子宫内膜病理状况中的干细胞治疗的制作方法

相关申请本申请根据35u.s.c.§119(e)要求于2014年6月17日提交的美国临时申请no.62/013,121的权益，其全部内容通过引用并入本文。本发明一般地涉及自体cd133+骨髓干细胞(bonemarrowstemcell，bmdsc)用于诱导子宫内膜再生和治疗子宫内膜病理状况(例如子宫腔粘连综合征(asherman’ssyndrome)和子宫内膜萎缩)的用途。
背景技术：
：在育龄妇女中，可以区分两层子宫内膜：(i)邻近子宫腔的功能层，和(ii)邻近子宫肌层并在功能层下面的基底层。功能层在先前月经周期的第一部分期间月经结束之后建立。增生是由雌激素诱导的(月经周期的卵泡期)，并且此层中的后来的变化由来自黄体的孕酮产生(黄体期)。其适于为胚胎的植入和生长提供最佳环境。该层在月经期间完全脱落。相反，在月经周期期间的任何时间，基底层不脱落。在每个月经周期中，在全身性卵巢类固醇变化下人子宫内膜的再生对于该器官的主要功能(即发生子宫内膜植入窗口以接待植入的胚泡，从而允许发生妊娠)的准备是必需的。因此，每个月经周期补充子宫内膜功能层的所有细胞区室对于正常生殖功能是必需的。子宫腔粘连综合征(asherman’ssyndrome，as)是其中由重复或侵略性刮除术和/或子宫内膜炎引起的子宫内膜破坏的病症。它在许多区域产生带有子宫内粘连的子宫腔闭塞和功能性子宫内膜的缺失。患有这种疾病以及萎缩性子宫内膜(＜4mm)的妇女通常与不孕、月经不调(包括闭经、月经过少)和复发性流产(recurrentpregnancyloss)斗争。目前没有针对这些子宫内膜病理状况的特异性治疗。因此，仍然需要开发安全且有效的治疗来治疗这些病理状况。发明概述本公开内容至少部分地涉及自体cd133+骨髓衍生干细胞(bonemarrowderivedstemcell，bmdsc)可使血管形成再生的研究结果，所述血管形成导致自体功能性子宫内膜从头产生。因此，本公开内容的一些方面提供了诱导子宫内膜再生的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向有此需要的对象的子宫动脉中施用有效量的自体cd133+骨髓衍生干细胞(bonemarrowderivedstemcell，bmdsc)以诱导子宫内膜再生。在一些实施方案中，已知对象患有子宫腔粘连综合征或子宫内膜萎缩。在一些实施方案中，对象患有抵抗激素治疗的子宫内膜萎缩。在一些实施方案中，对象曾有过一次或更多次先前的胚胎植入失败(priorembryoimplantationfailure)。在一些实施方案中，自体cd133+bmdsc通过以下来制备：向对象施用用于将bmdsc从骨髓动员到对象外周血中的药剂；并从对象的外周血中分离cd133+bmdsc。在一些实施方案中，用于动员bmdsc的药剂是粒细胞集落刺激因子(granulocytecolony-stimulatingfactor，g-csf)。在一些实施方案中，自体cd133+bmdsc通过使用抗cd133抗体的单采血液成分术(apheresis)从对象的外周循环中分离。在一些实施方案中，cd133+bmdsc通过导管施用到子宫动脉中。在一些实施方案中，cd133+bmdsc施用到对象的子宫螺旋小动脉(uterinespiralarteriole)中。本公开内容的一些方面提供了用于诱导子宫内膜再生的方法，所述方法包括从有此需要的对象中分离自体cd133+骨髓衍生干细胞(bmdsc)；和向所述对象的子宫动脉中施用有效量的所分离的cd133+bmdsc以诱导子宫内膜再生。在一些实施方案中，在分离自体bmdsc之前向对象施用粒细胞集落刺激因子(g-csf)。在一些实施方案中，自体cd133+bmdsc通过使用抗cd133抗体的单采血液成分术从对象的外周循环中分离。在一些实施方案中，将cd133+bmdsc通过导管施用到子宫动脉中。在一些实施方案中，将cd133+bmdsc施用到对象的子宫螺旋小动脉中。在一些实施方案中，已知对象患有子宫腔粘连综合征或子宫内膜萎缩。在一些实施方案中，对象患有抵抗激素治疗的子宫内膜萎缩。在一些实施方案中，对象曾有过一次或更多次先前的胚胎植入失败。本发明的每个限制可涵盖本发明的多个实施方案。因此，预期涉及任何一个要素或要素组合的本发明的每个限制可包括在本发明的每个方面中。本发明在其应用中不限于在以下描述中阐述或在附图中示出的构造细节和部件布置。本发明能够具有其他实施方案并且能够以多种方式实践或执行。此外，本文中使用的措辞和术语是为了描述的目的，并且不应被视为限制。本文中使用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式意在包括其后列出的项目及其等同物以及另外的项目。附图简述图1是示出图1a所示事件的研究设计(a)和时间线(b)的示意图。图2是示出探针从子宫动脉通过螺旋小动脉之路径的血管造影，其中cd133+细胞通过非侵入性放射学进行定位。图3示出了在自体bmsc治疗之前、3-6个月和9个月之后患有萎缩性子宫内膜的一个患者的子宫腔的宫腔镜检查。图4示出了在自体bmsc治疗之前和3个月之后在本研究中包括的6例患有萎缩性子宫内膜/子宫腔粘连综合征的患者的子宫内膜厚度。图5示出了在自体bmsc治疗之前和3个月之后的平均值+sd子宫内膜厚度。图6示出了显示与预处理基础状态相比，自体bmsc治疗后3个月获得的子宫内膜体积改善的3d超声图像。图7a-7b示出了术前和术后宫腔镜检查图像。在患有子宫腔粘连综合征(图7a)或子宫内膜萎缩(图7b)的患者中，在干细胞治疗之前(第一次视检(look))，和干细胞治疗后2-3个月(第二次视检)和4-6个月(第三次视检)的宫腔镜检查的研究结果。子宫内膜粘连的严重程度根据美国生育学会(americanfertilitysociety)分类进行分级。图8a-8i示出了组织分析。自体细胞治疗之前(图8a)、3个月后(图8b)和6个月后(图8c)来自患者7的子宫内膜中的成熟血管检测的免疫组织化学结果。以α-sma+、cd31+阳性细胞鉴定成熟血管(20×)。图8d示出了用作α-sma染色的阳性对照的人子宫肌层和用作cd31的阳性对照的人扁桃体(图8e)。图8f示出了在不存在一抗情况下产生的阴性对照。图8g示出了图8c中鉴定的血管的详细视图(40×)。在图8h中，呈现了在细胞治疗之前以及在细胞治疗后3个月和6个月的8个患者的成熟血管总数的动态分析，表明时间敏感的新生血管生成效应。图8i示出了治疗前和治疗后3个月和6个月的总成熟血管的平均值±sem的统计学分析。图9示出了研究设计。在增生期由一名外科医生进行as或ea的宫腔镜检查重新确认和分级。通过g-csf注射诱导bmdsc动员，五天后，并且通过单采血液成分术从外周血中分离cd133+细胞并通过介入性放射学立即灌输到螺旋小动脉中。进行第二次和第三次视检宫腔镜检查以评价干细胞治疗后的子宫腔。然后邀请患者尝试怀孕。发明详述本发明至少部分地基于使用自体干细胞治疗来诱导子宫内膜再生的新治疗方法的研究结果。特别地，本申请基于自体cd133+骨髓衍生干细胞(bmdsc)可使血管形成再生的研究结果，所述血管形成导致自体功能性子宫内膜从头产生。虽然已知bmdsc是不同子宫内膜细胞区室(基质、腺上皮和腔上皮)中的非造血细胞的来源，但是不知道bmdsc的哪个亚群促进子宫内膜的修复。本申请提供了安全且有效的基于细胞的治疗以诱导子宫内膜再生并治疗与子宫内膜变性相关的病理状况，例如子宫腔粘连综合征和子宫内膜萎缩。人子宫主要由子宫内膜和称为子宫肌层的外平滑肌层组成。人子宫内膜的功能层是高度再生性组织，在妇女的生殖年龄期间经历生长、分化和脱落的按月的周期。循环雌激素和孕酮的波动水平协调人子宫内膜的这种急剧的重塑。子宫内膜再生也在分娩和子宫内膜切除术后发生。从基底层的子宫内膜再生有助于功能层的替换，随后其在月经和分娩期间脱落。然而，子宫内膜可无法响应于雌激素，并且在某些病理状况(例如子宫腔粘连综合征和子宫内膜的萎缩)中不再生。这样的对象可经历异常的子宫内膜增生并变得不育。子宫腔粘连综合征(as)(或弗里奇综合征(fritschsyndrome))是以子宫内膜粘连和/或纤维化为特征的病症，其通常与子宫内腔的扩张和刮除术有关。许多其他术语已用于描述所述病症和相关病症，包括：子宫内粘连(intrauterineadhesion，iua)、子宫/宫颈闭锁、创伤性子宫萎缩、硬化子宫内膜、子宫内膜硬化和子宫内粘连(intrauterinesynechiae)。子宫内膜基底层的创伤(例如，在流产或分娩或者用于药物流产之后进行的扩张和刮除术(dilationandcurettage，d&c)之后)可导致发生导致粘连的子宫内瘢痕，这可不同程度地使子宫腔闭塞。在极端情况下，整个腔可有疤痕和闭塞。即使具有相对较少的瘢痕，子宫内膜可无法响应于雌激素，并且对象可经历次级月经不调(例如闭经、月经过少或月经稀发(oligomenorrhea))并且变得不育。as也可源自其他骨盆手术，包括剖宫产术、去除纤维瘤(子宫肌瘤切除术)和其他原因，例如iud、盆腔辐照、血吸虫病和生殖器结核。来自生殖器结核的慢性子宫内膜炎是发展中国家严重子宫内粘连(iua)的重要原因，经常导致难以治疗的子宫腔完全闭塞。宫腔镜检查是用于诊断as的金标准。通过宫腔声学造影术(sonohysterography)或子宫输卵管造影术(hysterosalpingography)成像显示瘢痕形成的程度。根据严重程度，as可能导致不育、反复流产、被困血液引起的疼痛和未来的产科并发症。如果不治疗，在一些情况下，由粘连导致的月经流的阻塞可导致子宫内膜异位症。在子宫内膜萎缩中，由于低雌激素水平，子宫内膜变得太薄。要认为是萎缩，则子宫内膜厚度应该在经阴道超声扫描上测量为小于4-5mm。子宫体与子宫颈比例也将趋于降低并可接近1∶1。mri还可证明类似于用超声观察到的子宫内膜厚度的降低。可导致子宫内膜萎缩的因素包括长期口服避孕、低雌激素状态(卵巢功能障碍)和使用他莫昔芬。根据本发明的一个方面，提供了诱导子宫内膜再生的方法。所述方法包括向有此需要的对象的子宫动脉中施用有效量的自体cd133+骨髓衍生干细胞(bmdsc)以诱导子宫内膜再生。根据本发明的一个方面，提供了诱导子宫内膜再生的方法。所述方法包括从有此需要的对象中分离自体cd133+骨髓衍生干细胞(bmdsc)；和向所述对象的子宫动脉中施用有效量的所分离的cd133+bmdsc以诱导子宫内膜再生。本文中使用的“对象”包括所有哺乳动物，包括但不限于狗、猫、马、绵羊、山羊、牛、猪、人和非人灵长类动物。在一些实施方案中，对象是妇女。需要子宫内膜再生的对象是其子宫内膜无法响应于雌激素而再生并且具有薄的子宫内膜衬里的对象。这样的对象经常经历异常的子宫内膜增生并变得不育。子宫内膜衬里的最佳厚度为10至15mm，在植入时在妇女月经周期的约第21天达到其最大厚度。在一些实施方案中，需要治疗的对象在植入时具有小于5mm、小于4mm、小于3mm、小于2mm或小于1mm的子宫内膜厚度。在一些实施方案中，对象具有以出血的流量和持续时间减小为特征的月经不调(闭经、月经过少或月经稀发)和/或复发性流产。在一些实施方案中，已知对象患有子宫腔粘连综合征或子宫内膜萎缩。在一些实施方案中，对象患有抵抗激素治疗的子宫内膜萎缩。在一些实施方案中，对象曾有过一次或更多次先前的胚胎植入失败。骨髓衍生干细胞(bmdsc)已示出作为外源性来源有助于组织修复和不同器官和组织的再生。在人和鼠子宫内膜中，bmdsc也是不同子宫内膜细胞区室(基质、腺上皮和腔上皮)中的非造血细胞的来源。它们主要有助于子宫内膜基质区室细胞的形成，并且以小得多的程度有助于子宫内膜腺上皮和腔上皮区室的形成。bmdsc包括造血干细胞(hematopoieticstemcell，hsc)和间充质千细胞(mesenchymalstemcell，msc)。然而，bmdsc的哪个(哪些)亚群促进子宫内膜的修复是未知的。本申请的发明人首次在人中示出了通过手术和导管递送系统递送到子宫动脉中的cd133+骨髓衍生干细胞诱导子宫内膜再生的能力。在先前的骨髓动员后分离自体循环的cd133+bmdsc，并将其重新植入到同一患者子宫的螺旋小动脉中。cd133+bmdsc使血管形成再生，其导致自体功能性子宫内膜从头产生。cd133是在人和啮齿类动物中也已知为prominin1(prom1)的糖蛋白。它是五次跨膜的胆固醇结合蛋白，其定位于膜突起(protrusion)并且经常在成体干细胞上表达，其中其被认为通过抑制分化而在维持干细胞性质中发挥作用。本发明的cd133+bmdsc可来自于原代干细胞或可来自于已建立的干细胞系。在一些实施方案中，干细胞可以是胚胎干细胞、成体干细胞、脐带血干细胞、体干细胞(somaticstemcell)、骨髓干细胞或动员的骨髓干细胞。在一些优选的实施方案中，干细胞是成体干细胞。在一些实施方案中，cd133+bmdsc通过以下来制备：向对象施用用于将bmdsc从骨髓动员到对象外周血中的药剂；从对象的外周血中分离cd133+bmdsc。在一些实施方案中，干细胞动员剂选自粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage-colonystimulatingfactor，gm-csf)和普乐沙福(plerixafor)(amd3100)。在一些实施方案中，干细胞动员剂是g-csf。在一些实施方案中，通过使用抗cd133抗体的称为单采血液成分术的方法，从对象的外周循环中分离自体cd133+bmdsc(见例如，sovalath，scrofanim，eidenschenka，pasquets，rimelenv，，hénonp.identificationandisolationfromeitheradulthumanbonemarroworg-csf-mobilizedperipheralbloodofcd34(+)/cd133(+)/cxcr4(+)/lin(-)cd45(-)cells，featuringmorphological，molecular，andphenotypiccharacteristicsofverysmallembryonic-like(vsel)stemcells.exphematol.2011apr；39(4)：495-505，其全部内容整体并入本文)。单采血液成分术是本领域中公知的方法，是指从供体对象抽取血液并分离成其组分(其中一些组分保留)，例如干细胞群体；并且其余部分通过输血返回给供体对象的方法或操作。单采血液成分术需要比全血捐赠更长的时间。全血捐赠需要约10-20分钟来收集血液，而单采血液成分术捐献可需要约1-2小时。单采血液成分术产物是指由单采血液成分术方法收集的异质细胞群。在一些实施方案中，使用抗cd133抗体从所分离的bmdsc中分离cd133+bmdsc。在一些实施方案中，使用抗cd133抗体选择cd133+bmdsc，直到cd133+bmdsc为至少80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.9％或100％纯的。在一些实施方案中，cd133+bmdsc为至少95％、98％、99％、99.9％或100％纯的。例如通过移植、植入(例如，细胞本身或作为基质-细胞组合的一部分的细胞)、注射(例如，直接到子宫动脉中)、输注、通过导管递送或本领域中已知的用于提供细胞治疗的任何其他方式，可以实现向有此需要的对象施用cd133+bmdsc或包含这样的细胞的治疗组合物。在一个实施方案中，通过动脉内导管插入术递送细胞。子宫动脉导管插入术操作已被广泛描述并用于子宫肌瘤的栓塞(ravinajh，herbreteaud，ciraru-vigneronn，etal.arterialembolisationtotreatuterinemyomata.lancet1995；346(8976)：671-2，其全部内容整体并入本文)。cd133+bmdsc可施用到对象的子宫动脉中。这些动脉向子宫提供血液。在一些实施方案中，cd133+bmdsc施用到对象的子宫螺旋小动脉中。螺旋动脉是在月经周期的黄体期期间暂时向子宫内膜供应血液的小动脉。这些动脉对雌激素和孕酮高度敏感，穿透子宫内膜功能层，在其内生长并发出分枝，并显示出非常不同且独特的模式。cd133+bmdsc以有效量施用。“有效量”是指足以引起期望的生物学应答(即诱导子宫内膜再生)的量。有效量包括减缓、降低、抑制、改善或逆转与as或子宫内膜萎缩相关的一种或更多种症状所需的量。在一些实施例中，这样的术语指：·cd133+bmsc干细胞治疗后的月经重新开始；·子宫内膜厚度增大；子宫内膜厚度测量为子宫内膜腔基底部中从子宫肌层以上到子宫肌层以下限度的长度。例如，所述增大可以是以激素替代治疗(hormonereplacementtherapy，hrt)获得并通过在子宫底的阴道超声纵轴测量的最大厚度增大50％(vgr为4至6mm)；·子宫内膜从头形成的宫腔镜检查证据和组织学证据；和/或·在这些患者的胚胎放置后的活出生率(live-birthrate)、妊娠和植入率方面而言的重建的子宫内膜的功能。在一些实施方案中，将至少4千5百万个cd133+bmdsc输注到对象中。在一些实施方案中，将至少5千万、5千5百万、6千万、6千5百万个cd133+bmdsc输注到对象中。有效量可由本领域技术人员使用常规方法确定。在一些实施方案中，有效量是导致所治疗的病症的任何改善的量。本领域技术人员可例如基于体外和/或体内测试和/或化合物剂量的其他知识来确定所使用的治疗剂的合适剂量和范围。当施用于对象时，治疗剂的有效量当然将取决于所治疗的具体疾病；疾病的严重程度；个体患者参数，包括年龄、身体状况、身材和体重、同时进行的治疗、治疗频率和给药方式。这些因素是本领域普通技术人员公知的，并且可以仅通过常规实验来解决。在一些实施方案中，使用最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。通过以下实施例进一步举例说明本发明，这些实施例决不应解释为进一步限制。本申请通篇引用的所有参考文献(包括参考文献、授权的专利、公布的专利申请和共同未决专利申请)的全部内容通过引用明确地并入本文。实施例实施例1材料和方法设计以下是西班牙卫生部资助的由西班牙巴伦西亚医院(hospitalclinicodevalencia)的irb批准的对16名难治性as患者进行的实验性非对照研究(refec11-299)。使用粒细胞-csf(g-csf)(5mg/kg/12小时，皮下(sc)，经4天)进行bmdsc动员。7天后，以外周血单采血液成分术进行cd133+细胞的分离。然后，使用2.5f微导管通过子宫动脉的非侵入性放射学干预将自体cd133+细胞递送到螺旋小动脉中。通过宫腔镜检查、阴道超声和组织学在干细胞干预(stemcellintervention)前、以及干细胞干预3、6和9个月后对子宫内膜腔状态进行评估。患者和方法纳入标准该研究中包括16名先前用手术治疗至少7次且诊断为患有难治性子宫腔粘连综合征，或患有抵抗激素治疗的子宫内膜萎缩(＜4mm)且患有复发性植入失败的患者。所有患者由世界各地的各自的医生转移进入由西班牙卫生部支持的临床实验研究。患者年龄为20-45岁，并且均具有正常的肝、心、肾功能。证实在自然周期中或在激素替代治疗(hrt)后没有月经出血。也证实了不存在精神病理状况、hiv、乙型或丙型肝炎和梅毒并且证实了参与研究的意愿。排除标准如果没有进入外周静脉或者如果他们患有脾肿大，则将患者从研究中排除。方法学1.骨髓干细胞(bmsc)动员为了开始动员过程，满足以下条件：·患者被告知程序，并在动员前至少24小时给予知情同意书。·进行相应的医学评估，以及相关的补充探索，并由负责bmsc回收的医生进行验证。·提供相关血清学检测结果(hiv、hbcag、hbsag、hcv、梅毒)。·评价静脉以确定其对于该过程的适宜性。然后，通过g-csf(5mcg/kg皮下(sc)，每12小时)诱导bmsc向外周血动员，持续4天。2.bmsc回收bmsc通过使用外周静脉的常规单采血液成分术过程进行回收。根据clínicouniversitario医院批准的po-7610-02方案进行cd133+细胞的阳性选择，其中应用三次洗涤并随后选择cd133+细胞。首先，洗涤细胞并与单克隆抗体孵育，然后将它们再洗涤两次，最后进行cd133+选择。选择过程进行最多3小时或直到收集至少5千万个cd133+细胞。3.将cd133+细胞通过动脉内导管插入术移植到子宫螺旋小动脉中在将它们分离后24小时，将自体cd133+细胞在15-30cc盐水溶液中稀释，然后输注到螺旋动脉中。通过无菌注射器将细胞收集到容器中，并在其输注前送至放射科。输注至少4千5百万个细胞。子宫动脉的导管插入术被广泛描述并用于子宫肌瘤的栓塞。该方法所需的放射设备是放射外科手术c-臂或具有超声扫描的血管造影室。简而言之，在使用seldinger技术进入普通股动脉后，将4f导管置于动脉中并将其用于使用血管造影导管对两个腹下动脉进行导管插入，其中所述血管造影导管带有cobra弯曲件2(cobracurve2)和terumo引导件(0.035英寸)。将微导管2.5f与引导件(0.014英寸)通过cobra导管放置，并对子宫动脉插入导管，直到上升曲线或直到微导管达到其最远端水平。一旦导管稳定并且已经检查其位置，则将cd133+bmsc在盐水溶液悬浮液中进行输注。用于细胞注射的导管的直径为500-600微米，并灌注15cc。干预后，患者在医院过夜，第二天出院，无并发症。响应标准该技术旨在使用cd133+bmsc重新填充患有子宫腔粘连综合征或子宫内膜萎缩之患者中子宫内膜血管小环境(endometrialvascularniche)，以便在由于子宫内膜的复发性植入失败而经历art的患者中重建功能性子宫内膜，使得能够允许胚胎植入。因此，以下指标被认为是成功治疗的指标：·月经结果，月经必须在cd133+bmsc治疗后重新开始。·子宫内膜厚度的增大。最小为通过阴道超声纵轴在子宫底测量的hrt获得的最大厚度的50％(vgr为4至6mm)·从头子宫内膜形成的宫腔镜检查证据和组织学证据·在这些患者中重建的子宫内膜在胚胎移植(embryoreplacement)后的活出生率、妊娠和植入率方面的功能结果表1.cd133+干细胞治疗后的临床结局表2：cd133+bmdcc自体移植后的周期长度、以及月经量和持续时间(以天为单位)月经规律(天)量(保护次数/天)持续时间(天)治疗后第二个月26.52.63.8治疗后第四个月25.41.63.1治疗后第六个月26.11.42.1这是使用这种血管内应用于as的特异性干细胞治疗的第一个病例系列研究。不育妇女之中，as的发病率在2-22％之间变化。g-csf是在自体和同种异体供体中均用于bmsc动员的最常用的细胞因子。该产品一般耐受性良好。然而，施用高于5mcg/kg/天的剂量已经显示在超过50％的病例中引起骨骼肌疼痛。如果发生这种情况，应当施用对乙酰氨基酚作为镇痛剂(500mg/8小时)，同时保持g-csf的施用。其他不太经常观察到的并发症是：恶心和呕吐、偏头痛和失眠。在每种情况下，应施用对症治疗。一般而言，在停止施用g-csf后3-4天内症状消失，尽管乏力的感觉可以持续到最后给药后的2周。最后，健康供体的脾破裂与g-scf的施用相关。由于该事实，应该在所有表现出左侧季肋部(hypochondrium)疼痛的患者中进行腹部扫描。在这些病例中检测到脾肿大之后应立即暂停g-csf。通常检测到高水平的碱性磷酸酶和ldh而没有任何相关症状。白细胞增多症是相当普遍的，且值通常小于70×109/l。实施例2研究参与者邀请了基于美国生育学会分类诊断为难治性子宫腔粘连综合征(as)(n＝11)或子宫内膜萎缩(n＝5)的16位患者(年龄为30-45岁)参与研究。证实了严重子宫腔粘连综合征或子宫内膜萎缩的早期诊断，并且在增生期进行宫腔镜检查。诊断为as的患者根据子宫粘连的afs分类进行分类，并获得了子宫内膜活检。所有患者在其自然周期或激素替代治疗(hrt)后经历很少或无月经出血。参与研究的要求包括以下：正常的肝、心和肾功能，不存在hiv、乙型或丙型肝炎、梅毒和精神病理状况，以及愿意完成研究。排除了没有外周静脉进入或脾肿大的病例中的患者。bmdsc的动员和分离通过粒细胞集落刺激因子(g-csf)的药理学施用(在第-4，-3，-2和-1天，10μg/kg/天)诱导bmdsc的动员。g-csf是在自体和同种异体供体中均广泛用于该目的的细胞因子。注射后5天，cd133+细胞的分离使用cobespectra分离器(terumobct，lakewood，co)通过外周静脉通过单采血液成分术进行分离。为每个患者处理两到三个样品，并且使用系统(miltenyibiotecgmbh，bergischgladbach，德国)根据建立的方案获得cd133+细胞的阳性选择。在收集的三小时内进行选择，直到获得5千万个细胞。将所分离的cd133+细胞稀释到15至30cc的盐水溶液中，并在无菌注射器中运送至放射科以递送到螺旋小动脉中。bmdsc的递送在成功分离cd133+后，患者被转送到hcu的放射科，在其中进行动脉内导管插入术以使用用于栓塞纤维瘤的技术将细胞递送至子宫内膜干细胞小环境(stemcellniche)。使用seldinger技术接近股总动脉，其中4f导引器允许用血管造影导管弯曲件和引导件terumo(0.035英寸)对两个腹下动脉进行导管插入术。通过后一导管，引入具有引导件(0.014英寸)的2.5f微导管以将子宫动脉导管插入微导管可到达的最远端的螺旋小动脉(图9)。一旦导管位置稳定并确认，则通过每个子宫动脉将15cc所选cd133+细胞(含有42至200×106个细胞，平均值123.56×106±57.64)的盐水悬浮液注射到螺旋小动脉中。随访所有患者接受细胞治疗后均被给予激素替代治疗(progylutontm，bayer，berlin，德国)。通过诊断性宫腔镜检查、阴道超声和组织学评估子宫内膜腔状态，以确定在细胞治疗之前、细胞治疗之后2、3和6个月时子宫内膜厚度和子宫内膜粘连的存在与否。然后，患者被邀请进行art以尝试怀孕(图9)。子宫内膜免疫组织化学使用抗人cd31(dako，glostrup，丹麦)以及二抗alexa山羊抗小鼠488和小鼠抗人α-sma-cy3(sigma-aldrich，mo，eeuu)通过石蜡切片中的cd31和α-sma-cy3免疫组织化学评估血管形成。将载玻片用dapi(invitrogen，ca，eeuu)复染色。阳性对照包括针对cd31的人扁桃体和针对α-sma的子宫肌层。在荧光nikoneclipse80i显微镜下检查载玻片。将三个独立的20×视野用于通过imagej软件分析每个区域的总血管形成。数据以每个患者在细胞治疗前、细胞治疗后3个月和6个月的具体值表示。统计学分析使用spss17.0软件(ibm，md，美国)进行统计分析。使用配对样本t检验来分析在总成熟血管计数中观察到的差异。在双尾检验中获得的p值≤0.05被认为是统计学上显著的。结果由于在一个病例中cd133+细胞的动员不足(＜4千万)，而另一个病例中缺乏到达外周静脉的路径，这两位患者开始时被排除在研究之外。共有16位患者完成了方案。没有报道主要的并发症。诊断为难治性as的患者(n＝11)被转移至本研究中(表3)。患者的月经病史显示两例患者出现闭经，9例发现月经不足。as的原因是创伤性扩张和刮除术(d&c)(n＝9)、子宫肌瘤切除术(n＝1)和不明原因(n＝1)。先前尝试的修复性手术性宫腔镜检查的平均数为2。尽管手术治疗，但没有患者报道子宫内膜状态的显著改善。3位患者被分类为asiii级，4位患者被评分为ii级+ea，2位患者被分类为ii级，1位患者被分类为asi级(图7a)。在细胞治疗之前进行高剂量hrt所实现的最大子宫内膜厚度为4.3mm±0.74(范围为2.7-5mm)(表3)。表3：子宫腔粘连综合征患者的特征和结局注意：pt＝患者；mh＝月经史；et＝子宫内膜厚度；d&c＝扩张/刮除术；pof＝卵巢早衰；h/s＝宫腔镜检查；hm＝子宫肌瘤切除术；lm＝腹腔镜肌瘤切除术；as＝子宫腔粘连综合征(通过美国生育学会分类的子宫内膜粘连分类，1998)；ea＝子宫内膜萎缩；bp＝生化妊娠；ep＝异位妊娠；sp＝自然妊娠；art＝辅助生殖治疗；lng＝左炔诺孕酮；hrt＝激素替代治疗本研究中入选的患有ea和植入失败的患者(n＝5)(表4)具有先前的闭经(n＝3)或稀少(n＝2)的月经史。病因是先前的d&c(n＝1)、不明原因(n＝1)、使用左炔诺孕酮iud(n＝1)、卵巢早衰(n＝1)和先前的子宫肌瘤切除术(n＝1)。先前尝试的修复性手术性宫腔镜检查的平均次数为两次。在所有情况下观察到严重的子宫内膜萎缩(图7b)。在细胞治疗之前以高剂量hrt达到的最大子宫内膜厚度为4.2mm±0.8(范围为2.7-5mm)(表4)。表4：子宫内膜萎缩患者的特征和结果注意：pt＝患者；mh＝月经史；et＝子宫内膜厚度；d&c＝扩张/刮除术；pof＝卵巢早衰；h/s＝宫腔镜检查；hm＝子宫肌瘤切除术；lm＝腹腔镜肌瘤切除术；as＝子宫腔粘连综合征(根据美国生育学会分类的子宫内膜粘连分类，1998)；ea＝子宫内膜萎缩；bp＝生化妊娠；ep＝异位妊娠；sp＝自然妊娠；art＝辅助生殖治疗；lng＝左炔诺孕酮；hrt＝激素替代治疗干细胞治疗后的子宫内膜重建自体cd133+bmdsc治疗后，所有伴随hrt的16例患者恢复月经周期，除了一例患有ea以外。然而，月经的持续时间和强度(通过使用的垫的数量评估)从第一个月的平均5.06天(范围3-7天)逐渐降低到细胞治疗后第六个月的2.12天(范围，1-3天)(补充图1a)。月经量也从平均2.68(范围，1-5)垫/天降至第6个月的1.5(范围，1-4)垫/天。在细胞治疗后2、3和6个月进行的子宫观察显示子宫内膜和子宫腔的改善(表3和4；图7)。具体地，诊断为iii期as的所有患者改善至i期，而ii期受影响的两位患者中的一位显示完全正常化的子宫内膜腔，而另一位改善至i期。其余患者最初诊断为i期，其相对于合格分数得到了改善，如表3中所示。所获得的术后最大子宫内膜厚度为6.7mm(范围，3.1-12mm)(表3，图7a)。在ea组中，在五位患者中的四位中观察到细胞治疗后的正常子宫内膜(表4；图7b)。细胞治疗后获得的最大子宫内膜厚度为5.7mm(范围，5-12mm)(表4)。通过在细胞治疗之前以及在细胞治疗之后3和6个月进行的cd31和a-sma的共定位，在8位患者中评估了所形成的成熟血管的总数(图8)。在治疗3个月后(患者4、5、7、12和13)观察到血管形成的递增提高，而在其他患者中发现一致数量的成熟血管(患者6、9和10)(图8h)。为了比较实验起始点(称为对照)和用cd133+细胞特异性治疗后3个月的结果，检查了数据的相应平均值和sem。在治疗三个月后，观察到患者中总成熟血管(cd31+/a-sma+)的数量增多(p＝0.021)。这些结果表明在as和ea患者中自体注射cd133+细胞后的特征性新血管生成，其在6个月后逐渐降低(图8i)。通过在自体cd133+bmdsc治疗后希望怀孕的患者的生殖结果来评估重建的子宫内膜的功能(表3和4)。两个患者分别在细胞治疗后两个月和四个月自然妊娠，导致持续妊娠(患者15)，和由于膜的过早破裂(患者7)在第17周期间流产。在13次胚胎移植后获得6个阳性妊娠，导致3次生化妊娠、由于在流产后评估为染色体异常胚胎而在第9周的一次流产、1次异位妊娠、以及1次持续妊娠(患者12)。在一个病例中，由于所有胚胎中的染色体异常而取消了胚胎转移(患者8)，而在另一个案例中，由于细胞治疗的失败，未进行转移(患者14)。讨论从组织学的角度来看，as对应于以纤维组织替代子宫内膜基质来影响子宫内膜干细胞，并因此影响组织功能。腺通常由无活性的立方柱状上皮细胞代替，其一般对激素刺激无应答，并导致子宫内膜结构的完全消失，以影响子宫内膜干细胞小环境，并因此影响组织功能。在发现as后的头50至60年间，研究人员集中于病症的流行、病因和病理状况。随着内窥镜检查的出现，开发了用于诊断和治疗病症的新方法；然而，尽管技术进步，目前仍有约50％的as病例没有得到全面治愈。在这里，描述了特异性靶向子宫内膜干细胞小环境的干细胞治疗的第一实例。在稳态条件下，循环epc(circulatingepc，cep)仅占循环中细胞的0.01％。因此，计划在受影响的器官中进行与直接输注相结合的cep动员。在用g-csf动员后分离自体cd133+bmdsc，然后使用非侵入性放射学方法将其重新引入到患者子宫的螺旋小动脉中。cd133+bmdsc使血管生成再生并诱导子宫内膜增生，导致自体重建的子宫内膜的创建。cd133+bmdsc最近在非血液学应用中的再生医学的临床试验中得到了探索。主要目标是重建子宫内膜，其首先通过恢复月经来评估，这在我们的16例患者中出现了15例。虽然月经的持续时间和强度在细胞治疗后6个月逐渐下降，但干细胞治疗会使子宫内膜形态发生即时差异。子宫腔的宫腔镜可视化检查、通过阴道超声测量的子宫内膜厚度和通过免疫组织化学发现的新血管生成与子宫内膜的有效、尽管短暂的重建是一致的。次要目标是通过尝试怀孕来测试重建的子宫内膜的功能。几个伴随使用art的自然妊娠在细胞治疗后得以实现，并且在本研究中观察到的两个流产与子宫内膜功能无关。细胞植入是主要关注的问题，因为irb将不允许用超顺磁性铁氧化物纳米颗粒(superparamagneticiron-oxidenanoparticle，spio)标记cd133+bmdsc以追踪被注射的细胞。相反，用于子宫腔粘连综合征的鼠免疫缺陷实验模型被用于此目的。将来自参与研究的患者的1百万个cd133+bmdsc的等分试样用于进一步表征并测定lgr5+细胞和醛脱氢酶1(aldehydedehydrogenase1，aldh1)活性，产生75.72±8％lgr5+细胞和77.45±7.81％aldh1活性，分别鉴定了干细胞和祖细胞的状态。将另1百万个细胞等分试样与50μg/mlmoldayion罗丹明b孵育18小时，产生在所有实验中大于97％的标记效率。然后，通过尾静脉或子宫内注射将spio标记的细胞注射到子宫腔粘连综合征的免疫缺陷小鼠模型中。细胞植入为通过使用普鲁士蓝染色鉴定细胞内铁沉积来检测，揭示cd133+bmdsc主要围绕创伤子宫内膜的子宫内膜血管发生植入。先前的病例报道示出了以从骨髓经自体干细胞分离cd9、cd40和cd90细胞并将它们置入子宫内膜腔来治疗as的阳性结果；而另一个病例报道描述了用针头将非表征的单核干细胞直接置入子宫内膜下区域。两份病例报道在递送的细胞类型和靶向的干细胞小环境方面不同。本研究表明cd133+bmdsc自体细胞治疗可用于治疗患有难治性as和ea并希望怀孕的患者。参考文献1.chaj，vilellaf，deyskandsimónc.“molecularinterplayinsuccessfulimplantation”intencriticaltopicsinreproductivemedicine，s.sanders.science/aaas，washington，dc，2013，pp.44-48.2.cervelloi，gil-sanchisc，masa，delgado-rosasf，martmez-conejeroja，galana，martlnez-romeroa，martlnezs，navarroi，ferroj，horcajadasja，estebanfj，etal.humanendometrialsidepopulationcellsexhibitgenotypic，phenotypicandfunctionalfeaturesofsomaticstemcells.plosone2010；5：e10964.3.cervelloi，masa，gil-sanchisc，perisl，fausa，saunderspt，critchleyho，simonc.reconstructionofendometriumfromhumanendometrialsidepopulationcelllines.plosone2011；6：e21221.4.masudah，matsuzakiy，hiratsue，onom，nagashimat，etal.(2010)stemcell-likepropertiesoftheendometrialsidepopulation：implicationinendometrialregeneration.plosone.5(4)：e10387.5.pittengermf，mackayam，becksc，jaiswalrk，douglasr，etal.(1999)multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.science284(5411)：143-7.6.taylorhs.(2004)endometrialcellsderivedfromdonorstemcellsinbonemarrowtransplantrecipients.jama.292(1)：81-5.7.duh，taylorhs.(2007)contributionofbonemarrow-derivedstemcellstoendometriumandendometriosis.stemcells25(8)：2082-6.8.mintsm，janssonm，sadeghib，westgtenm，uzunelm，etal.(2008)endometrialendothelialcellsarederivedfromdonorstemcellsinabonemarrowtransplantrecipient.humreprod.23(1)：139-43.9.ikomat，kyos，maiday，ozakis，takakuram，etal.(2009)bonemarrow-derivedcellsfrommaledonorscancomposeendometrialglandsinfemaletransplantrecipients.amjobstetgynecol.201(6)：608.e1-8.10.cervelloi，gil-sanchisc，masa，fausa，sanzj，moscardof，higuerasg，sanzma，pellicera，simonc.bonemarrow-derivedcellsfrommaledonorsdonotcontributetotheendometrialsidepopulationoftherecipient.plosone2012；7：e30260.11.duh，taylorhs.contributionofbonemarrow-derivedstemcellstoendometriumandendometriosis.stemcells2007；25：2082-2086.12.brantincsaka，brownsteinmj，cassiani-ingonir，pastorinos，szalayovai，tothze，keys，nemethk，pickelj，mezeye.cd45-positivebloodcellsgiverisetouterineepithelialcellsinmice.stemcells2007；25：2820-2826.13.zhouy，gany，taylorhs.cigarettesmokeinhibitsrecruitmentofbonemarrow-derivedstemcellstotheuterus.reprodtoxicol2011；31：123-127.14.duh，naqvih，taylorhs.ischemia/reperfusioninjurypromotesandgranulocyte-colonystimulatingfactorinhibitsmigrationofbonemarrowderivedstemcellstoendometrium.stemcellsdev2012；21：3324-3331.15.morellis，rameshwarpandgoldsmithlt.experimentalevidenceforbonemarrowasasourceofnonhematopoieticendometrialstromalandepithelialcompartmentcellsinamurinemodel.biolreprod2013；89：7，1-7.16.aghajanoval，horcajadasja，estebanfj，giudicelc.thebonemarrowderivedhumanmesenchymalstemcell：potentialprogenitoroftheendometrialstromalfibroblast.biolreprod2010；82：1076-1087.17.urbichcanddimmelers.endothelialprogenitorcells：characterizationandroleinvascularbiology.circres.2004；95：343-35318.yud，wongym，cheongy，xiae，litc.ashermansyndrome-onecenturylater.fertilsteril2008；89：759-79.19.ravinajh，herbreteaud，ciraru-vigneronn，etal.arterialembolisationtotreatuterinemyomata.lancet1995；346(8976)：671-2).20.chaitanyabnagori，sonalypanchal，andhimanshupatel.endometrialregenerationusingautologousadultstemcellsfollowedbyconceptionbyinvitrofertilizationinapatientofsevereasherman′ssyndrome.jhumreprodsci；4(1)：43-48(2011)21.gargettce，healydl.generatingreceptiveendometriuminasherman′ssyndrome.jhumreprodsci，4(1)：49-52(2011)22.bradleyea，reidyjf，formanrg，jaroszj，braudepr.transcatheteruterinearteryembolisationtotreatlargeuterinefibroids.brjobstetgynaecol1998；105(2)：235-4023.dmowskiwp，greenblattrb.asherman′ssyndromeandriskofplacentaaccreta.obstetgynecol1969；34：288-299.24.ventolinig，zhangm，gruberj.hysteroscopyintheevaluationofpatientswithrecurrentpregnancyloss：acohortstudyinaprimarycarepopulation.surgendosc2004；18：1782-1784.25.senturklm，erelct.thinendometriuminassistedreproductivetechnology.curropinobstetgvnecol.2008；20：221-228.26.sherg，fischjd.effectofvaginalsildenafilontheoutcomeofinvitrofertinzation(ivf)aftermultipleivffailuresattributedtopoorendometrialdevelopment.fertilsteril2002；78：1073-6.27.okusamiaa，mooreme，hurwitzjm，richlinss.acaseseriesofpatientswithendometrialinsufficiencytreatmentwithpentoxifyllineandalphatocopherol.fertilsteril2007；88：s200.28.brantincsaka，brownsteinmj，cassiani-ingonir，etal.cd45-positivebloodcellsgiverisetouterineepithelialcellsinmice.stemcells2007；25：2820-2826.29.rafiis，lydend.therapeuticstemandprogenitorcelltransplantationfororganvascularizationandregeneration.natmed.2003；9：702-12.30.uchidan，buckdw，hed，etal.directisolationofhumancentralnervoussystemstemcells.procnatlacadsci2000；97：14720-14725.31.sagrinatic，nettigs，mazzinghib，etal.isolationandcharacterizationofmultipotentprogenitorcellsfromthebowman’scapsuleofadulthumankidneys.jamsocnephrol2006；17：2443-2456.32.richardsongd，robsoncn，langsh，nealde，maitlandnj，collinsat.cd133，anovelmarkerforhumanprostaticepithelialstemcells.jcellsci2004；117：3539-3545.33.kordesc，sawitzai，müller-marbacha，etal.cd133+hepaticstellatecellsareprogenitorcells.biochembiophysrescommun2007；352：410-417.34.theamericanfertilitysocietyclassificationsofadnexaladhesions，distaltubalocclusion，tubalocclusionsecondarytotuballigation，tubalpregnancies，mulleriananomaliesandintrauterineadhesions.fertilsteril1988；49：944-55.35.gordonpr，leimigt，babarin-domera，etal.large-scaleisolationofcd133+progenitorcellsfromg-csfmobilizedperipheralbloodstemcells.bonemarrowtranspl2003；31：17-22.36.goodwinsc，spiesjb，worthington-kirschr，etal.uterinearteryembolizationfortreatmentofleiomyomata：long-termoutcomesfromthefibroidregistry.obstetgynecol.2008；111(1)：22-33.37.cervelloi，gil-sanchisc，santamaríax，cabanillass，díaza，fausa，pellicera，simónc.humanbonemarrow-derivedstemcellsimproveendometrialregenerationinamurineexperimentalasherman′ssyndromemodel.humanreprod2015，inpress.38.ashermanjg.amenorrhoeatraumatica(atretica).jobstetgynaecolbremp1948；55：23-30.39.donnezj，nisollem.hysteroscopiclysisofintrauterineadhesions(asherman’syndrome).indonnezj(ed)：atlasoflaseroperativelaparoscopyandhysteroscopy.newyork：press-parthernonpublishers1994：3-12.40.marchcm，managementofashermanssyndrome.reprodbiomedonline2011(1)：63-7641.singhn，mohantys，setht，shankarm，bhaskarans，dharmendras.autologousstemcelltransplantationinrefractoryasherman′ssyndrome：anovelcellbasedtherapy.jhumreprodsci2014；7：93-8.根据前面的描述，除了本文中所示和所述的那些之外，本发明的多种修改对于本领域技术人员将是明显的，并且落入所附权利要求的范围内。本发明的优点和目的不一定包括在本发明的每个实施方案中。当前第1页12