交联pH响应跨膜小肽的金纳米星材料及其应用的制作方法与工艺

本发明涉及一种金纳米星材料的制备，具体涉及一种交联具有pH响应的穿膜小肽pHLIP的金纳米星材料的制备及其应用。

背景技术：
肿瘤的治疗研究具有重大的医学和社会意义，是提高我国居民健康的重大迫切需求。传统的抗肿瘤治疗主要包括化疗或物理治疗，但均是有创性损伤，如某些化疗药物阿霉素、顺铂、丝裂霉素等本身具有极大的毒性，副作用大，通过静脉全身给药会严重影响正常细胞的机能，破坏免疫功能；大多数化疗药物体内循环时间较短，很难靶向肿瘤部位发挥药效，并且长时间的给药会使某些肿瘤细胞产生耐药性。纳米医学的发展为解决上述问题提供了新的方向，基于纳米载体治疗方式的探索为改善传统治疗方式，提高治疗疗效带来了新的契机。近红外(Nearinfraredfluorescence，NIR)激光技术以其特殊的波长范围(650nm～1000nm)，较强的光吸收和高效的光热转化率、低毒且非侵袭性，较好的生物相容性，深穿透能力等优点受到纳米医学研究领域的青睐。2015年，Shell等在AccountsofChemicalResearch(if：22.323，2015，48：2866-2874)高度评价近红外光热技术作为一种安全特异的刺激源在临床载药及治疗中的应用。其中，金纳米材料以其良好的生物相容性、低毒性、简单的合成步骤，在近红外区有强吸收并能转化成热能等优点受到广泛研究，本发明通过简单的合成方法制备出具有特殊形貌及理化性质的金纳米星材料，调整使其具有特定的近红外区吸收峰，并能高效的转换成热能，短时间内迅速提高材料富集区的温度，利用热效应杀死肿瘤细胞，避免引起全身毒性。同时，纳米材料在肿瘤部位的高选择通透性和滞留效应，即增强渗透滞留效应(enhancedpermeabilityandretentioneffect，EPR)，使得纳米材料本身具有被动靶向肿瘤的作用。但EPR效率容易受到肿瘤微环境如致密间质、突变细胞外基质、间质液压力，肿瘤病理生理异质性等的影响；另外，虽然EPR效应能够提高纳米载体在肿瘤组织的积聚，但细胞内化效率低及细胞内药物释放不足也干扰了抗癌药物的利用率。若达到较理想的靶向肿瘤治疗作用，需通过化学连接方法结合某些具有肿瘤靶向识别作用的生物分子，但这些生物分子在正常细胞中也会有表达，会导致边缘效应的发生。利用肿瘤特征性的微酸性环境来实现纳米材料的肿瘤靶向运输的策略越来越受到关注。新型穿膜小肽pHLIP可响应肿瘤微环境，在肿瘤pH酸性环境下迅速折叠并插入肿瘤细胞细胞膜形成稳定的跨膜α螺旋，并协助交联的材料进入细胞，提高细胞对材料的吞噬量，进而使材料更好的发挥作用。迄今为止尚无交联pH响应的跨膜小肽的金纳米星材料的制备及光热治疗应用的相关文献报道。

技术实现要素：
为了克服现有技术中存在的不足，本发明提出一种交联pH响应跨膜小肽pHLIP的金纳米星材料的制备与应用。技术方案：为解决上述技术问题，本发明的一种交联pH响应跨膜小肽的金纳米星材料通过如下方法制备得到：(1)用水分别配制2mM马来酰亚胺-聚乙二醇修饰的小肽pHLIP(所述多肽是序列为ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGTG的pHLIP肽)溶液和2mM氨基-聚乙二醇-巯基溶液，将两者按照摩尔比1∶0.8～1混合均匀，得到混合液。(2)2.5mL0.01M的氯金酸加入到97.5mL的水中，加热搅拌5min～10min，随后加入3mL1％的柠檬酸三钠，溶液颜色由无色变成暗红色，停止加热和搅拌，制得柠檬酸钠金溶液。(3)0.25mL0.01M的氯金酸溶液溶解在10mL水中，取0.1mL上述(2)的柠檬酸钠金溶液加入氯金酸溶液，在室温搅拌下，向该混合液中同时加入0.05mL0.1M硝酸银和0.04mL0.01M抗坏血酸，继续搅拌使溶液颜色由浅粉变成深蓝色，反应5～10min后加入0.02mL步骤(1)得到的混合物，然后将得到的产物离心、洗涤3次、弃上清，并分散至1mL水中，形成交联pH响应跨膜小肽的金纳米星材料储备液。优选地，所述步骤(2)中搅拌条件为800～1000转/分钟。步骤(2)中，离心条件为：相对离心力为7500～8000，离心10～15分钟。经过表征结果，利用本发明方法制备得到的金纳米星材料形状为多支状星型，比表面积大，尺寸小，直径为50～80nm。本发明进一步提出了上述交联pH响应跨膜小肽的金纳米星材料在制备用于肿瘤光热治疗药物中的应用。本发明中金纳米星采用改良的湿化学法合成，氨基-聚乙二醇-巯基首先与巯基化pHLIP交联，后修饰到金纳米星表面。交联小肽的金纳米星具有良好的生物相容性、水溶性、低毒性，且尺寸小，在生物环境中能保持较好的分散性，借助小肽在酸性环境下稳定插入细胞膜的性质，能提高肿瘤细胞对金纳米星的吞噬率，利用金纳米星良好的近红外光吸收和热转换的功能，杀死肿瘤细胞，提高治疗疗效。本发明制备得到的新型pH响应的小肽pHLIP在肿瘤pH酸性环境下能快速折叠，并能迅速插入到肿瘤细胞膜磷脂双分子层中，形成稳定的跨膜α螺旋；同时协助交联的材料快速被肿瘤细胞识别产生胞吞作用，提高细胞对纳米材料的吞噬量。此小肽pHLIP安全、生物相容性好、性质稳定，与易于表面修饰的金纳米星交联，提高金纳米星的细胞吞噬量；金纳米星高效的光热治疗作用可以迅速杀死富集材料的肿瘤细胞，显著提高治疗疗效，实现靶向肿瘤微酸性环境的光热治疗。因pHLIP靶向作用受到肿瘤酸性环境的调节，因此，此携带小肽的金纳米星体系可以广泛用于其他临床肿瘤的光热治疗，具有重要的应用前景。有益效果：本发明的交联具有pH响应的小肽的金纳米星材料，与现有技术相比，具有以下优点：1、该金纳米星材料在pH小于或等于6.4时可被细胞大量吞噬，在pH大于或等于7.4或不交联小肽时不易被细胞吞噬，这种性质可用于识别肿瘤特征性微酸环境；2、该金纳米星材料具有多支的星形结构，均一的尺寸，在酸性、中性及含蛋白的水溶液中均具有良好的生物相容性和分散性。3、该金纳米星材料具有近红外的吸收峰，其吸收光谱峰值在750～850nm之间，因此具备良好的近红外光热治疗作用。在近红外激光的照射下，能将光能转化成热能，迅速提高材料富集区的温度，杀死肿瘤细胞，降低材料未富集区的毒性，在肿瘤光热治疗方面具有重要的潜力。附图说明图1本发明在实施例1的工艺条件下制得的未交联小肽(左图)和交联小肽的金纳米星材料(右图)电子显微镜照片；图2本发明在实施例1的工艺条件下制得的交联小肽及未交联小肽的金纳米星材料紫外-可见光吸收光谱；图3本发明在实施例1的工艺条件下制得的交联小肽的具有pH响应的金纳米星材料在1W/cm2的808nm近红外激光照射下温度变化曲线；图4本发明在实施例1的工艺条件下制得的交联小肽的具有pH响应的金纳米星材料在pH6.4和pH7.4条件下的细胞吞噬定量分析；图5在实施例1的工艺条件下制得的交联小肽的具有pH响应的金纳米星在pH6.4条件下对细胞生长抑制作用；图6在实施例1的工艺条件下制得的交联小肽的具有pH响应的金纳米星在pH7.4条件下对细胞生长抑制作用。具体实施方式本发明公开了一种交联pH响应跨膜小肽的金纳米星材料的制备方法，通过将柠檬酸钠金溶液加入氯金酸溶液，在室温搅拌下，向该混合液中同时加入硝酸银和抗坏血酸，充分搅拌后加入pHLIP和聚乙二醇的混合物。相对于金纳米球颗粒未附有银离子的部位，表面附有银离子的部位金还原的速度更快，因此这些部位生长的速度更快，最终形成分支状的金纳米星结构。之后加入聚乙二醇交联的pHLIP混合物，通过巯基-巯基，氨基-巯基的相互作用，形成稳定的纳米结构。聚乙二醇的作用既能增强小肽与金纳米星之间的连接，又能提高整体纳米材料的生物相容性。在pH酸性环境下，pHLIP小肽迅速插入细胞膜并形成牢固的跨膜α螺旋结构，所交联的材料能较多的分布在肿瘤细胞膜周围，促使细胞大量吞噬。进入到细胞内的金纳米星材料具有稳定的分散性，并保持良好的近红外光热转化效率，在近红外激光的刺激下，能迅速提高材料富集区的表面温度，杀死肿瘤细胞。最终获得具有pH响应的靶向肿瘤进行光热治疗的金纳米星材料。由于pHLIP在肿瘤酸性环境下能广泛插入到细胞膜，所以本发明的金纳米星材料还能应用于其他肿瘤的光热治疗，提高肿瘤的治疗疗效。下面通过具体的实施例并结合附图对本发明作更进一步的说明。在下述实施例中，马来酰亚胺-聚乙二醇修饰的小肽pHLIP由南京莱昂生物科技有限公司合成；氨基-聚乙二醇-巯基溶液由上海西宝生物科技有限公司合成；实施例1：粒径为60nm左右的交联小肽的具有pH响应的金纳米星制备和鉴定。(1)用水分别配0.02mL、2mM的马来酰亚胺-聚乙二醇修饰的小肽pHLIP，及0.02mL、2mM氨基-聚乙二醇-巯基，并将两化合物充分混合，摇匀。(2)2.5mL0.01M的氯金酸加入到97.5mL的水中，加热搅拌5min～10min，随后加入3mL1％的柠檬酸三钠，溶液颜色由无色变成暗红色，停止加热和搅拌，制得柠檬酸钠金溶液。(3)氯金酸(0.25mL，0.01M)加入到10mL水中，混匀后加入0.1mL(2)中制备的柠檬酸钠金溶液，然后同时加入0.05mL0.1M还原剂抗坏血酸及0.04mL0.01M硝酸银，溶液颜色由浅粉变成深蓝色，初步制备金纳米星材料。(3)反应5分钟后，加入0.02mL步骤(1)所得的产物，室温搅拌1h，初步制备交联小肽的金纳米星材料。(4)将步骤(2)(3)所得产物分别离心(相对离心力为7500～8000，离心10～15分钟)、洗涤3次、弃上清，将材料分散至1mL水中，形成未交联和交联pH响应跨膜小肽的金纳米星材料，如图1。(5)测定步骤(4)所得的金纳米星材料的紫外-可见光吸收光谱，如图2所示。(6)将步骤(4)所得的交联pH响应跨膜小肽的金纳米星材料置于1W/cm2的波长为808nm的近红外激光照射下，记录温度变化如图3所示。本实施例中得到的未交联和交联pH响应跨膜小肽的金纳米星材料，均具有多枝状星形分支，如图1透射电镜扫描分析所示其直径约50～70nm，如图2所示紫外-可见光吸收光谱峰值均在750～850nm左右，如图3所示在近红外激光照射下，交联pH响应跨膜小肽的金纳米星材料温度迅速升高。实施例2：pH6.4及pH7.4条件下的细胞吞噬定量分析(1)无菌条件下，配置pH6.4的DMEM培养基，将950mL的DMEM水溶液培养基中先后加入4.93mL7.5％NaHCO3溶液和44.37mL5.2％NaCl溶液。之后加入10mL的青霉素/链霉素抗生素混合液，加入100mL的新鲜肽牛血清，经测定，获得pH6.4的DMEM培养基。而pH7.4的DMEM培养基，无需额外加入盐溶液，只加入10mL的青霉素/链霉素抗生素混合液和100mL的新鲜肽牛血清即可获得。(2)细胞培养：乳腺癌细胞系MCF-7于pH7.4的DMEM培养基中分裂生长，并放置在37℃，5％的CO2的细胞培养箱中培养。待细胞长到70％～80％的汇合度，分别更换新鲜pH6.4及pH7.4的培养基，并将制得的未交联和交联pH响应跨膜小肽的金纳米星材料溶于培养基中，使得材料终浓度为2mg/L。(3)待细胞与材料混合培养24h后，测定金纳米材料的细胞吞噬量：PBS缓冲液洗涤细胞，胰酶消化细胞后离心收集细胞，最终分散在3mLPBS中。取0.4mL的细胞PBS悬液，以每分钟950转速离心细胞5min，细胞沉淀中加入200μL的细胞裂解液，超声破碎、每分钟13000转速离心5min后，取上清测定蛋白浓度。剩余2.6mL细胞PBS悬液，再次离心后，向细胞沉淀中加入2mL的王水消化，在100℃的平台上蒸干，最终加入4mL2％的稀硝酸定容，用ICP测定金浓度。金纳米星细胞吞噬量＝总金浓度/总蛋白浓度。如图4，测量得pH6.4条件下，MCF-7细胞交联小肽的金纳米星吞噬量为0.67±0.12，未交联小肽的金纳米星的吞噬量为0.19±0.01；pH7.4条件下，MCF-7细胞交联小肽的金纳米星吞噬量为0.38±0.09，未交联小肽的金纳米星的吞噬量为0.15±0.05。实施例3：交联小肽的具有pH响应的金纳米星在pH6.4条件下对细胞生长抑制作用鉴定。将对数生长期的MCF-7细胞接种于96孔培养板，待细胞汇合度为80％左右后，每孔加入浓度为0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L及4mg/L的溶于pH6.4的DMEM培养基中的交联小肽的金纳米星颗粒，终体积为100μL，设五个复孔，孵育4h后，弃上清，PBS洗涤3遍后，加入100μL新鲜培养基，用1W/cm2的808nm近红外激光照射6min，另设对照组不照射激光，之后每孔加入四甲基偶氮唑蓝(5mg/mL)20μL，继续培养4h，小心吸弃上清液，加二甲基亚砜(200μL/孔)，震荡10min后，检测A570光密度值。肿瘤细胞生存率＝(实验组或对照组平均光密度值/阴性对照组平均光密度值)*100％。本实施例中在pH6.4条件下，交联pH响应小肽的金纳米星在没有近红外光照情况下，不引起细胞死亡；在酸性条件下，随着细胞吞噬材料增多，其光热作用增强，近红外激光照射下，肿瘤生长显著受到抑制。结果如图5所示。实施例4：交联小肽的具有pH响应的金纳米星在pH7.4条件下对细胞生长抑制作用鉴定。将对数生长期的MCF-7细胞接种于96孔培养板，待细胞汇合度为80％左右后，每孔加入浓度为0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L及4mg/L的溶于pH7.4的DMEM培养基中的交联小肽的金纳米星颗粒，终体积为100μL，设五个复孔，孵育4h后，弃上清，PBS洗涤3遍后，加入100μL新鲜培养基，用1W/cm2的808nm近红外激光照射6min，另设对照组不照射激光，之后每孔加入四甲基偶氮唑蓝(5mg/mL)20μL，继续培养4h，小心吸弃上清液，加二甲基亚砜(200μL/孔)，震荡10min后，检测A570光密度值。肿瘤细胞生存率＝(实验组或对照组平均光密度值/阴性对照组平均光密度值)*100％。本实施例中在pH7.4条件下，交联pH响应小肽的金纳米星在没有近红外光照情况下，不引起细胞死亡；在pH7.4条件下，由于小肽的靶向肿瘤酸性环境的作用较弱，细胞吞噬材料相对较少，随着材料浓度的增加，近红外激光照射下，肿瘤生长会受到抑制，但治疗结果显著弱于在酸性条件下的治疗结果。结果如图6所示。本发明在室温条件下，利用简单的步骤合成了稳定、无毒、分散性好的交联pHLIP的金纳米星材料。pHLIP可以响应肿瘤的酸性环境，稳定插入到肿瘤细胞膜磷脂双分子层中，并协助金纳米星被肿瘤细胞识别，提高细胞吞噬量。金纳米星本身具有近红外光热治疗效应，可以利用安全高效的光热治疗手段，杀死肿瘤细胞，最终实现靶向肿瘤微酸性环境的光热治疗的应用。在本发明中，交联pH响应的跨膜小肽的金纳米星在紫外-可见光吸收光谱峰值在750～850nm之间，在近红外激光照射下能迅速提高材料摄取部位的温度。交联pH响应的跨膜小肽的金纳米星，在pH小于或等于6.4的情况下，小肽pHLIP构型发生改变，插入肿瘤细胞膜，可被肿瘤细胞大量吞噬，在近红外激光的照射下，迅速产生高热并显著抑制肿瘤细胞生长；在pH大于或等于7.4或没有交联小肽的情况下，不易被细胞吞噬或吞噬量较少，在近红外激光照射下，不会显著抑制肿瘤细胞的生长。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。