而防止非特异性细胞进入，由此引导咔咯经由载体蛋白递送至靶细胞中。在一些实施方案中，咔咯包含金属化学元素。在这些实施方案中的一些中，金属为过渡金属。在一些实施方案中，金属为铁(Fe)、锰(Mn)或镓(Ga)。在其他实施方案中，咔咯为非金属化的。金属化和非金属化咔咯以可忽略的解离结合在蛋白质口袋中。作为一个说明性实例，图33中所描述的HerGa由磺化镓(III)咔咯(S2Ga)与HerPBK10组装而组成。HerGa在体外和体内抵抗咔咯转移至血清蛋白。咔咯与HerPBK10组装产生每一蛋白质25-35种咔咯，从而产生承受高速超滤的10-20nm圆形粒子(图33-B)。作为另一说明性实例，磺化锰(III)咔咯(S2Mn)与HerPBK10组装的HerMn形成约20nm圆形粒子(图33-C)。在一个实施方案中，HerGa除强烈地发荧光之外在全身递送之后在体内展现肿瘤优先性靶向，绕过包括心脏的大多数正常组织，并且在极低药理学剂量(0.008mg/kg)下引发肿瘤生长消除。在另一个实施方案中，HerMn在体内展现类似的肿瘤优先靶向和生长消除，并且虽然不发荧光，但使得能够经由磁共振(MR)产生更临床相关的成像。在这两个实施方案中，HerGa和HerMn造成ROS介导的细胞骨架和粒线体破坏。咔咯(诸如但不限于HerGA)靶向和/或结合在细胞稳态和肿瘤维持中重要的粒线体TSPO蛋白。类似地，也强烈地发荧光的磺化非金属化自由基咔咯(S2FB)(图33-C)可通过由酶产生的金属配体的螯合作用(图4C)直接与SOD1相互作用(图34-B)并且抑制SOD活性(图34-A)。在一个实施方案中，本文所描述的HerPBK10-咔咯粒子响应于pH值改变其荧光寿命。因此，咔咯粒子充当播报其紧邻的微环境状况的诊断探针。这一特征在细胞水平为适用的，诸如用于研究运输途径或亚细胞位置。这一特征在组织水平下也为适用的，诸如用于鉴别肿瘤生长的位点。作为一个非限制性实例，HerGa的荧光寿命视其在肿瘤还是肝脏组织(离体与体内)中而不同，由此使得能够通过光学成像来区分肿瘤与非肿瘤组织。作为另一非限制性实例，HerMn适合用于肿瘤检测，因为HerMn粒子防止咔咯与溶液中的水分子相互作用，然而肿瘤进入改进T1弛豫缩短和咔咯增强的对比度，暗示在组织摄入之后S2Mn咔咯从粒子释放。作为第三非限制性实例，在脊髓腔注射(ITinjection)之后，HerGa保留在肿瘤中持续延长的时间(长达并且包括30天)并且可检测，但在皮下注射时较快地从非肿瘤组织中清除。可部分地由HerPBK10促成的这一特征促成HerMn可能优于HerGd(Gd＝钆)的可能的优点，因为HerGd在注射之后快速清除。在另一个实施方案中，本文所描述的HerPBK10-咔咯粒子充当光敏化剂。在S2Ga的最大荧光波长下的光激发产生纯态氧，其诱导对已吸收HerGa的细胞的快速损害。尽管HerGa在不照射的情况下已展现充足的肿瘤毒性，但是在体外在424nm下的光激发大体上使HerGa的IC50降低成百上千倍。在次级吸收峰(约620nm)处的激发产生几乎一样有效的细胞死亡，因此使得能够使用更长的波长来进行照射，这将支持穿透到更深的组织中。在另一个实施方案中，本文所描述的咔咯纳米生物制品解决抗药性癌细胞。促成对HER2抑制的抗性的HER3升高使得这些肿瘤特别易于肿瘤靶向型咔咯治疗。因此，HER2抑制剂(诸如Tz)充当佐剂，通过引起HER3升高来使肿瘤对咔咯纳米治疗敏感。在一些实施方案中，归因于HER3介导的受体下调、粒子运输以及咔咯介导的对多个细胞内靶标的毒性的组合，肿瘤靶向型咔咯在抑制剂抗性肿瘤细胞上的治疗功效增强。在一个实施方案中，由咔咯粒子诱导的HER3群集、胞吞以及胞内裂解使HER3与HER2活化隔离开并且使信号传导内体钝化。除升高HER3有助于靶向抗性细胞之外，HerPBK10纳米粒子的多价性诱导HER3同源寡聚化和隔离远离HER2(及其他酪氨酸激酶)，因此防止HER3磷酰化和活化。HER3升高有助于形成配体诱导的HER3同型寡聚物，并且此类现象是抗性细胞所特有的。此外，通过使得能够进入细胞质中的胞内裂解作用对受体隐蔽囊泡的破坏使内体信号传导停止，同时支持咔咯递送至细胞内毒性靶标，因此为总细胞毒性作贡献。与这相符的是本发明人观测到单独HerPBK10在体外或体内不诱导肿瘤细胞增殖，尽管其衍生自信号刺激配体。在另一个实施方案中，咔咯通过在进入胞质之后快速转移至细胞蛋白质来避免药物外排。在囊泡逸出之后HerGa荧光遍布活细胞中的整个细胞质，而HerPBK10累积在核周边。此外，游离S2Mn而不是HerMn粒子在溶液中展现显著的T1弛豫缩短，然而HerMn在组织摄入后展现改进的T1缩短。如本文所用的术语“T1弛豫”是指自旋-晶格弛豫。此外，低pH值不使S2Ga从HerPBK10释放。这些发现总起来说明在进入胞质之后咔咯通过非pH依赖性机制从HerPBK10释放。此外，氧自由基诱导的对细胞骨架和线粒体的损害(此需要紧邻的ROS产生)的广泛影响说明咔咯总体上附着于并且伤害细胞器。因此，在细胞摄入之后咔咯快速转移至细胞内蛋白质，这帮助保持咔咯与药物外排转运体隔离开。在另一个实施方案中，通过组合互补咔咯活性来增大毒性并且成像。S2FB介导的SOD抑制、S2Ga或S2Mn介导的ROS升高以及S2Ga介导的TSPO抑制的组合通过组合互补活性而使毒性增大。此类方法还组合不同检测形态，诸如荧光和MRI。在一些实施方案中，肿瘤导向咔咯在体内靶向抵抗HER2抑制的HER2+肿瘤。在这些实施方案中的一个中，在体内抗性肿瘤的粒子分布与HER3有关。HER2-抑制剂抗性肿瘤(诸如BT-474R和JIMT-1)与亲本肿瘤(诸如BT-474)相比归因于升高的HER3而展现更高粒子累积速率。在这些实施方案中的一些中，体内肿瘤靶向是由HER3介导。在另一个实施方案中，与组合治疗相比，咔咯粒子对对HER2抑制剂具有后天获得的和预先存在的抗性的HER2+肿瘤产生改进的靶向毒性。在另一个实施方案中，HER2信号阻断抑制剂充当最佳化Her靶向咔咯纳米粒子介导型治疗的佐剂。在一些实施方案中，肿瘤导向咔咯在播散性癌症的免疫活性环境中经由HER3靶向TNBC肿瘤。在这些实施方案中的一些中，EGF-R抑制剂在体外诱导HER3升高并且使TNBC细胞对咔咯粒子敏感。在一个实施方案中，HerPBK10结合小鼠4T1细胞上的HER3，并且在人类BT-549细胞上HER3水平甚至更高，说明最佳化Her靶向咔咯纳米粒子引发对这些TNBC细胞系的靶向毒性。另外，与TNBC15上的对EGF-R抑制的抗性相关的HER3升高说明此类抑制剂使对这些细胞的最佳化Her靶向咔咯纳米粒子靶向作用和毒性增大。在另一个实施方案中，咔咯粒子在转移性与免疫活性环境中对TNBC模型为治疗有效的。BALB/c-4T1模型常用作TNBC和播散性癌症的模型。当移植至小鼠乳腺中时，4T1细胞形成肿瘤，所述肿瘤转移至肺和脑，从而代表阶段IV乳腺癌模型。这一同基因模型说明对播散性肿瘤的靶向毒性，并且评估最佳化Her靶向咔咯纳米粒子在完整免疫环境存在下的治疗功效。实施例以下实施例是为更好地说明所要求的发明而提供并且不应解释为限制其范围。在提及特定材料的情况下，其仅仅为出于说明的目的并且不旨在限制所要求的发明。本领域技术人员可在不运用创造能力并且不背离所要求的发明范围的情况下研制出等效手段或反应物。实施例1：化学治疗剂靶向递送至HER2+乳腺癌细胞在体外和体内在HER2+乳腺癌细胞上测试所公开的技术。如图2中所说明，为对药物递送分子进行工程改造以靶向HER2+乳腺癌，单元A包括称为HerPBK10的蛋白质，所述蛋白质是通过L.K.Medina-Kauwe等人,GeneTherapy,8:1753-1761(2001)中所描述的方法来产生，该参考文献以全文引用的方式并入本文中。HerPBK10含有融合至通过羧基(C)未端十赖氨酸加以修饰的细胞穿透腺病毒五邻体基底蛋白的调蛋白的受体结合结构域。HerPBK10的‘Her’区段是获自调蛋白-α的受体结合结构域，所述受体结合结构域与HER2/HER3或HER2/HER4亚基异二聚体特异性结合。虽然调蛋白直接与HER3或HER4而不是HER2相互作用，但是配体亲和力因HER2而极大地增强。因此，过表达HER2的肿瘤细胞(即HER2+肿瘤细胞)被认为是调蛋白引导的靶向的良好候选物。腺病毒血清型5(Ad5)五邻体基底蛋白的膜穿透活性被合并到HerPBK10的‘PB’区段中以有助于穿透到靶细胞中。‘K10’区段包括十个赖氨酸残基，其正电荷有助于通过亲电相互作用转运带负电荷的分子，诸如核酸。单元B包括两个互补寡核苷酸，其一起退火以形成小双链核酸。单元C包含化学治疗试剂Dox。这三种组分通过在室温下温育以两个步骤组装在一起。在步骤1中，将单元BDNA与单元CDox一起温育以形成DNA-Dox组装物(即单元B+单元C)。这是通过将Dox分子嵌插在脱核糖核酸碱基对之间来形成。在步骤2中，将DNA-Dox组装物与HerPBK10一起温育以形成称为HerDox的最终复合物(即单元A+单元B+单元C)。这种相互作用是通过带负电荷的DNA磷酸盐骨架与HerPBK10的带正电荷的聚赖氨酸尾部的亲电结合而形成。图3说明在其这一特定实施方案中操作所公开的递送系统的示意图，并且图11-B说明它与Dox的常规施用相比在体内的成功应用。通过使用所公开的递送系统，使Dox的递送靶向癌细胞；与常规递送Dox相比相对较高量的药物被递送至癌细胞，并且相对较低量的药物到达非靶健康组织。实施例2：HerDox在组装期间是高度稳定的HerDox由三种组分组成：Dox；小双链核酸(其直接负责运载Dox)；以及所靶向的蛋白质HerPBK10。HerDox是以两个步骤进行组装。首先，将Dox与DNA混合以通过DNA嵌插形成DNA-Dox对。然后，将DNA-Dox对与HerPBK10混合以通过亲电相互作用形成HerDox。为使DNA-Dox与游离Dox分离，混合物经历超滤离心。本发明人发现添加到DNA中的Dox有>95％在超滤旋转期间不从DNA释放，指示甚至在高速旋转期间的高药物截留率(图4-A)。来自此旋转的截留物和滤液的吸收光谱证实截留物的吸光度最大值与未过滤的Dox一致，然而在滤液中未能检测到这样的吸光度(图4(B))。然后，将截留物与HerPBK10一起温育并且通过高效液相色谱法(HPLC)尺寸排阻分离将所得HerDox复合物与游离组分分离。在此，本发明人的研究表明如通过SDS-PAGE的洗脱级分(图5)所确认，Dox吸光度大部分与HerPBK10共洗脱(图5)。实施例3：HerDox在储存期间并且在血清中是高度稳定的本发明人历时12天在不同储存温度(40℃、室温或37℃)下测试了HerDox的稳定性。在每一天，样品经历超滤，然后测量滤液和截留物以确定是否有任何Dox从复合物释放。在4℃下，100％的产物保持完整长达12天，并且有趣的是，室温和37℃似乎使药物合并到HerDox产物中增强(图6-A和6-B)。总的来说，这些发现表明HerDox保持稳定并且在不同温度下长期储存之后不释放Dox。本发明人还检验了HerDox在37℃下在含血清的培养基中的稳定性。将固定在镍琼脂糖上(经由HerPBK10组氨酸标签)的HerDox在37℃下在完全(即含有10％胎牛血清)培养基(用于模拟组织培养条件)中温育不同的时间，然后沉淀珠粒并且测量上清液的Dox释放。还通过在每个时间点从珠粒洗脱缀合物来评估Dox在缀合物中的截留率。本发明人观测到血清未产生Dox从缀合物的显著释放，所述显著释放将通过'(+)血清'样品中Dox滤液吸光度增加来检测(图6-B，上部图)，并且在每个时间点Dox由缀合物完全保留(图6-B，下部图)。实施例4：HerDox产生靶向毒性而单独Dox则不产生本发明人比较了等效剂量(就Dox浓度来说0.5μM)的HerDox或单独Dox在单独的盘中对HER2+和HER2-乳腺癌细胞的影响。到三天时，HerDox使HER2+细胞数目降低超过75％，而HER2-细胞存活率未受影响(图7)。等效浓度的单独Dox使HER2+与HER2-细胞两者降低相同的数量级(图7)。这些发现通过表明非靶向型药物影响非靶(即HER2-)细胞而强调了靶向的重要性。重要地，单独的蛋白质载体HerPBK10在于HerDox中的等效蛋白质浓度(0.1μM)下对任一细胞系均没有影响(图7)，包括缺乏增殖诱导。为测试受体靶向，本发明人使用游离调蛋白配体(Her或eHRG)作为竞争性抑制剂。游离配体完全抑制由HerDox产生的细胞杀灭作用(图8)，表明HerDox经由调蛋白受体结合并且进入细胞。作为最终体外激发，本发明人测试了HerDox在HER2+与HER2-乳腺癌细胞的混合培养物中是否诱导尤其对HER2+细胞的毒性。为此，本发明人制备了用标记有绿色荧光蛋白(GFP)的HER2-细胞系以便在混合培养物中进行细胞鉴定(图9-A)。本发明人发现HerDox几乎完全地降低非GFP(HER2+)细胞增殖，而GFP(HER2-)细胞生长未改变(图9-B)。总的来说，这些发现表明HerDox具有优先使毒性靶向HER2+细胞的能力。重要地，所有这些实验均在完全(即含血清)培养基中执行，因此表明尽管存在血清蛋白HerDox还是靶向细胞。此外，在HER2+与HER2-细胞的混合培养物中对HER2+细胞的优先细胞杀灭作用暗示在靶细胞死亡和溶解后，释放到那些细胞中的Dox不能继续诱导对HER2-细胞的毒性。为进一步证实HerDox在细胞培养物中的稳定性，在单独的实验中在所指示的时间点从培养基中回收HerDox并且在琼脂糖凝胶上进行电泳，然后通过UV照射所述琼脂糖凝胶以检测Dox，并且用考马斯蓝染色以检测HerPBK10蛋白(图9-C)。由于凝胶不保留游离Dox，Dox荧光随时间推移而损失将表明缀合物释放Dox。在含血清的培养基中，未能检测到来自HerDox的这种损失。在不含血清的条件下，到1h时Dox荧光似乎会降低，然而考马斯蓝染色表明降低的荧光是归因于较少样品加载至凝胶泳道中。HerPBK10条带的共迁移进一步证实缀合物在细胞培养基中保持完整。与较早描述的血清稳定性分析一起，这些发现表明缀合物在细胞培养物(其常规含有至少10％血清)中长期温育期间保持完整。实施例5：GFP-Her提供体内靶向的指数为感觉到配体在体内的靶向能力并且建立体内靶向指数，本发明人使用了绿色荧光蛋白(GFP)-标记的配体(GFP-Her)。重要地，这些配体与HerPBK10的‘Her’结构域同一。他们经由双侧注射MDA-MB-435细胞在6-8周雌性裸鼠中形成了HER2+肿瘤。当肿瘤达到250-300mm3(肿瘤细胞植入之后-3-4周)时，经由尾部静脉注射3nmol的GFP-Her。模拟注射的小鼠接收单独的生理盐水。在注射之后3.5小时收获所指示的组织并且使用XenogenIVIS三维小动物体内成像系统(Xenogen,Alameda,CA)关于GFP进行成像。检测到相较于其他组织在肿瘤中GFP荧光的优先累积(图10)。在肝脏和肌肉中检测到低到可忽略水平的荧光，而在包括心脏的其他组织中未能检测到GFP荧光(图10)。来自模拟处理的动物的组织显示无荧光。实施例6：HerDox在体内靶向HER2+乳腺癌细胞Dox当适当波长激发时发出红色荧光，其用于检测HerDox全身递送之后的生物分布。带有4-周龄肿瘤(～700-800mm3)的小鼠接收单次Dox或HerDox尾部静脉注射(就Dox浓度来说0.008mg/mL)，并且使用定制的大型照射和检测系统采集实时捕获的活小鼠或在注射后三小时收获的器官/组织的图像。在HerDox注射之后10min在整个主体中荧光是明显的，然后到20min时在肿瘤处快速累积并且在注射之后长达100min在肿瘤中仍然可检测到(图11(A))。在HerDox注射之后～3h收获的组织和肿瘤显示在肿瘤中有强烈的荧光，而在肝脏中可检测到大体上低水平的荧光(图11(B))。在肾脏中仅仅可检测到一些荧光，而包括心脏、脾脏、肺脏以及骨骼肌的其他组织不展现任何荧光。相比之下，从注射等效剂量的Dox的小鼠收获的组织在肝脏、肿瘤以及肾脏中展现可检测的荧光。在肺脏和骨骼肌中也可检测到较低水平的荧光。为评估体内肿瘤毒性，带有3-4周双侧肿瘤的小鼠开始每天接收Dox或HerDox(就Dox浓度来说0.004mg/kg)、单独HerPBK10(以等效于HerDox的蛋白质浓度)或生理盐水的尾部静脉注射持续7个连续日。从尾部静脉注射之前2周开始在整个肿瘤生长期间测量肿瘤，并且表明虽然Dox使肿瘤生长减慢，但HerDox基本上阻止了肿瘤生长，而单独HerPBK10和生理盐水没有效果(图12(A))。在处理或对照小鼠中未观测到随时间推移可感知的重量减轻(图12(B))。在注射之后25天，收获肿瘤和器官并且加工以便进行组织化学分析。已确定Dox可诱导急性和长期心脏毒性，因此本发明人检验了用HerDox或Dox处理的小鼠的心脏。Dox处理的小鼠的心脏似乎相对于HerDox和生理盐水处理的小鼠的心脏略微增大和扩张(图中未示)，暗示与Dox毒性相关的扩张型心肌病。生理盐水处理的小鼠的心肌展现正常心脏形态，然而Dox处理的小鼠的那些展现局灶性变性、肌纤维损失、细胞质空泡化增加以及核固缩或溶解，这代表Dox诱导的心脏毒性，然而HerDox处理的小鼠的心肌显示与生理盐水处理的小鼠类似的形态(图12-C)。与这些发现相符合，为评估所处理的小鼠的心脏功能而获得的超声心动图显示Dox诱导的功能障碍的迹象，在HerDox处理的小鼠中未检出所述迹象：然而Dox诱导心搏量、心输出量以及左心室内径和容积的适度至明显的降低，HerDox对这些测量没有影响并且似乎类似于模拟(生理盐水)处理的小鼠(图12-D)。为评估测量体内稳定性的可行性，本发明人将HerDox(在0.12mg/mL最终Dox浓度下)或游离Dox以等效浓度在从新收集的小鼠全血中进行温育并且将混合物在37℃下温育长达一个小时。作为抗凝剂，0.5mMEDTA存在于血液收集物中，平行样品是在37℃下在单独的EDTA中温育。代表输入的HerDox(在血液中温育之前)的样品是在370C下在HEPES-缓冲盐水中温育。然后通过1OKMW截止过滤器将所有样品离心，并且测量截留物和滤液中的Dox荧光(SpectraMaxM2，来自MolecularDevices)。结果表明如通过缺乏HerDox的滤液荧光的可检测增加所证实，尤其与在HBS或EDTA中温育的HerDox或游离Dox相比，缀合物中没有可检测的Dox损失(图13)。同样地，与在生理盐水或单独EDTA中温育的样品相比，在血液中温育的样品的HerDox截留物中没有可感知的Dox损失(图13)。与生物成像结果结合起来，这些发现表明HerDox在血液中保持完整并且在体内在朝向肿瘤靶标运输时保留稳定性。实施例7：HerDox机制：Dox在细胞质中释放并且在细胞核中累积单独HerPBK10不诱导细胞死亡(图7)，因此是Dox递送至细胞中有助于由HerDox产生的细胞杀灭作用。为理解HerDox介导的肿瘤细胞死亡的机制，在用HerDox处理之后本发明人用显微镜检验了HER2+细胞，使用Dox荧光来检测细胞内位置。在施用之后早期(在摄入0min时)，HerDox似乎大部分在细胞周边，表明缀合物是结合在细胞表面但尚未内化(图14-A)。相比之下，已在细胞内部在核周边发现了游离Dox(图14-A)。在60min时，当大部分调蛋白靶向型蛋白质已进入细胞时，Dox已在细胞核中累积，这类似于游离Dox(图14-A)。除早期靶向结果之外，这些动力学支持受体介导的HerDox进入机制。当通过HerPBK10递送时甚至Dox的核内模式都不同于游离Dox。尽管非靶向型Dox在细胞核中累积，但HerDox优先在核仁结构中累积，并且仍可见一些胞质荧光(图14-B)。为确定Dox在摄入期间是否仍然附着于HerPBK10，本发明人使用了针对HerPBK10的免疫荧光。在摄入15min时，HerPBK10大部分与Dox共同定位，表明HerDox的实质群体仍是完整的，不过已可见一些Dox核累积(图15)。在30和60min时，增加水平的Dox在细胞核中累积，而大部分HerPBK10保留在细胞质中(图15)。在固定的细胞中，未能如在活细胞中那样检测到核仁累积(图14(B))。总地来说，这些发现表明HerPBK10将Dox递送至细胞中并且在其经历核累积的情况下在细胞内释放Dox，这与递送机制相符合(图11-B)。实施例8：人类血清对细胞结合没有显著影响为确定HerPBK10是否与可能存在于血清中的循环配体竞争，本发明人测试了HerPBK10与获自HER2+患者的人类血清中的HER2+乳腺癌细胞的结合。位于Cedars-Sinai的女性癌症研究协会(Women’sCancerResearchInstitute)偶然采集了有限量的患者血清，其中来自HER2+患者的血清占甚至更少数。值得注意的是，在此所用的人类血清实际是从所收集的HER2+和年龄匹配的HER2-患者的全血分离的血清和相关蛋白的一部分。早期实验证实HerDox结合含有10％牛血清的完全培养基中的细胞靶标，并且这种结合受到过量游离配体的竞争抑制。在此，本发明人将常规培养基中的牛血清用获自所采集的患者样品的人类血清代替，以评估尤其来自HER2+患者的人类血清是否抑制细胞结合。本发明人确保细胞在治疗之前接受了充分的人类血清暴露(2小时，这为任何循环配体提供充裕的受体结合时间)。在来自HER2+患者、HER2-患者的血清或牛血清中的细胞结合的头对头比较显示无显著差异(图16)，表明在此所测试的人类血清不妨碍HerPBK10与靶细胞结合。在存在100x调蛋白配体(+Her)的情况下的竞争性抑制证实对照结合活性具调蛋白受体特异性。实施例9：所提出的细胞类型上的HER亚基水平和细胞毒性(cytoxicity)本发明人测量了在本文所描述的各种细胞系和类型上HER亚基的细胞表面水平，因为先前所描述的水平可能不反映所用的可获得的细胞中的实际水平。本发明人从ATCC和NIH/NCI获得了所指示的细胞系，并且就HER亚基水平对这些细胞系进行了描绘(图17(A))。为评估HerDox是否根据HER2水平诱导毒性，本发明人选择了以相对高(SKBR3)、中(MDA-MB-435、MDA-MB-453、HeLa)以及低到不可检测(MDA-MB-231)的水平呈现HER2的细胞系，并且完成了细胞毒性剂量曲线。本发明人观测到，HerDoxCD50与这些所选细胞系上的细胞表面HER2水平负相关：呈现相对高HER2的细胞系对HerDox显示相对较高敏感性，而呈现低HER2的细胞系展现低敏感性，并且呈现中HER2水平的细胞系同样展现中敏感性(图17(B)；CD50是在对数刻度上示出)。实施例10表1-对细胞系的细胞毒性细胞系HER2*EC50**(uMHerDox)MDA-MB-2310.06±0.0067.2e5±0.11MDA-MB-4350.52±0.080.74±0.07T47D1.03±0.260.64±0.04SKOV31.79±0.190.18±0.03*如ELISA所测定的相对细胞表面水平(平均值±1SD)。N＝3个孔。**如HerDox剂量曲线的通过非线性回归分析所测定的产生细胞存活率50％降低的浓度(平均值±ISD)。每次剂量N＝3个处理孔。实施例11：HerPBK10的最佳化由于HerPBK10蛋白来源于腺病毒五邻体基底蛋白，所以其天然结合靶标为α-v整合素，本发明人评估了Arg-Gly-Asp(RGD)整合素结合基序的突变是否改善蛋白质将货物递送到细胞中的能力。虽然先前的研究表明五邻体基底附加调蛋白受体结合配体使其几乎排他地重定向至调蛋白受体(如通过竞争性抑制分析所证实)，但是有可能HerPBK10仍会推选新的整合素受体，从而可能使蛋白质重定向至不同的细胞内途径或竞争蛋白质本身上的结合位点。通过点突变赋予EGD以RGD基序使得不能结合整合素。因此，产生带有这种突变的突变蛋白HerPBrgdK10，并且测试与亲本HerPBK10相比的基因递送情况。在等效蛋白质浓度下，HerPBrgdK10展现基因转移的中度(～1.8倍)至显著(～18倍)增强(图18)，这可反映增强的受体结合或结合后活性。实施例12：DNA构建体本发明人使用常见的含有序列5’-ATCGAAGGATCCATGCGGCGCGCGGCGATGTAT-3’(SEQIDNO:12)的5’寡核苷酸引物来从pJMl7腺病毒基因组模板扩增野生型与赖氨酸标记过的五邻体序列。3’引物的序列为PB：5’-GCATCAGAATTCTCAAAAAGTGCGGCTCGATAG-3’(SEQIDNO:1)和PBK105’-CATGAATTCA(TTT)10AAAAGTGCGGCTCGATAGGA-3’(SEQIDNO:2)。在5’引物中引入BamHI限制位点并且在3’引物中引入EcoRl限制位点，以便将野生型与赖氨酸标记过的五邻体框内插入pRSET-A细菌表达质粒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。这一质粒以N-末端组氨酸标记融合物的形式表达重组蛋白以便通过镍螯合物亲和色谱法来进行亲和纯化。使用聚合酶链反应(PCR)扩增来将编码短聚甘氨酸接头的序列添加到PBK10的氨基(N)-末端。编码接头的序列含有用于额外的克隆的5OcII限制位点。调蛋白靶向配体是通过调蛋白基因29的表皮生长因子(EGF)样结构域的PCR扩增来制备，使用含有BamHI位点的5’寡核苷酸引物和含有用于PBK10情况下的框内克隆的SacU位点的3’引物。将靶向配体添加到赖氨酸标记过的构建体中，以通过将PCR产物仅N端连接至PBK10来形成HerPBK10。Her和GFP-Her的构建先前已有描述(Medina-KauweL.K.等人,BioTechniques2000,29:602-609)。HerK10是通过Her构建体的PCR扩增来形成，使用5’Her引物(Medina-KauweL.K.等人,BioTechniques2000,29:602-609)和含有序列5’-ATGAATTCA(TTT)10AGATCTACTTCCACCACTTCCACC-3’(SEQIDNO:3)的3’寡核苷酸引物。实施例13：DS-寡核苷酸长度不影响Dox合并到靶向型复合物中Ds-寡核苷酸双螺旋由互补的30bp序列LLAA-5(SEQIDNO:6)和LLAA-3(SEQIDNO:7)或48bp序列BglIIHis-5(SEQIDNO:8)和BglIIHis-3(SEQIDNO:9)形成。将Dox在10mMTris/HCl缓冲液(pH8.0)中在室温下以1:10、1:20或1:40摩尔比双螺旋:Dox(以20、40或80μM的最终Dox浓度)添加到各组退火双螺旋中持续30分钟。然后通过超滤膜(MicroconUltracelYMlO；Millipore)在10,000xg下将混合物离心以将游离Dox与合并的Dox分离。分开地收集截留物和滤液，并且使用SpectraMaxM2读板仪(MolecularDevices)在480nm下测量各自的吸光度。结果(图19)表明在使用30或48bp双螺旋的Dox合并中不存在可感知的差异。实施例14：HerDox对神经胶质瘤细胞是毒性的通过非透化免疫组织化学评估U251人类神经胶质瘤细胞的HER亚基水平，并且发现呈现相对明显的细胞表面HER2、HER3以及HER4水平(图20(A))。将在盘中生长的U251细胞与HerDox或Dox(在0.5μM或1μM下)在培养基中在37℃，5％CO2下一起温育4小时，然后添加新鲜的完全培养基，以使最终培养物体积增加约四倍，并且使细胞维持在37℃，5％CO2下四天。将细胞胰蛋白酶化并且在最后一天计数。本发明人的结果表明HerDox与等效浓度的Dox相比对U251细胞展现大8-10倍的毒性，并且同样地，低10倍的HerDox引发与Dox相同的毒性(图20(B))。实施例15：测试包含修饰过的衣壳蛋白、ds-寡核苷酸以及DNA嵌插物的最佳化复合物在体内对HER2+肿瘤的靶向和治疗功效。抗性肿瘤细胞呈现升高的HER3和增大的HerDox敏感性。对曲妥珠单抗具有获得性抗性的HER2+乳腺癌细胞系与亲本细胞系(BT474和SKBR3)相比呈现升高的细胞表面HER3水平(图21-A)，这与其他地方表明HER3升高与耐药性相关的研究一致。在培养物中在BT474和SKBR3亲本以及曲妥珠单抗抗性细胞系上将HerDox治疗与曲妥珠单抗和曲妥珠单抗+帕妥珠单抗组合治疗进行比较。各治疗剂是以先前关于引发治疗功效所建立的浓度范围来施用。曲妥珠单抗(Tz)使亲本BT474细胞存活率降低50％并且添加帕妥珠单抗(Pz)不显著地增加细胞死亡(图21B)。两种方案均对BT474抗性细胞无效。在BT474亲本细胞上HerDox与Tz和Tz+Pz相比显示较高细胞死亡，并且完全杀光BT474抗性细胞。基于SKBR3的发现是类似的，因为亲本与抗性细胞均显示几乎不对单独Tz或组合治疗(Tz+Pz)起反应(图21B)。相比之下，HerDox引发亲本SKBR3的50％细胞死亡，以及SKBR3抗性细胞的>80％细胞死亡。还基于具有预先存在的抗性的细胞系对HerDox的功效进行了检验。JIMT-1细胞系衍生自从不对曲妥珠单抗治疗起反应的肿瘤。这些细胞仍然在广泛浓度范围内对Tz和Tz+Pz无反应(图21-C)。相比之下，HerDox产生剂量依赖性细胞死亡并且杀灭高达90％的细胞(图21-C)。另外，与单独Tz和Dox相比之下，向带有JIMT-1肿瘤的小鼠全身递送HerDox消除了肿瘤生长(图22)。曲妥珠单抗预处理使HER2+细胞对HerDox敏感。先前研究已表明，HER2抑制之后4小时HER3立即因拉帕替尼或基因沉默而在转录和翻译上有所升高。相较于亲本细胞，HerDox对Tz抗性细胞的增强的功效表明曲妥珠单抗可充当HerDox的佐剂，从而诱导HER3升高以使HerDox导向至抗性细胞增加。为测试这一点，在HerDox治疗之前将亲本和抗性细胞系用曲妥珠单抗预处理4或24小时。在亲本SKBR3细胞上HerDox与曲妥珠单抗相比已展现改善的细胞杀灭作用，同时在所测试的最高剂量下预处理使毒性再增大40-50％(图23A)。相较于曲妥珠单抗，HerDox对亲本BT474细胞的毒性适度地提高，但用曲妥珠单抗4h预处理使HerDox毒性再提高50％，并且24h预处理使毒性能够提高近75％(图23B)。甚至已对HerDox敏感的HER2-3表达MDA-MB-435细胞当用曲妥珠单抗24h预处理时也显示适度的毒性增强(图23C)。另一方面，Tz抗性细胞系已对HerDox展现强敏感性并且因此预处理在大多数情况下是不必要的(图23D-F)。Tz抗性BT474细胞特别地在所测试的所有HerDox浓度下经历完全细胞死亡(图23E)。因此，降低HerDox浓度以评估曲妥珠单抗预处理是否会具有任何影响。低五倍的HerDox浓度仍对细胞存活率具有有力的影响，并且曲妥珠单抗预处理进一步增强细胞毒性(图23F)。总的来说，这些发现表明曲妥珠单抗可充当适用于HerDox治疗的佐剂。实施例16：HerPBK10对HER3具特异性。图26说明HerPBK10对HER3具特异性，因为HerPBK10与含有人类HER3的细胞外结构域的固定肽结合，这因在体外用游离HER3肽预吸附HerPBK10而受抑制(图26-A)。同样的预吸附还抑制HerPBK10与培养物中的HER2+细胞结合(图26-B)。重要地，HER2与HER3的二聚化不为HerPBK10结合所需的，因为异二聚体阻断抗体帕妥珠单抗(Pz)不阻止HerPBK10与其在HER2+细胞上的受体结合(图26-B)。结合也不受HER4肽或β细胞素(其阻断HER4)抑制(图26-B)。实施例17：受体结合不受患者血清抑制。来自五个HER2+患者和年龄匹配的对照的血清不阻止HerPBK10与培养物中的HER2+细胞结合并且彼此之间被显示无显著差异。因此，受体结合不受患者血清抑制。在免疫活性小鼠中以治疗水平和高10倍的水平重复投用HerPBK10不产生针对蛋白质的可检测的中和抗体形成。实施例18：抗性肿瘤细胞呈现升高的HER3和增大的HerDox敏感性。图27(A)说明对曲妥珠单抗具有获得性抗性的HER2+乳腺癌细胞系(使用用增加浓度的HER2抑制剂的长期培养标准方案)与亲本细胞系(BT474和SKBR3)相比呈现升高的细胞表面HER3水平。这一结果与本领域中已知的HER3升高与耐药性相关的知识相符合。将HerDox对癌细胞的作用与(i)曲妥珠单抗以及(ii)曲妥珠单抗(Tz)与帕妥珠单抗(Pz)的组合治疗相比较。在培养物中对BT474和SKBR3亲本和曲妥珠单抗抗性细胞系执行实验。各治疗剂是以先前所建立或本领域中已知的关于引发治疗功效的浓度范围来施用。Tz使亲本BT474细胞存活率降低50％；添加Pz不显著增加细胞死亡(图27-B)。两种方案均对BT474抗性细胞无效。另一方面，在BT474亲本细胞上HerDox与Tz和Tz+Pz相比显示较高细胞死亡率，并且有效地消除了BT474抗性细胞。在SKBR3细胞系中也获得了类似结果。亲本与抗性细胞均显示几乎不对单独Tz或组合治疗(Tz+Pz)起反应(图27-B)。相比之下，HerDox引发50％亲本SKBR3细胞死亡，以及SKBR3抗性细胞的>80％细胞死亡。因此，这些结果表明抗性肿瘤细胞呈现增大的HerDox敏感性。HER3对靶向毒性的贡献是通过评估用包含HER3的配体结合结构域的肽预吸附HerDox是否阻断细胞毒性来评估。尽管HerDox对亲本以及抗性细胞系引发显著的细胞死亡，但这受HER3肽抑制(图27-C)，表明在配体引导的Dox有效负荷递送中发生了细胞死亡。图27(E)示出HerDox对具有预先存在的抗性的细胞系的功效。JIMT-1细胞系衍生自从不对曲妥珠单抗治疗起反应的HER2+肿瘤。这些细胞仍然在广泛浓度范围内对Tz和Tz+Pz无反应，并且对Dox仅部分起反应。相比之下，HerDox产生剂量依赖性细胞死亡并且消除了高达90％的细胞(图27-E)。最后，在与HerDox相同的药物剂量(每次注射0.004mgDox/kg)下，与单独Tz和Dox相比之下，向带有JIMT-1肿瘤的小鼠全身递送HerDox消除了肿瘤生长。事实上，与模拟生理盐水治疗相比，单独Tz或Dox对肿瘤生长的影响仅略有一点(图28)。因此，这些结果表明在抗性肿瘤细胞上HerDox引发显著的细胞死亡。实施例19：曲妥珠单抗使HER2+细胞对HerDox敏感。图29(A)表明体外Tz预处理使亲本细胞中的HER3升高(图29-A)，使HerPBK10与这些细胞的结合增强(图29-B)，并且使HerDox对这些细胞的毒性增强(图29-C、29-D)。在HerDox治疗之前将亲本和抗性细胞系用Tz预处理4或24小时。在亲本SKBR3细胞上HerDox与Tz相比已展现改善的细胞杀灭作用，同时在所测试的最高剂量下预处理使毒性再增大40-50％(图29-C)。相较于亲本细胞，HerDox对Tz抗性细胞的增强的功效表明曲妥珠单抗充当HerDox的佐剂，从而诱导HER3升高以使HerDox导向至抗性细胞增加。相较于Tz，HerDox对亲本BT474细胞的毒性适度提高，但用曲妥珠单抗四小时预处理使HerDox毒性再提高50％，并且24小时预处理使能够毒性提高近75％(图29-D)。甚至已对HerDox敏感的HER2-3表达MDA-MB-435细胞当用Tz24小时预处理时也显示毒性适度增强(图29-E)。另一方面，Tz抗性细胞系已对HerDox展现强敏感性并且因此预处理在大多数情况下是不必要的(图29-F、29-G)。Tz抗性BT474细胞特别地在所测试的所有HerDox浓度下经历完全细胞死亡(图29-G)。因此，降低HerDox浓度以评估曲妥珠单抗预处理是否会具有任何影响。低五倍的HerDox浓度仍对细胞存活率具有有力的影响，并且Tz预处理进一步增强细胞毒性(图29-H)。总的来说，这些发现证实Tz充当适用于HerDox治疗的佐剂。类似地，帕妥珠单抗、拉帕替尼、T-DM1也充当HerDox治疗的佐剂。实施例20.与曲妥珠单抗相比HerPBK10摄入更快并且更有效。制备荧光标记过的HerPBK10来评估与标记过的Tz相比其生物分布和细胞摄入。将等效剂量的各试剂注入带有HER2+肿瘤的小鼠的尾部静脉。在注射之后四小时收获用于成像的组织。将两种试剂与标记过的非靶向型蛋白质BSA相比较。HerPBK10和Tz显示等效水平的肿瘤累积(其均高于BSA)，并且几乎不存在递送至心脏、脾脏以及肌肉(图30-A)。然而，Tz递送至诸如肝脏、肺脏以及肾脏等其他非肿瘤组织高于HerPBK10。与Tz相比之下，HerPBK10未显示肺脏递送(图30-A)。还评估了HER2+MDA-MB-435细胞中的摄入。这些细胞中的细胞表面受体水平由图30-B中的图形示出。在细胞摄入之后45min内，HerPBK10展现细胞表面群集继之以显著的胞吞作用(图30-B)。相比之下，尽管与这些细胞上的HER3相比HER2水平升高，但是Tz在细胞表面上展现稀疏的结合，在细胞结合之后其在细胞上的稀疏点状区域中保留长达两小时(图30-B)。这些结果表明与Tz相比HerPBK10摄入更快速并且更有效。实施例21：HerPBK10与曲妥珠单抗相比在相较于HER2表达升高的HER3的患者肿瘤组织上展现较高程度的结合。为确定本申请中所描述的纳米粒子是否能够识别人类组织上的HER3，从HER2+患者的手术标本获得乳房肿瘤组织。检验组织以确定HerPBK10是否经由HER3结合这个组织。图31表明HerPBK10和Tz均展现与从这一肿瘤样品分解的细胞的浓度依赖性结合，其中HerPBK10与Tz相比展现更大程度的结合(图31-B)。这条结合曲线与在肿瘤细胞表面上测得的升高的HER3以及非常低的HER2相关联(图31-A)。实施例22：HerPBK10识别小鼠HER3。获自BALB/c小鼠乳房肿瘤的小鼠4T1细胞为三阴性的并且已在BALB/c小鼠中用作同基因TNBC模型。HER3在4T1的细胞表面上以显著水平表达(图32-B)，由HerPBK10识别(图32-C)，并且受到人类HER3肽的竞赛抑制(图32-C)。HerPBK10与小鼠HER3的受体特异性结合反映小鼠与人类HER3之间的高水平的氨基酸序列同一性：在整个蛋白质上有91％同一性，而在调蛋白结合区(细胞外结构域I和II)中则为94％(图32-A)。这些发现表明BALB/c-4T1模型可用于测试免疫活性环境中的靶向作用。此外，HerPBK10对小鼠HER3的识别提高了我们的现有发现在异种移植模型中的临床相关性：HerDox即使在其识别小鼠中的内源性HER3时也显示优先肿瘤靶向毒性。重要地，也衍生自TNBC的人类BT-549细胞在细胞表面上呈现升高的HER3(图32-B)并且提供要靶向的另一TNBC细胞系。实施例23：五邻体基底结构域为穿透至胞质液中所需的。HerPBK10的缺少PB结构域的缺失突变体未能将S2Ga递送至细胞的细胞质中。这证实HerPBK10的五邻体基底结构域为在受体介导的摄入之后内体膜穿透所需的。实施例24：通过定向进化产生的细胞内运输突变体。应用定义进化和噬菌体展示生物淘选来分离潜在地具有增大的细胞内运输活性的五邻体基底结构域的蛋白质变异体。这一技术需要随机诱变重组五邻体基底基因、在T7噬菌体上表达所得突变体文库并且在培养物中在HeLa细胞(其内吞五邻体基底)上筛选噬菌体文库。为筛选而施加的“选择压力”由以下组成：分离展现加强的胞质和/或核分配(表明蛋白质有助于完全穿透至细胞中)的突变体，以及运输至所需的亚细胞区室(图35-A)。分离具有点突变的若干截短和全长变异体，将其克隆至HerPBK10中，置换五邻体基底结构域(图35-B)。与亲本蛋白质(野生型HerPBK10)相比，这些全长突变体中的两个(111C和333F)显示向胞质、细胞骨架以及核区室中的增强的分配(图35-C)，而截短变异体(即TM)无法逃脱内体(图35-D)。实施例25：S2Ga与TSPO相互作用。探索咔咯毒性机制的研究揭示，HerGa引起过氧化物介导的对细胞骨架以及线粒体膜通透性的损害，从而导致凋亡性死亡。图36-A和36-B表明S2Ga直接结合线粒体外膜蛋白TSPO(图36A-B)。TSPO使卟啉和其他代谢产物转位至线粒体中以便加工以及与线粒体通透性转变孔复合物的组分相互作用，并且是细胞稳态的关健，因为TSPO的敲出在小鼠中具胚胎致死性。S2Ga具体地说识别TSPO上的卟啉结合位点(图36A-B)，因为S2Ga结合受到抑制卟啉与TSPO结合的PK11195的竞赛抑制。重组可溶性TSPO在MDA-MB-435细胞中的过表达防止HerGa介导的线粒体膜电位破坏(图36C-D)，证实HerGa原位地与TSPO相互作用。实施例26：HerMn实现靶向毒性和MR检测。尽管HerGa的荧光属性确定了咔咯作为显像剂的用途，但是光学成像的临床适用性受激发波长和再发射波长的有限穿透深度的约束。因此，使用替代金属化咔咯，所述替代金属化咔咯当与HerPBK10组合时与HerGa一样具细胞毒性，但带有充足的对比度特性，从而能够使用诸如磁共振成像(MRI)等临床相关形态来检测。HerMn在培养物中对HER2+但不对HER2-肿瘤细胞展现靶向毒性，而S2Mn对细胞存活率没有影响(图37)。HerMn通过过氧化物升高而使线粒体膜电位(图38-A)和细胞骨架(图38-B)崩溃。HerMn在全身递送之后在体内导向至肿瘤，绕过包括心脏的大多数正常组织(图39)，并且与游离S2Mn、单独HerPBK10或生理盐水治疗相比之下，在极低药理学剂量(0.008mg/kg)下消除肿瘤生长(图40-A)。在溶液中，HerMn粒子与游离S2Mn相比展现有限的T1(自旋-晶格)弛豫缩短(图41-A)，表明封装在蛋白质粒子中防止接近水分子。然而，HerMn在体内的递送产生明显的T1弛豫降低以及肿瘤中的MRI对比度增强，包括与游离S2Mn和Gd相比(图40-B)，表明咔咯在组织摄入之后从粒子释放。咔咯长期截留在肿瘤组织中表明与Gd的快速清除相比HerMn可充当持续更久的对比剂。实施例27：HerGa和HerMn对人类心球衍生细胞(CDC)为无毒的。为评估可转移性，检验了人类心球衍生细胞(CDC)在HerGa和/或HerMn存在下的活力。与具有已知心脏毒性的Dox相比之下，HerGa、HerMn以及单个组分(单独HerPBK10、单独S2Ga以及单独S2Mn)的浓度逐步增加对CDC活力没有可检测的影响(图40-B)。实施例28：抗性肿瘤细胞呈现升高的HER3和增强的HerPBK10结合。与亲本细胞系(BT474和SKBR3)相比，对Tz具有获得性抗性的HER2+乳腺癌细胞系(用增加浓度的HER2抑制剂使用长期培养标准方案)呈现升高的细胞表面HER3水平(图42-A、43-A)，这与本领域中HER3升高与耐药性相关的知识相符合。衍生自从不对Tz治疗起反应的HER2+肿瘤的JIMT-1乳腺癌细胞系与HER2相比还展现升高的HER3(图42-B)。在HER2抑制之后四小时HER3立即因Lp或基因沉默而在转录和翻译上有所升高。使亲本细胞系暴露于Tz24小时并且然后测量与未处理的亲本细胞相比的细胞表面HER3水平。不仅Tz处理产生升高的HER3水平，而且HerPBK10与这些细胞结合也成比例地增加(图42-C、42-D)。作为评估本文所描述的纳米粒子是否能够识别人类组织上的HER3的方法，从HER2+患者的手术标本获得乳房肿瘤组织并且检验HerPBK10是否可经由HER3结合这些组织。发现HerPBK10与Tz两者展现与从这一肿瘤样品分解的细胞的浓度依赖性结合，其中HerPBK10与相比Tz显示更大程度的结合(图42-F)。这条结合曲线与在肿瘤细胞表面上测得的升高的HER3以及非常低的HER2相关联(图42-E)。实施例29：HerGa在体外和体内对Tz抗性肿瘤细胞展现增强的毒性。在BT474亲本和Tz抗性细胞系上比较HerGa与Tz和组合治疗(Tz+Pz)的有效性。各治疗剂是以本领域中已知引发治疗功效的浓度范围来施用。Tz使亲本BT474细胞存活率降低50％(图42-B)，并且添加Pz不显著增加细胞死亡(图43-C)。HerGa对亲本细胞展现类似结果(图43-B、43-C)。Tz和Tz+Pz对BT474抗性细胞是无效的(图43-B、43-C)。相比之下，HerGa完全消除了BT474抗性细胞(图43-B)。基于Tz+Lp抗性BT474细胞的发现是类似的，因为Tz不呈现功效，而HerGa引发几乎完全的细胞死亡。与单独S2Ga和HerPBK10相比之下，向带有BT474Tz抗性肿瘤的小鼠全身递送HerGa(每次注射0.008mg/kg)消除了肿瘤生长(图43-D)。因为这些小鼠不提供Tz的维持给药来保持抗性，体内对Tz的敏感性似乎恢复，但是这些肿瘤最终变得对Tz处理具抗性并且尽管有治疗剂量的Tz尺寸仍开始增长(图43-E)。向这些小鼠静脉内递送HerGa使这些肿瘤的尺寸减小(图43-E)。虽然已在某些实施方案和实施例的情形下公开了本发明，但本领域技术人员应了解，本发明的实施方案超出具体公开的实施方案扩展到其他替代实施方案和/或用途以及其修改和等效形式。在本发明的实施方案中已公开许多变化型式和替代元素。其他变化型式和替代元素对本领域技术人员来说将是显而易见的。本发明组合物的组成模块以及可用其诊断、预测或治疗的疾病和其他临床病状的选择在这些变化型式之中，但不限于此。本发明的各个实施方案可具体地说包括或排除这些变化型式或元素中之任一个。在一些实施方案中，表示用于描述和要求本发明的某些实施方案的成分、特性(诸如浓度、反应条件等)的量的数字应被理解为在一些情况下用术语“约”修饰。因此，在一些实施方案中，书面描述和所附权利要求书中所阐述的数值参数是近似值，其可视特定实施方案设法获得的所需特性而变化。在一些实施方案中，数值参数应根据所报导的有效数字的数目并且通过应用一般舍入技术来理解。尽管阐述本发明的一些实施方案的广泛范围的数值范围和参数为近似值，但是特定实施例中所阐述的数值为尽可能精确报导的。本发明的一些实施方案中所呈现的数值可含有因存在于相应测试测量中的标准偏差而必然产生的某些误差。在一些实施方案中，在描述本发明的特定实施方案的情形下(尤其在以下权利要求书中的某些的情形下)中所用的术语“一种(个)”和“所述”以及类似参考可被理解为涵盖单数与复数两者。本文中叙述数值范围仅仅旨在充当单个地提到属于所述范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另外指出，否则每个单个值合并到本说明书中，如同其在本文中被单个地叙述一般。除非本文另外指出或以其他方式上下文明显矛盾，否则本文所描述的所有方法均可以任何适合的顺序进行。本文就某些实施方案所提供的任何和所有实施例或示例性措辞(例如“诸如”)的使用仅仅意在更好地阐明本发明并且不对以其他方式要求的本发明范围构成限制。本说明书中的措辞不应视为指示任何未要求的元素为实践本发明必需的。对本文所公开的本发明的替代元素或实施方案的群组划分不应视为限制。各群组成员可单个地或以与该群组的其他成员或在本文中发现的其他元素的任何组合的形式被提到和要求。群组的一个或多个成员可出于方便和/或可专利性的原因而被包括在群组中或自群组中删除。当发生任何此类包括或删除时，本说明书在本文中被认为含有如被修改从而满足随附权利要求书中所用的所有马库什群组(Markushgroup)的书面描述的群组。本文描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知用于执行本发明的最佳模式。在阅读前述描述后，对那些优选实施方案的改变对本领域技术人员来说将变得显而易见。预期熟练技工可在适当时采用此类变化型式，并且可不同于本文中所具体描述来实践本发明。因此，本发明的许多实施方案包括对本文如由适用法律允许的随附权利要求书中所叙述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指出或以其他方式上下文明显矛盾，否则上文所描述的呈所有可能变化型式的元素的任何组合均由本发明涵盖。此外，在本说明书通篇中已参考了许多专利和印刷公布。上文所引用的参考文献和印刷公布中的每一个均单个地以全文引用的方式并入本文中。最后，应了解，本文所公开的本发明实施方案说明本发明的原理。可采用的其他修改可在本发明的范围内。因此，举例来说(但不限于)，可根据本文中的教示利用本发明的替代配置。因此，本发明的实施方案不限于精确如所显示和描述的实施方案。当前第1页1 2 3