糖尿病性皮肤溃疡治疗的多功能性干细胞的制作方法

本发明涉及一种用于再生医学的细胞制剂。更具体而言，涉及一种包含对皮肤溃疡、包括由糖尿病引起的皮肤溃疡的皮肤组织的修复及再生有效的多能性干细胞的细胞制剂，以及使用该多能性干细胞的治疗皮肤溃疡的方法。

背景技术：

糖尿病被认为是伴随有持续的高血糖状态的疾病，是由多种多样的环境因素与遗传因素作用之后而产生的。血糖主要的调节因子是由胰岛素，高血糖，胰岛素缺乏、或抑制其作用的众多因子(例如，遗传因素、运动不足、肥胖、以及压力等)过多而产生的。糖尿病主要分为：因由自身免疫疾病等引起的胰胰岛素分泌功能低下而产生的1型糖尿病、以及将由伴随有持续的高胰岛素分泌的胰腺枯竭引起的胰胰岛素分泌功能的降低或胰岛素抵抗作为原因的2型糖尿病。在日本，糖尿病已成为现代的国民病，超过95％的糖尿病患者(据预测如果包含处于糖尿病发病危险中的人会超过2，000万人)患非胰岛素依赖性糖尿病，随着生活方式的变化，患者人数的增加已经成为问题。据推测在世界水平内，糖尿病患者的人数估计为约2亿人(非专利文献1)，在2006年，糖尿病治疗药的全球市场规模约为1万亿日元。这是因为糖尿病在市场规模及人口几乎均在第一位的原因。

糖尿病以及糖尿病的并发症如心脏疾病、肾功能衰竭以及失明等多种重症对个人造成影响，并且脚部并发症带来最大的损害。下肢全部截肢的40～70％与糖尿病有关，实际上，所有与糖尿病相关的下肢截肢的85％发生在脚部溃疡以后。在患有糖尿病的患者中，伴随着长期的并发症，出现脚部的溃疡等慢性皮肤溃疡的症状的风险程度增加。溃疡是由于局部缺血和/或神经损害的结果而引起的。局部组织的缺血是糖尿病性溃疡主要的发病原因。与大血管疾病相同，在被称为动脉粥样硬化、小血管疾病的微循环控制机构的损伤的过程中，糖尿病的患者具有被暴露于与非传导性动脉相关的皮肤灌注的、更大的风险中。在正常的状况下，血流增加以促进对损伤响应的愈合。然而，在存在有小血管疾病(以及局部缺血)的情况下，该反应显著变慢，并在低流量的微循环中有发生血栓症的倾向，这被认为在溃疡的发病机制中是重要的。另一方面，相对于其对症疗法或预防神经机能的进行性减退的任一种，神经障碍缺乏充分确立的疗法，使之成为糖尿病的主要的并发症。特别是，末梢神经病变的影响是复杂的。对糖尿病的神经损伤的诱发机制至今仍未得到解决，但据说其是多元的，涉及遗传因素、代谢及血管异常、以及缺乏有关的生长因子的扰动等。

针对上述这种难治性疾病，利用了多能性细胞的再生医学受到关注。作为这种细胞已知有来源于脂肪组织的基质细胞(asc)，一般认为不仅具有向脂肪细胞、血管的分化能力，还具有向多种系统的分化能力(非专利文献2～4)。报告有使用了该asc制备糖尿病小鼠的例子，尝试治愈局部缺血性伤口(非专利文献5)。此外，也有在具有末梢动脉障碍的患者的下肢的糖尿病性溃疡的临床治疗中应用来源于脂肪组织的再生细胞的例子报道(非专利文献6)。然而，仍然难以完全治愈伤口部位。

此外，作为从成年个体得到的具有分化能力的细胞，例如，已知具有向骨、软骨、脂肪细胞、神经细胞、骨骼肌等的分化能力的间充质细胞组分(msc)(非专利文献7及8)，但这些构成各种细胞的细胞群，其分化能力的实际情况并不清楚，在治疗效果上偏差大。此外，已经报道ips细胞来源于成年个体的多能性干细胞(专利文献1等)，但由于在ips细胞的建立上，除了需要极其复杂的操作，例如将特定的基因导入到作为皮肤成纤维细胞组分的间充质细胞，或特定的化合物导入到体细胞以外，ips细胞还具有高肿瘤形成能力，因此在临床应用中存在极高的障碍。

根据作为本发明的发明人之一的出泽的研究，存在于将ssea-3(stage-specificembryonicantigen-3)作为表面抗原进行表达的间充质细胞组分的多能性干细胞(multilineage-differentiatingstressenduringcells多向-分化应力持久细胞；muse细胞)承担间充质细胞组分所具有的多能性，其具有能应用于旨在组织再生的疾病治疗的可能性(专利文献2；非专利文献9～12)。然而，在皮肤溃疡的预防和/或治疗中使用muse细胞的实施例中，并没有明确得到所期待的治疗效果。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特许公报第4183742号

专利文献2：国际公开号wo2011/007900

非专利文献

非专利文献1：stumvoll.m.，etal.，lancet，vol.365，p.1333-1346(2005)

非专利文献2：rehman，j.，etal.，circulation，vol.109，p.1292-1298(2004)

非专利文献3：planat-benard，v.，etal.，circulation，vol.109，p.656-663(2004)

非专利文献4：miranvile，a.，etal.，circulation，vol.110，p.349-355(2004)

非专利文献5：kim，e.k.，etal.，plast.reconstr.surg.，vol.128，p.387-394(2011)

非专利文献6：marino，g.，etal.，j.surg.res.，vol.185，p.36-44(2013)

非专利文献7：dezawa，m.，etal.，j.clin.invest.，vol.113，p.1701-1710(2004)

非专利文献8：dezawa，m.，etal.，science，vol.309，p.314-317(2005)

非专利文献9：li，s.，etal.，cancergenetherapy，vol.12，p.600-607(2005)

非专利文献10：kuroda，y.，etal.，proc.natl.acad.sci.usa，vol.107，p.8639-8643(2010)

非专利文献11：wakao，s，etal.，proc.natl.acad.sci.usa，vol.108，p.9875-9880(2011)

非专利文献12：kuroda，y.，etal.，nat.protoco.，vol.8，p.1391-1415(2013)

技术实现要素：

发明所要解决的问题

本发明的目的在于，提供一种在再生医学中使用多能性干细胞(muse细胞)的医疗新用途。更具体而言，本发明的目的在于，提供一种含有muse细胞的、用于预防和/或治疗皮肤溃疡的细胞制剂。

用于解决问题的方案

本发明人等发现通过对糖尿病性皮肤溃疡小鼠在皮肤溃疡患部给予muse细胞，muse细胞能重建及修复皮肤组织，引起溃疡的愈合，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

[1]一种用于预防和/或治疗皮肤溃疡的细胞制剂，其包含有从生物体的间充质组织或培养的间充质细胞分离的ssea-3阳性的多能性干细胞。

[2]根据上述[1]中所记载的细胞制剂，其包含通过外部压力刺激来浓缩ssea-3阳性的多能性干细胞的细胞组分。

[3]根据上述[1]及[2]中所记载的细胞制剂，其中所述皮肤溃疡选自由糖尿病性皮肤溃疡、褥疮性溃疡、静脉淤血溃疡、动脉性溃疡、放射线溃疡、坏死性筋膜炎以及三度烧伤组成的组。

[4]根据上述[1]～[3]中所记载的细胞制剂，其中所述多能性干细胞为cd105阳性。

[5]根据上述[1]～[4]中所记载的细胞制剂，其中所述多能性干细胞为cd117阴性及cd146阴性。

[6]根据上述[1]～[5]中所记载的细胞制剂，其中所述多能性干细胞为cd117阴性、cd146阴性、ng2阴性、cd34阴性、vwf阴性以及cd271阴性。

[7]根据上述[1]～[6]中所记载的细胞制剂，其中所述多能性干细胞为cd34阴性、cd117阴性、cd146阴性、cd271阴性、ng2阴性、vwf阴性、sox10阴性、snai1阴性、slug阴性、tyrp1阴性以及dct阴性。

[8]上述[1]～[7]中所记载的细胞制剂，其中所述多能性干细胞是具有以下所有性质的多能性干细胞，：

(i)端粒酶活性低或无；

(ii)具有分化为三个胚层中的任一种细胞的能力；

(iii)不显示肿瘤性增殖；以及

(iv)具有自我更新能力。

[9]根据上述[1]～[8]中所记载的细胞制剂，其中，所述多能性干细胞具有分化为选自由表皮角质细胞、血管内皮细胞、血管周皮细胞、脂肪细胞、前脂肪细胞、皮肤成纤维细胞以及神经鞘细胞组成的组中的一种及以上的细胞的能力。

发明效果

本发明对患有皮肤溃疡的对象，在皮肤溃疡患部给予muse细胞，通过该患部muse细胞分化为构成皮肤组织的细胞的皮肤组织再生机理，来抑制皮肤溃疡的发展并修复皮肤组织。

附图说明

图1的a为：由于通常在小鼠中，本来伤口愈合能力高，伤口很快就会愈合，因此在评价药剂的伤口愈合效果时伤口愈合的差异不明确。因此在伤口愈合效果的评价中使用以伤口愈合难以进行为特征的、具有糖尿病的免疫缺陷小鼠。为了诱发1型糖尿病，对绝食了24小时的5周龄的雄性scid小鼠腹腔内注射链脲霉素(stz)。在给予stz(150mg/kg)3天后，调查高血糖(血中葡萄糖＞300mg/dl)。在未发现高血糖的情况下，再次给予stz(150mg/kg)。在9周龄的dm-scid小鼠的背部制作皮肤缺损。b为：显示典型的血糖值的变化。绝大多数的小鼠通过1次或2次stz注射变为高血糖。

图2为已知msc分泌在伤口愈合的炎症期及细胞生长期所需要的生长因子。因此，在低氧(1％o2)或正常氧(6％o2)条件下利用elisa测定培养了48小时的muse细胞组分及间充质细胞组分(msc)中的生长因子产生的相对值。测定的细胞因子(生长因子)包括hgf、sdf-1、pdgf-bb、vegf、egf、tgf-β、ngf-β、scf、bfgf以及tnf-α。y轴表示450nm处的吸光度。值是平均值±sd(n＝3)。＊：p＜0.05。

图3为在第14天依次评价皮肤缺损(直径6mm)的伤口愈合。拍摄伤口区域，使用数字图像分析软件计算相对于原来的创口大小的伤口区域的比例(％)。在scid小鼠中，本来与野生型小鼠(wt)相比发现伤口愈合稍微较慢，但由stz诱发的dm-scid小鼠的伤口愈合比scid小鼠还慢。用muse细胞群处理的dm-scid小鼠的伤口闭合，比未处理dm-scid小鼠显著快，此外，与用msc处理了的dm-scid小鼠相比，muse细胞群处理的小鼠显示出良好的伤口愈合。＊p＜0.05。

图4为用muse细胞或msc处理了的dm-scid伤口的人高尔基复合体的免疫组织学的分析结果。在14天后，在用muse细胞及msc处理的两个伤口区域的表皮及上层中，观察到人高尔基复合体阳性细胞(与移植muse细胞相当)。然而，在周围的未受伤的区域的任一个群中均未检测到人高尔基复合体阳性细胞。muse细胞处理样本比msc处理样本更高频率地检测出移植人细胞。

图5为表征移植的muse细胞，进行了人高尔基复合体及分化标记物(pecam-1)的双重免疫组织化学染色。由于表达人高尔基复合体的一些细胞在pecam-1上为阳性，因此启示出向真皮内的血管内皮细胞的分化。

具体实施方式

本发明涉及一种用于预防和/或治疗皮肤溃疡的细胞制剂，其含有ssea-3阳性的多能性干细胞(muse细胞)。以下对本发明进行详细地说明。

1.适用疾病

本发明使用含有ssea-3阳性的多能性干细胞(muse细胞)的细胞制剂，其目的在于预防和/或治疗皮肤溃疡。此处，所谓“皮肤溃疡”，是指通常由炎症引起的组织表面的缺损(暴露于真皮或皮下组织)造成的皮肤上的伤害。通过本发明的细胞制剂能够预防和/或治疗的皮肤溃疡并没有限定，其包含糖尿病性皮肤溃疡、褥疮性溃疡、静脉淤血溃疡、动脉性溃疡、放射线溃疡、坏死性筋膜炎以及三度烧伤等。所谓“糖尿病性皮肤溃疡”，是指由高血糖引起的血管内皮细胞的损伤造成的极度难治性皮肤溃疡，例如糖尿病性足部溃疡和糖尿病性小腿部溃疡。所谓“压力性溃疡”，意味着长时间施加在皮肤区域的压力造成的慢性溃疡。这种伤口经常也被称为褥疮。“静脉淤血溃疡”是由来自破损静脉的血液或其他液体的淤血引起的。“动脉性溃疡”意味着血流不畅的动脉周围的区域的坏死皮肤。“放射线溃疡”是指在受到放射线照射的皮肤上产生的溃疡。“坏死性筋膜炎”是指将浅层筋膜作为细菌感染的主要地点，随后坏死迅速扩散的软组织炎症。此外，“三度烧伤”意味着延伸到全部真皮层和皮下组织的烧伤。根据本发明，本发明的细胞制剂在糖尿病性皮肤溃疡的预防和/或治疗方面特别有效。

2.细胞制剂

(1)多能性干细胞(muse细胞)

本发明的发明人之一的出泽在生物体内发现本发明的细胞制剂中所使用的多能性干细胞的存在，并将该细胞命名为“muse(multilineage-differentiatingstressenduring)细胞”。muse细胞能从骨髄液、脂肪组织(ogura，f.，etal.，stemcellsdev.，vol.23，p.717-728(2014))或真皮结缔组织等的皮肤组织获得，也分布于各个内脏器官的结缔组织。此外，该细胞是具有多能性干细胞和间充质干细胞两种性质的细胞，例如，被鉴定为对“ssea-3(stage-specificembryonicantigen-3)”和“cd105”的各个细胞表面标记物的双阳性。因此，例如，能以这些抗原标记物作为指示剂，将muse细胞或含有muse细胞的细胞群从生物体组织分离出来。此外，通过长期暴露于由低氧、或蛋白酶例如胰蛋白酶、分散酶等引起的应激，能浓缩含有muse细胞的细胞群。muse细胞的分离、鉴定以及特征等的详细情况在国际公开号wo2011/007900中进行了公开。此外，如wakao等人(2011，如上述)的报告，已知在从骨髄、皮肤等培养间充质细胞，将它们作为muse细胞的亲本群体来使用的情况下，所有ssea-3阳性细胞均是cd105阳性细胞。因此，在本发明的细胞制剂中，在生物体的间充质组织或培养的间充质干细胞分离muse细胞的情况下，能仅将ssea-3作为抗原标记物来纯化并使用muse细胞。此外，在本说明书中用于治疗皮肤溃疡的细胞制剂，将ssea-3作为抗原标记物，从生物体的间充质组织或培养间充质组织分离的多能性干细胞(muse细胞)或含有muse细胞的细胞群可以简单地描述为“ssea-3阳性细胞”。

简单而言，通过单独使用抗体到作为细胞表面标记物对应的ssea-3，或同时使用各个抗体到ssea-3及cd105，能将muse细胞或含有muse细胞的细胞群，从生物体组织(例如，间充质组织)进行分离。此处，所谓“生物体”，是指哺乳动物的生物体。在本发明中，对于生物体而言，不包含受精卵、胚胎在开始发育阶段到囊胚期，但包含胎儿、包含囊胚及囊胚期以后的发育阶段的胚胎。对于哺乳动物而言包括但不限于人、猴子等的灵长类；小鼠、大鼠、家兔、豚鼠等的啮齿类；猫、狗、羊、猪、牛、马、驴、山羊、鼬等。在本发明的细胞制剂中所使用的muse细胞，在以具有直接标记物的方式从生物体的组织进行分离的观点方面，明确区别于胚胎干细胞(es细胞)、ips细胞。此外，所谓“间充质组织”，是指如骨、骨膜、脂肪、血液、骨髄、骨骼肌、真皮、韧带、肌腱、牙髓、脐带、脐带血等组织及各种内脏器官。例如，muse细胞能从骨髄、皮肤、脂肪组织获得。例如，优选选取生物体的间充质组织，从该组织分离muse细胞，进而来利用。此外，也可以使用上述分离方法，从成纤维细胞、骨髄间充质干细胞等的培养间充质细胞分离muse细胞。需要说明的是，在本发明的细胞制剂中，所使用的muse细胞相对于接受细胞移植的接受者可以是自体或异体。

如上所述，muse细胞或含有muse细胞的细胞群，例如，能因其ssea-3阳性、及ssea-3和cd105的双重阳性作为标记从生物体组织分离，但已知在人成人皮肤中，含有各种类型的干细胞及前体细胞。然而，muse细胞与这些细胞并不相同。对于这种干细胞及前体细胞而言，可以举出来源于皮肤的前体细胞(skp)、神经嵴干细胞(ncsc)、成黑素细胞(mb)、血管周围细胞(pc)、内皮前体细胞(ep)以及来源于脂肪的干细胞(adsc)的例子。能将在这些细胞中固有的标记物的“非表达”作为标记，分离muse细胞。更具体而言，muse细胞能将选自由cd34(ep及adsc的标记物)、cd117(c-kit)(mb的标记物)、cd146(pc及adsc的标记物)、cd271(ngfr)(ncsc的标记物)、ng2(pc的标记物)、vwf因子(血管假性血友病因子)(ep的标记物)、sox10(ncsc的标记物)、snai1(skp的标记物)、slug(skp的标记物)、tyrp1(mb的标记物)以及dct(mb的标记物)组成的组中的、11个标记物中的至少1个，例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或者11个标记物的非表达作为标记进行分离。例如，虽然没有限定，但能将cd117及cd146的非表达作为标记进行分离，进而，能将cd117、cd146、ng2、cd34、vwf以及cd271的非表达作为标记进行分离，进而，能将上述11个标记物的非表达作为标记进行分离。

此外，在本发明的细胞制剂中所使用的、具有上述特征的muse细胞还可以具有选自以下至少1个性质：

(i)端粒酶活性低或无；

(ii)具有分化为三胚层的任一种胚层细胞的能力；

(iii)不显示肿瘤性增殖；以及

(iv)具有自我更新能力。在本发明的一个方面中，在本发明的细胞制剂中所使用的muse细胞具有上述所有的性质。此处，关于上述(i)，所谓“端粒酶活性低或无”，例如，是指在使用trapezexltelomerasedetectionkit(millipore公司)检测端粒酶活性的情况下，检测结果低或无法检测。所谓端粒酶活性“低”，例如，是指具有与作为体细胞的人成纤维细胞同等程度的端粒酶活性，或者与hela细胞相比具有1/5以下，优选具有1/10以下的端粒酶活性。对于上述(ii)，muse细胞在体内和体外，具有分化为三胚层(内胚层系、中胚层系以及外胚层系)的能力，例如，通过以体外的方式进行诱发培养，能够分化为肝细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、骨细胞以及脂肪细胞等。此外，在移植到睾丸的情况下有时也显示出以体内的方式分化为三胚层的能力。进而，通过利用静脉注射移植到生物体内，具有迁移及附着到受损伤的内脏器官(心脏、皮肤、脊髄、肝以及肌肉等)，分化为与组织相对应的细胞的能力。对于上述(iii)，muse细胞具有所谓的在悬浮培养中以增殖速度约为1.3天的方式进行增殖，在悬浮培养中从1个细胞开始增殖，形成类胚胎状样细胞块，到14天左右增殖停止的性质，但当将这些类胚胎状样细胞块进行贴壁培养时，细胞生长再次开始，从细胞块增殖的细胞开始逐渐扩散。进而在移植到睾丸的情况下，具有至少半年时间不癌化的性质。此外，对于上述(iv)，muse细胞具有自我更新(自己复制)能力。此处，所谓“自我更新”，是指能确认从类胚胎状样细胞块中所含的细胞向三胚层的细胞分化，其中所述类胚胎状样细胞块是通过从一个muse细胞以悬浮培养的方式进行培养所得到的，同时能确认通过将类胚胎状样细胞块的细胞再次以1个细胞进行悬浮培养，使其形成下一代的类胚胎状样细胞块，从此开始再次向三胚层的细胞分化和悬浮培养中的类胚胎状样细胞块。使自我更新重复进行1个或多个周期即可。

(2)细胞制剂的制备及使用

本发明的细胞制剂没有限定，但能够通过将上述(1)中所得到的muse细胞或含有muse细胞的细胞群悬浊于生理盐水、适当的缓冲液(例如，磷酸缓冲生理盐水)中获得。在该情况下，在从自体或异体组织分离的muse细胞数少的情况下，也可以在细胞移植前培养细胞，直至获得规定的细胞浓度再进行增殖。需要说明的是，如已经报告的那样(国际公开号wo2011/007900)，由于muse细胞不肿瘤化，因此即使从生物体组织回收的细胞保持未分化的状态，癌化的可能性也低，是安全的。此外，虽然没有特别限定，回收的muse细胞能在通常的生长培养基(例如，含有10％小牛血清的α-最小基本培养基(α-mem))中进行。更详细而言，能参照上述国际公开号wo2011/007900，在muse细胞的培养及增殖中，适当地选择培养基、添加物(例如，抗生素、血清)等，制备含有规定浓度的muse细胞的溶液。在将本发明的细胞制剂给予受试者的情况下，从人的髂骨提取数ml左右的骨髄液，例如，在将从骨髄液来的骨髄间充质干细胞作为黏附细胞进行培养、增加到能分离有效的治疗量的细胞量的muse细胞之后，能将ssea-3的抗原标记物作为标记分离muse细胞，将自体或异体的muse细胞作为细胞制剂进行制备。此外，能通过将muse细胞暴露于低氧、蛋白酶等的压力下浓缩含有muse细胞的细胞群，作为细胞制剂来进行制备。或者，例如，能在将ssea-3的抗原标记物作为标记分离muse细胞后，在培养细胞增加达到有效的治疗量后，将自体的muse细胞作为细胞制剂来进行制备。

此外，在细胞制剂中使用muse细胞的情况下，为了保护该细胞可以在细胞制剂中含有二甲基亚砜(dmso)、血清白蛋白等，为了防止细菌的污染及增殖也可以含有抗生素等。进而，在细胞制剂中也可以含有药理学上容许的其他成分(例如，载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浊剂、安抚剂、稳定剂、保存剂、防腐剂以及生理盐水等)、间充质干细胞中所含的muse细胞以外的细胞或成分。本领域技术人员能向细胞制剂以适当的浓度添加这些因子及药剂。如此，muse细胞也能作为含有各种添加物的药物组合物来使用。

在上述制备的细胞制剂中，为了在皮肤溃疡的治疗中得到所需的效果(例如，皮肤组织的重建等)，所含有的muse细胞数，能考虑对象的性别、年龄、体重、患部的状态以及使用的细胞的状态等，进行适当地调整。在后述的实施例3～5中，对于通过给予链脲霉素(stz)制作的免疫缺陷糖尿病小鼠模型，研究了由muse细胞移植进行的各种效果。对于大约20～30g的scid小鼠，通过在患部给予ssea3阳性细胞1.0×10⁵细胞/头，得到了非常优异的效果。从该结果可以期待通过给予体重换算每个哺乳动物3.3～5×10⁶细胞/kg的细胞量可以得到优异的效果。需要说明的是，设为对象的个体包含但不限于小鼠、人。此外，本发明的细胞制剂，可以在患部或静脉内多次(例如，2～10次)、适当间隔(例如，1天2次、1天1次、1周2次、1周1次、2周1次、1个月1次、2个月1次、3个月1次以及6个月1次)地给予，直到可以获得所需的治疗效果。因此，虽然根据对象的状态调整，但作为治疗上的有效量，优选地例如，一个个体1×10³细胞～1×10⁷细胞、1～10次的给予量。一个个体的投与总量包括但不限于，例如1×10³细胞～1×10⁸细胞、1×10⁴细胞～5×10⁷细胞、2×10⁴细胞～2×10⁷细胞、5×10⁴细胞～5×10⁶细胞、1×10⁵细胞～1×10⁶细胞等。

3.小鼠糖尿病性皮肤溃疡模型的制作和由muse细胞的治疗效果

在本说明书中，为了研究由本发明的细胞制剂对皮肤溃疡的治疗效果，构建和使用了小鼠糖尿病性皮肤溃疡模型。虽然没有特别的限定，但一般而言，作为该模型使用的小鼠可以例如scid小鼠、balb/c小鼠。糖尿病性皮肤溃疡模型通过对这些小鼠腹腔内给予链脲霉素(stz)制作而得。stz是葡萄糖的衍生物，对胰腺的β细胞造成损伤，可以用于使动物出现糖尿病的症状。根据本发明，stz的给药量，优选为150mg/kg1次，也可以多次给药。

由于本发明的细胞制剂是来源于人的muse细胞，与给予了该制剂的小鼠是异种的关系。通常，在模型动物中在给予了异种的细胞等的实验中，为了在异种细胞的生物体内抑制排斥反应，在异种细胞的给予前或给予同时给予免疫抑制剂(环孢菌素等)。至此，本发明的发明人等先前发现，若作为muse细胞的母本间充质细胞先天具有强的免疫抑制，则muse细胞也具有相同的作用。因此，在本发明中，除了scid小鼠以外，在未使用免疫抑制剂的小鼠模型中也可以使用免疫抑制剂。

在本发明的实施方式中，本发明的细胞制剂能治疗患者的皮肤溃疡，重建正常的皮肤。此处，所谓“重建正常的皮肤”，意味着具有皮肤溃疡的患部的伤口愈合，变成完全治愈的状态。重建了的皮肤的状态，是表面全部被上皮角质细胞覆盖的状态，优选上皮化完成的状态。进而，进一步优选在上皮的下面构建了具有足够厚度真皮的状态。进而更优选汗腺和/或毛囊等的皮肤附属器再生了的状态。

根据本发明的其他的方式，通过将muse细胞在低氧状态(例如，氧浓度1％)下进行培养，能使muse细胞分泌各种细胞因子(参照实施例3)。因此，根据本发明，可以提供一种提高vegf、egf、pdgf-bb、ngf-β、scf、tnf-α、bfgf以及tgf-β的至少任一种细胞因子的生产能力的方法。

通过以下的实施例，进一步对本发明进行具体的说明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。

实施例

实施例1：人muse细胞的制备

(1)人组织的取样及细胞分离

得到东京大学医学系研究科的伦理委员会的认可，通过吸脂手术从取得知情同意的5个女性非肥胖患者(年龄＝26.6±8.7，bmi＝21.5±2.0)的腹部和/或大腿得到了脂肪抽取物。从抽取的脂肪进行分离含有来源于脂肪的干细胞/间质细胞(asc)的间质血管组分(svf)，如前文所述(参照yoshimurak，etal.，j.cellphysiol.，vol.208，p.64-76(2006)参照)。简单而言，用pbs清洗抽取的脂肪组织，在37℃下振荡器上，在含有0.075％的胶原酶的pbs中进行消化30分钟。通过离心分离将成熟脂肪细胞及结缔组织与沉淀分离。重悬细胞沉淀，以100μm、70μm以及40μm的网眼进行过滤和裂解。将含有来源于脂肪的基质/干细胞的(asc)细胞沉淀(相当于svf)，在含有补充了10％胎牛血清(fbs)的杜尔贝科改良鹰培养基(dmem；nissui、tokyo、japan)的培养皿中进行培养。在从培养开始约2周时间后，使用相同培养基传代培养增殖了的hasc。使用含有2mm的edta的0.25％胰蛋白酶，在37℃下5分钟的过程中对第二代的传代培养hasc进行回收，然后用于muse细胞的分离。

(2)muse细胞的分离

为了回收ssea-3阳性的muse细胞，使用了磁激活细胞分选装置(magnetic-activatedcellsorting(macs)，automacs，miltenyibiotec，bergischgladbach，germany)。由于muse细胞在其表面表达ssea-3，因此在macs分离muse细胞中使用藻红蛋白(pe)(1：3稀释，miltenyibiotec)及抗pe微珠(1：2稀释，miltenyibiotec)结合的抗ssea-3抗体。将用微珠标记了的目标细胞在磁场内进行捕捉，然后作为阳性组分进行回收。未与磁性柱结合的细胞溶液，作为阴性组分进行回收。为了更好地纯化muse细胞，使用macs程序，以非常慢的速度将细胞溶液两次添加到磁性柱上。将得到的阳性细胞组分作为muse细胞群，另一方面，将阴性细胞组分作为间充质细胞组分(msc)，在以下的实施例中进行使用。

实施例2：免疫缺陷糖尿病小鼠模型的制成

从cleajapan，inc.(tokyo，japan)购买5周龄的雄性重症复合免疫缺陷(scid)小鼠(c.b17/icr-scid，scid/scid)。所有的动物实验，均是在得到东京大学的机构动物管理使用委员会的认可之后进行实施的。在使scid小鼠禁食24小时后，在腹腔内注射含有新鲜制备的链脲霉素(stz；150mg/kg，sigma-aldrich，st.louis，mo)的柠檬酸盐缓冲盐水(ph4.5)。在stz注射后的第3天，使用血糖仪及测试条(glucosepilot，aventirbiotechllc，carlsbad，ca)测定血糖水平。当血糖水平超过300mg/dl时，则认为小鼠具有糖尿病(dm)。在未显示高血糖(＞300mg/dl)的小鼠中，进行第二次的stz注射(150mg/kg)，在3日后检测其血糖水平(图1a)。

为了评价皮肤伤口的愈合，如前所述在小鼠的背部制作皮肤缺损(参照galiano，r.d.，etal.，woundrepairregen.，vol.12，p.485-492(2004)；tepper，o.m.，diabetes，vol.10，2337/db09-0185)。简单而言，通过逐个进行戊巴比妥(65mg/kg)的腹腔内注射来麻酔小鼠。在用电推子及脱毛膏进行背部除毛后，使用消毒过的圆形的活检穿孔器(kaiindustriesco.，tokyo，japan)，在小鼠的背部产生贯通皮肤肌肉层的2个全层皮肤伤口(直径6mm)。为了避免伤口的收缩，贴上环形硅夹板(内径及外径分别为9以及15mm；1.0mm厚度的硅橡胶片，kyowaindustries，saitama，japan)，使用6-0尼龙的缝合线进行固定(图1a)。为了伤口的干燥及防止疮痂形成使用密封绷带(perme-roll，nittomedical，osaka，japan)。

准备5个实验群：野生型小鼠、非dm-scid小鼠、dm诱导的scid小鼠、用muse细胞群处理的dm诱导的scid小鼠以及用间充质细胞组分(msc)处理的dm诱导的scid小鼠。每群使用6只小鼠。将muse细胞(1.0×10⁵细胞/小鼠)与0.1ml交联的透明质酸(restylane，q-med，uppsala，sweden)混合后，皮下注射到伤口周边。调查肉眼可见的伤口闭合的时间(直到上皮完全再生的天数)。使用普通的数码相机(ixydigital90，canon，tokyo，japan)，在第0、3、7、10以及14天依次拍摄伤口。使用图像分析软件(photoshopcs6，adobesystems，sanjose，ca)评价照片测定伤口面积。

实施例3：细胞因子生产试验(elisa法)

已知msc分泌伤口愈合的炎症期及细胞生长期所需要的生长因子(例如，pdgf、bfgf、tgf-β以及egf等)(maxson，s.，etal.，stemcellstransl.med.，vol.1，p.142-149(2012))。因此，在低氧条件下及正常氧条件下，体外培养muse细胞群及msc，研究培养液中所分泌的细胞因子。以如下方式进行实验。在60mm培养皿接种4.0×10⁵个的muse细胞群及msc，在无血清的dmem中，在低氧(1％o2)或正常氧(6％o2)条件下进行培养。48小时后，回收培养培养基，使用0.22μm过滤器(millex-gvfilter，millipore，billerica，ma)进行过滤。使用用于肝细胞生长因子(hgf)及基质细胞衍生因子1(sdf-1)的elisa试剂盒(两者均为r&dsystems，minneapolis，mn)，以及用于血管内皮生长因子(vegf)、上皮生长因子(egf)、血小板衍生生长因子(pdgf-bb)、神经生长因子-β(ngf-β)、干细胞因子(scf)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)以及转化生长因子-β(tgf-β)(signosis#ea-1101，santaclara，ca)的细胞因子芯片试剂盒，比较研究分泌的细胞因子量。使用infinite酶标仪(m1000，tecangroup，mannedorf，switzerland通过分光光度法)在450nm处测定吸光度。

在正常氧(6％o2)或低氧(1％o2)条件下muse细胞群以及msc贴壁培养，比较48小时后的培养培养基中的细胞因子的浓度的结果显示在图2中。与在相同的氧分压下培养的msc相比，muse细胞群释放出更大量的egf、pdgf-bb、ngf-β、scf、tnf-α、bfgf以及tgf-β。进而，在muse细胞群中，低氧条件下的vegf、egf、pdgf-bb、ngf-β、scf、tnf-α、bfgf以及tgf-β的浓度，比正常氧条件较高。

实施例4：dm-scid小鼠的伤口愈合

链脲霉素(stz)通过损伤胰腺β细胞诱发1型dm，但stz的给予用量及方法与迄今为止的报告(参照schmidt，r.e.，etal.，am.j.pathol.，vol.163，p.2077-2091(2003)；lee，r.h.，etal.，proc.natl.acad.sci.usa.，vol.103，p.17438-17443(2006)；schmidt，r.e.，etal.，exp.neurol.，vol.209，p.161-170(2008))不同。当给予200mg/kg的stz时，scid小鼠大多数由于重度的体重减少及代謝异常，在给药的1周时间以内就会死亡。然而，当向禁食24小时后的scid小鼠注射150mg/kg的stz时，能比较一致地诱发高血糖，dm状态(＞300mg/dl的血中葡萄糖)持续超过30天(图1b)。在伤口愈合实验中，在30天间使用单次(29只中的9只小鼠；31.0％)或两次(29只中的13只小鼠；44.8％)的stz注射scid小鼠，在最后注射stz以后，成功地诱导了scid小鼠的dm。

在与野生型(wt)小鼠(n＝6)或非dm-scid小鼠(n＝6)比较的情况下，dm-scid小鼠的伤口愈合显著延迟(图3)。wt及非dm-scid小鼠在第7天分别显示出56.9±12.0％及67.5±6.5％的伤口大小，但dm-scid小鼠(n＝6)显示出95.4±3.1％的伤口大小(wtvs.dm-scid；p＜0.0001)。此外，即使在第14天，dm-scid小鼠也显示出比wt或非dm-scid小鼠大的伤口大小。因此，能确认dm-scid小鼠是具有伤口愈合障碍的免疫缺陷的动物模型。

通过皮下注射muse细胞群或msc来进行处理dm-scid小鼠的皮肤伤口。用muse细胞处理的dm-scid小鼠(n＝6)显示出比用msc处理了的dm-scid小鼠(n＝6)更优异的伤口愈合。在第7天，用muse细胞及msc处理了的dm-scid小鼠的伤口大小分别为51.05±7.2％及74.0±6.6％(p＜0.0001)。在第14天，在用muse细胞处理了的dm-scid小鼠中伤口完全愈合，但用msc处理了的dm-scid小鼠的伤口大小仍为30.3±6.7％(p＝0.0235)。在用muse细胞处理的dm-scid小鼠中，伤口愈合比得上wt群的伤口愈合。

实施例5：组织学的分析

将小鼠皮肤样本包埋于oct化合物(sakurafinetek，tokyo，japan)中，在液氮中进行冻结，并在-80℃下进行保存直至切片。将冷冻切片(8μm)置于载玻片上，在室温下干燥20分钟，然后用4％多聚甲醛(pbs中)固定1分钟，用pbs清洗5分钟。用苏木精及曙红(h&e)对载玻片进行染色，并进行免疫组织化学分析。

如上所述(参照kuroda，y.，etal.，proc.natl.acad.sci.usa.，vol.107，p.8639-8643(2010))实施免疫组织化学分析。为了通过辣根过氧化物酶(hrp)反应检测人高尔基体蛋白质，将切片在含有0.3％双氧水的甲醇中处理30分钟，以使内因性过氧化物酶活性失活，用兔子抗人58k高尔基体蛋白质(1：100稀释，abcam，cambridge，uk)及驴抗兔子igg-hrp(1：500稀释，jacksonimmunoresearch，westgrove，pa)依次进行温育。通过使用3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(dab)的过氧化物酶反应显示人58k高尔基蛋白质的表达。将冻结切片与以下的第一抗体一起进行温育，用共焦距激光显微镜观察：小鼠抗人线粒体(1：100稀释，abcam)、兔抗人58k高尔基体蛋白质、兔抗人-ck14(1：200稀释，abcam)或山羊抗人血小板内皮细胞粘附分子-1(pecam-1；1：50稀释，santacruzbiotechnology，santacruz，ca)。接着，将切片与以下的第二抗体一起进行温育：驴抗小鼠igg-alexa488、驴抗兔igg-alexa680或者兔抗山羊igg-alexa488(全部1：500稀释，invitrogen，carlsbad，ca)。细胞核用dapi进行对比染色，使用共焦距显微镜(c1sinikon，nikon，tokyo，japan)进行检查。

通过人高尔基复合体的免疫组织学的分析，显示出在第14天，在用muse细胞群及msc处理了的各个样本中，在伤口区域的表皮及真皮上层中，检测到了移植细胞。然而，在周围的的未受损区域未发现人高尔基复合体+细胞(图4)。此外，在皮下层检测到注入的透明质酸的沉积。进而，真皮内的一些人高尔基复合体+细胞对h-pecam-1也是阳性(图5)。这些数据表明，移植的muse细胞能在表皮及真皮的任一个中存活，并且分化为表皮角质细胞及血管内皮细胞。

产业上的可利用性

本发明的细胞制剂，通过给予到糖尿病性皮肤溃疡小鼠模型的皮肤溃疡患部，能重建及修复皮肤组织，能应用于糖尿病性皮肤溃疡的治疗。

本说明书中引用的所有的出版物及专利文献，由于参照作为全体均在本说明书中被援用。需要说明的是，尽管为了示例的目的，在本说明书中对本发明的特定的实施方式进行了说明，但本领域技术人员应该能容易地理解，只要不脱离本发明的精神及范围，就能够对其进行各种改变。