一种光热疗剂/光声造影剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种具有肿瘤微环境(弱酸性和弱还原性)双重环境响应钼基多金属氧酸盐及其制备方法，该钼基多金属氧酸盐具有光声造影和光热疗功能，可作为用于实现肿瘤的早期诊断及特异性光热治疗的光声造影剂和光热疗剂，属于生物医用纳米材料技术领域。

背景技术：

近年来，随着肿瘤发展形势的日渐严峻，一些新兴的肿瘤治疗技术也开始受到临床的关注。由于治疗时间短、治疗效果明显以及对人体副作用小的特点，基于近红外光的光热疗技术逐渐受到研究者的青睐，为此，大量的相关研究工作主要聚焦于设计和开发能够满足临床需求近红外光热疗剂。目前近红外光热疗剂主要分为三类：1.特殊形貌的贵金属纳米材料。2.过渡金属氧化物和硫化物纳米材料。3.导电高分子纳米材料。虽然这些光热疗剂在实验室中均表现出了良好的生物安全性和高效的治疗效果，但是一种能够走向临床的光热疗剂必须首先满足：价格低廉、可批量生产、可稳定储存等要求，而这些最低要求是当前极少光热疗剂能完全满足的。其次，由于多数治疗过程需要静脉注射光热疗剂，而其在体内循环缺乏特异性，无法在病灶区高度富集，而外界激光难以保证高精度的病灶区照射，造成不可避免的正常组织损伤。因此，一种经济、可批量、稳定和高特异性的光热疗剂的研发迫在眉睫。

为实现肿瘤治疗的高特异性，基于肿瘤微环境的治疗策略，近年来逐渐成为新型诊疗剂研发的主要思路。肿瘤微环境主要包括：(1)由于活跃的无氧糖酵解产生大量酸性物质而导致的微酸性；(2)还原型谷胱甘肽的增多导致肿瘤呈现弱还原性。这两大肿瘤微环境特点在研究中常被用作为纳米药物输运系统的刺激开关，达到化疗药物瘤内可控释放的目的，以此提高药物输运系统对肿瘤的特异性。就现有光热疗剂而言，其光热转化能力仅取决于其浓度和外界激光功率密度，至今为止，仍没有一种能够响应肿瘤微环境的光热疗剂。而在实际光热治疗实施过程中，光热转换材料不可避免地分布在肿瘤周围的正常组织，外界激光的照射也不可避免地照射到这些非病灶区，也就产生极大的毒副作用。因此，设计开发一种具有肿瘤微环境响应的高特异性光热疗剂，将具有重要实际的意义和临床价值。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种经济、可批量、稳定和高特异性的光热疗剂和/或光声造影剂及其制备方法和应用。

一方面，本发明提供一种含有钼基多金属氧酸盐的光热疗剂和/或光声造影剂。

多金属氧酸盐(polyoxometalates，简称pom)指一些前过渡金属元素(如mo)以mox(x可以为4、6等)为单元缩聚形成的一类具有特殊性质和结构的无机金属氧簇化合物。多金属氧酸盐可根据成分不同分为同多金属氧酸盐(同多酸)和杂多金属氧酸盐(杂多酸)，同多酸为由一种含氧酸盐缩合脱水形成的，杂多酸为由两种或两种以上含氧酸盐缩合脱水形成的，其中杂多酸中包括杂元素和配元素(如mo)。本发明中，“钼基多金属氧酸盐”是指至少含有钼离子的多金属氧酸盐。本发明利用钼金属离子价态易变的特性，得到一种可根据肿瘤微环境智能调节光热效率的纳米材料，其光热效率受外环境氧化还原势的可逆调控，在肿瘤病灶区的还原氛围中呈现为还原态，具有高效的光热治疗功能，而在正常组织中呈现为氧化态，光热效应很弱；同时，钼基多金属氧酸盐纳米团簇的粒径尺寸随着ph值降低而自组装长大，利用这种在肿瘤微酸性条件下的质子俘获自聚集效应，用于提高静脉注射诊疗剂在瘤区富集量，由此保证肿瘤高效热疗的同时最大程度地保护正常组织，以实现恶性肿瘤的高精度分级治疗。这种自反馈调节的智能热疗剂为推动光热治疗技术的临床化进程具有重要意义。另外，钼基多金属氧酸盐还具有光声造影功能。因此钼基多金属氧酸盐可以用于制备光热疗剂和/或光声造影剂。

较佳地，所述钼基多金属氧酸盐为钼基杂多酸。本发明中，“钼基杂多酸”是指由配元素(mo)和不同于钼元素的杂元素按一定的结构通过氧原子配位桥联组成的含氧多酸。

较佳地，所述钼基多金属氧酸盐中的杂元素为p、si、b、al、ga、ge、sn、as、sb、bi、se、tc、i和所有第一、第二、第三过渡系元素中的至少一种。所述第一过渡系元素为sc、ti、v、cr、mn、fe、co、ni、cu、zn，所述第二过渡系元素为y、zr、nb、mo、tc、ru、rh、pd、ag、cd，所述第三过渡系元素为la、hf、ta、w、re、os、ir、pt、au、hg和所有镧系元素。

较佳地，所述钼基多金属氧酸盐为钼蓝。所述钼蓝为钼基多金属氧酸盐在还原性环境下，部分钼元素被还原成低价态，颜色变成蓝色。

较佳地，所述钼基多金属氧酸盐中杂元素与钼元素的摩尔比为1：12，1：9，1：3，2：3，2：5，1：11，2：17，3：4，或1：6。

另一方面，本发明提供上述含有钼基多金属氧酸盐的光热疗剂和/或光声造影剂在制备肿瘤治疗药物中的应用。

所述光热疗剂，为在肿瘤区域内富集后，能吸收特定光源发出的光，如808nm激光，将光能转化为热能，使肿瘤温度升高从而达到肿瘤治疗的目的。

较佳地，所述钼基多金属氧酸盐为钼基杂多酸。

较佳地，所述钼基多金属氧酸盐中的杂元素为p、si、b、al、ga、ge、sn、as、sb、bi、se、tc、i和所有第一、第二、第三过渡系元素中的至少一种。

较佳地，所述钼基多金属氧酸盐为钼蓝。

较佳地，所述钼基多金属氧酸盐中杂元素与钼元素的摩尔比为1：12，1：9，1：3，2：3，2：5，1：11，2：17，3：4，或1：6。

本发明所述肿瘤包括皮肤癌、乳腺癌、淋巴瘤、脑胶质瘤、前列腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌等。

肿瘤微环境均具有微酸性和弱还原性的性质，所述的钼基多金属氧酸盐具有针对肿瘤微环境的弱酸性和弱还原性双重环境响应特性，既能响应肿瘤微环境ph，随着ph值的降低发生自组装，形成纳米囊泡，提高在肿瘤区域的富集程度，又具有肿瘤微环境氧化还原氛围响应功能，随着还原性增加，其近红外吸收也显著提高，并能相应提高光热转化效率。利用肿瘤弱酸性和弱还原性的特点，本发明中的钼基多金属氧酸盐能作为实现肿瘤微环境自反馈光热治疗的光热疗剂，在保证特异性和良好疗效同时最大程度地保护正常组织。

所述肿瘤治疗药物，可以是不同剂型，包括溶液剂、注射剂、片剂、散剂、软膏剂、乳剂、胶囊剂等。

所述肿瘤治疗药物，还可以包括药物可接受的赋形剂，所述赋形剂包括崩解剂、粘结剂、填料、润滑剂、抗氧化剂、润滑剂、助流剂、乳化剂、软膏剂等。

所述肿瘤治疗药物，还可以包括其他药物，如化疗药物等，组成复合药物。

再一方面，本发明提供一种制备上述钼基多金属杂多酸的方法，主要包括以下步骤：

a)将钼源、杂元素源和还原剂分别溶于溶剂中，形成均匀溶液a、b和c；

b)惰性气体保护下，将溶液a和溶液b均匀混合，且反应体系的ph为4～8；

c)将溶液c加入反应体系，充分混合；

d)反应结束后分离出产物、洗涤、干燥后即得钼基多金属氧酸盐。

较佳地，所述溶剂包括水、丙酮、二甲亚砜中、n，n二甲基甲酰胺的至少一种。所述溶剂具有较高的极性，对所述钼源，杂元素源和还原剂具有较好的溶解性即可。

较佳地，所述钼源包括钼金属的金属含氧酸盐、氯化盐、硝酸盐或金属醇盐中的至少一种，所述杂元素源为杂元素含氧酸盐。

较佳地，所述杂元素源与所述钼源的摩尔比为1：100～1：1，优选为1：10～1：1。

较佳地，所述还原剂包括水合肼、硼氢化钠、抗坏血酸和次磷酸钠中的至少一种，所述还原剂与所述钼源的摩尔比为1：1～20：1。

较佳地，所述反应体系的反应温度为0～50℃，优选为20～40℃。

本发明钼基多金属氧酸盐的制备方法具有工艺简单，易于批量生产，可有效降低材料的制备成本。

附图说明

图1为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐粉末产量展示的数码照片图；

图2为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐分散于ph＝7.4溶液中的透射电镜(tem)图片(图中标尺为10nm)；

图3为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐分散于ph＝7.4溶液中的透射电镜的高分辨图片；

图4为示出本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在pbs溶液中的稳定性测试结果的图；

图5为本发明实施例4所制得的钼基多金属氧酸盐分散于ph＝7.4溶液中的tem照片(图中标尺为5nm)；

图6为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐分散于ph＝6.5溶液中的tem图片；

图7为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐分散于ph＝4.5溶液中的tem图片；

图8为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐分散于ph＝7.4溶液中并逐步酸化的动态光散射(dls)水合动力学直径变化图；

图9为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐分散在不同ph值溶液中的紫外-可见吸收光谱图；

图10为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐溶液经酸化-碱化循环处理过程中808nm处的吸光度值的循环变化图；

图11为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐溶液在不同ph值下的x射线吸收精细结构光谱(exafs)；

图12为钼基多金属氧酸盐自组装程度随着ph变化程度而变化的示意图；

图13为本发明实施例1所制得的不同还原程度的钼基多金属氧酸盐的xps谱，在各图中，ox表示未加入还原剂时，即氧化态下的情况、r1、r2、r3、r4分别表示加入还原剂的量逐渐递增的四种情况，即还原程度从r1至r4逐渐增加；

图14为本发明实施例1所制得的不同还原程度的钼基多金属氧酸盐的epr谱；

图15为本发明实施例1所制得的不同还原程度的钼基多金属氧酸盐分散在ph＝5.0、6.0、6.5、7.4溶液中的紫外可见吸收光谱图，图a-d中的曲线从下至上依次为ox、r1、r2、r3、r4；

图16为本发明实施例1所制得的不同还原程度的钼基多金属氧酸盐分散在ph＝5.0溶液中，在1.5w/cm²的808纳米激光照射下的升温曲线图；

图17为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐水溶液的光声造影图；

图18为对小鼠进行尾静脉注射实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐水溶液后，不同时间后、该钼基多金属氧酸盐在肿瘤区域聚集的照片，图中us代表超声成像，pa代表光声成像；

图19为对小鼠进行尾静脉注射实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐水溶液后，随时间推移在肿瘤区域内钼基多金属氧酸盐的光声(pa)造影强度的变化；

图20中，图a为实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在氧化性环境下的细胞存活率数据，图b为实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在深还原性环境下细胞存活率数据；

图21为balb/c小白鼠尾静脉注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐(80mgmo/kg)一个月内体重变化与空白组对比；

图22为balb/c小白鼠尾静脉注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐(80mgmo/kg)7天与30天后，各脏器组织的切片图与空白组对比；

图23不同浓度本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在不同功率密度808nm激光照射下对mcf-7细胞活性的抑制柱状图；

图24为不同处理条件下用碘化丙啶和钙黄绿素双染色的mcf-7细胞的共聚焦图片；

图25为示出本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在不同含氧气氛下载808nm处的光吸收的图；

图26为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐与mcf-7细胞分别在正常含氧量(21％o2)和低含氧量(2％)气氛中共同培育12小时，再在808nm近红外激光下照射5分钟的升温曲线；

图27为注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐或生理盐水后，瘤区进行808nm激光照射5min后的热成像图；

图28为注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐或生理盐水后，瘤区进行808nm激光照射5min过程中的升温曲线；

图29为注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐或生理盐水，以及瘤区进行808nm激光照射5min后，不同处理组的相对肿瘤体积生长曲线；

图30为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐注入两小时后，不同情况下采用苏木精和伊红染色的肿瘤组织照片；

图31为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在静脉注射1小时后肿瘤组织中的瘤内分布图；

图32为示出用三肿瘤实验模型进行光热疗实验的结果的图；

图33为皮下4t1肿瘤的光声氧饱和图片和高分辨超声成像的图；

图34为静脉注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐1h后，对肿瘤区域及其周边的肌肉组织和皮肤组织进行xps表征；

图35为静脉注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐1h后，对肿瘤区域及其周边的肌肉组织进行光声(pa)信号强度的表征；

图36为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐的血液浓度代谢曲线、尿液及粪便代谢情况和在不同器官组织中的积累量；

图37为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在肿瘤和心脏中的清除速率曲线。

具体实施方式

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1

称取0.06mol钼酸钠、0.012mol磷酸钠和0.6mol抗坏血酸，分别溶于20ml去离子水中，室温充分搅拌使其完全溶解，分别形成均匀溶液a、b和c，待用；在氩气保护下，迅速将溶液b加入溶液a中，加热到40℃，保温搅拌10min，使其混合均匀；将溶液c通过注射泵以1ml/min的速度缓慢滴加入反应体系，溶液逐渐由透明变为蓝绿色，加毕，继续搅拌1h；反应结束待体系温度降至室温，加入40ml乙醇搅拌20min后，多次离心分离和清洗，最后冷冻干燥，获得钼基多金属氧酸盐粉末，密封保存，待用。

图1为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐粉末产量展示的数码照片图，其质量为5.5208g，可以看出本发明所提出的钼基多金属氧酸盐可以实现批量生产，可有效降低其作为临床光热疗剂的制备成本。

图2为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐分散于ph＝7.4溶液中的透射电镜图片，可以看出本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在ph＝7.4条件下，呈现约1nm的超小粒径，且尺寸均一，分散性良好。

图3为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐分散于ph＝7.4溶液中的透射电镜的高分辨图片，从图中可以清楚的看出纳米颗粒的晶面。

本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐的元素比例如下表所示，其中p/mo的比例接近1：12。

图4为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在pbs溶液中的稳定性测试，从图中可以看出该钼基多金属氧酸盐在pbs溶液中存放一年基本无变化，无沉淀产生。存放一年后略高的吸收应为溶液的挥发造成。图b说明一年后粒子的水合半径基本无变化。说明该钼基多金属氧酸盐在生理盐水中分散良好，颗粒粒径均一，贮藏一年以上无明显变化，具有良好的稳定性。

实施例2

称取0.12mol钼酸钠、0.012mol磷酸钠和0.8mol抗坏血酸，分别溶于20ml去离子水中，室温充分搅拌使其完全溶解，分别形成均匀溶液a、b和c，待用；在氩气保护下，迅速将溶液b加入溶液a中，温度为20℃，恒温搅拌10min，使其混合均匀；将溶液c通过注射泵以1ml/min的速度缓慢滴加入反应体系，溶液逐渐由透明变为蓝绿色，加毕，继续搅拌1h；反应结束待体系温度降至室温，加入40ml乙醇搅拌20min后，多次离心分离和清洗，最后冷冻干燥，获得钼基多金属氧酸盐粉末，密封保存，待用。

实施例3

称取0.1mol钼酸钠、0.015mol磷酸钠和0.6mol次磷酸钠，分别溶于20ml去离子水中，室温充分搅拌使其完全溶解，分别形成均匀溶液a、b和c，待用；在氩气保护下，迅速将溶液b加入溶液a中，加热到40℃，保温搅拌10min，使其混合均匀；将溶液c通过注射泵以1ml/min的速度缓慢滴加入反应体系，溶液逐渐由透明变为蓝绿色，加毕，继续搅拌1h；反应结束待体系温度降至室温，加入40ml乙醇搅拌20min后，多次离心分离和清洗，最后冷冻干燥，获得钼基多金属氧酸盐粉末，密封保存，待用。

实施例2和3中制备得到的钼基多金属氧酸盐，其p：mo的比例均接近1：12，结合实施例1可以看出，改变反应物中p和mo的比例不影响最终钼基多金属氧酸盐产物中的p：mo比例。

实施例4

称取0.08mol钼酸钠、0.02mol硅酸钠和1mol水合肼，分别溶于20ml去离子水中，室温充分搅拌使其完全溶解，分别形成均匀溶液a、b和c，待用；在氩气保护下，迅速将溶液b加入溶液a中，加热到30℃，保温搅拌10min，使其混合均匀；将溶液c通过注射泵以1ml/min的速度缓慢滴加入反应体系，溶液逐渐由透明变为蓝绿色，加毕，继续搅拌0.5h；反应结束待体系温度降至室温，加入60ml乙醇搅拌20min后，多次离心分离和清洗，最后冷冻干燥，获得钼基多金属氧酸盐粉末，密封保存，待用。

图5为本发明实施例4所制得的钼基多金属氧酸盐分散于ph＝7.4溶液中的tem照片，可以看出本实施例所制得的钼基多金属氧酸盐，在ph＝7.4条件下，呈现约2nm的超小粒径，且尺寸均一，分散性良好。

实施例5

ph响应实验

实验材料及仪器：

本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐溶液(ph＝7.4，浓度为1.5mg/ml)，盐酸溶液，氢氧化钠溶液，移液枪，ph计，动态光散射粒度仪，透射电子显微镜，紫外可见吸收光谱仪。

实验方法：

用盐酸逐步酸化钼基多金属氧酸盐溶液，监测其水合动力学直径，并用透射电子显微镜观察其形态变化。用氢氧化钠逐步中和盐酸，调节钼基多金属氧酸盐溶液至ph＝7.4，往复5次以上步骤，监测其吸收光谱的循环变化。

实验结果：

图6为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐分散于ph＝6.5溶液中的tem图片，可以看出本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在ph＝6.5条件下，可以自组装形成粒径大小约20nm的纳米囊泡。

图7为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐分散于ph＝4.5溶液中的tem图片，可以看出本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在ph＝4.5条件下，可以自组装形成粒径超过50nm的纳米颗粒。

图8为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐分散于ph＝7.4溶液中并逐步酸化的动态光散射(dls)水合动力学直径变化图，可以看出本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐，随着酸性程度的提高可以逐步自组装，形成更大尺寸的纳米颗粒。这种ph响应特性可以实现其在弱酸性肿瘤区域的自组装，增加的水合动力学直径可以有效提高epr效应，最终提高其在肿瘤区域的富集量，为后续高效的光热治疗的实施奠定良好基础。

图9为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐分散在不同ph值溶液中的紫外可见吸收光谱图，可以看出随着溶液酸性程度的增加，本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在808nm处的吸收显著增加。

图10为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐溶液经酸化-碱化循环处理过程中808nm处的吸光度值的循环变化图，可以看出本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐的酸增强近红外吸收特性完全可逆。这种根据外环境ph改变而发生迅速的吸收改变的特性，使其有望用作为环境ph的传感器，即只需测试吸收光谱，便可根据ph与吸收高峰位置的关系推知环境ph值。

图11为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐溶液在不同ph值下的x射线吸收精细结构光谱(exafs)，通过分析发现，mo的k2加权k-edge振荡的傅里叶变换光谱如图11所示，没有高阶相关性的有限散射峰证明了该钼基多金属氧酸盐的团簇特性。随着溶液酸化，材料中的mo＝ot(终端氧)的键长逐渐变短，且终端氧的配位数也会减少；mo-oe(共边氧)的键长也逐渐变短，但共边氧的配位数则有所增加。此外，mo-mo键的键长及配位数保持不变。驱动纳米粒子进行自组装的动力应为相邻离子间短程吸引力及静电排斥力的平衡。这证实了酸化后共边氧原子的质子化，并随后在oe或ot与质子直接形成氢键。另一种理解方式，在ph为7.4的中性环境中，该纳米级大离子完全离子化并相互之间由于静电排斥使他们稳定成小粒子；当溶液酸化后，静电排斥力减小，所形成的氢键引入的吸引力增强，这两种力的平衡使得纳米粒子在低ph值得情况下发生自组装，且自组装程度随着ph变化程度而变化，如图12所示。

图13为本发明实施例1所制得的不同还原程度的钼基多金属氧酸盐的xps谱，由图中可知，材料在氧化性环境时，mo均以+6价形式存在。当处于还原性环境时，也可以探测是+5价mo的信号，说明部分+6价mo被还原成+5价，使得材料中的mo还原性环境下是以混合价态存在的。

图14为本发明实施例1所制得的不同还原程度的钼基多金属氧酸盐的epr谱，由图中可知，材料在还原性环境时，在g＝1.92处可以看到+5价mo的信号，此外，在g＝2.0023处还能观察到自由电子的信号，说明还原环境下钼基多金属氧酸盐中存在可自由移动的电子。

还原性响应实验

实验材料及仪器：

本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐溶液(ph＝5.0，浓度为1.5mg/ml)，抗坏血酸溶液，移液枪，紫外可见吸收光谱仪，808nm激光器，红外热成像仪。

实验方法：

在钼基多金属氧酸盐溶液中逐步滴加抗坏血酸溶液，其中未加入抗坏血酸时的样品即为ox，随着抗坏血酸加入量的增加，分别取四个样品，记为r1、r2、r3、r4，从r1到r4钼基多金属氧酸盐的还原程度逐渐加深，监测其吸收光谱的变化。在不同时刻，取1ml溶液置于比色皿中，用1.5w/cm²的808nm激光照射5min，用红外热成像仪记录不同还原程度钼基多金属氧酸盐溶液的升温曲线。

实验结果：

图15为本发明实施例1所制得的不同还原程度的钼基多金属氧酸盐分散在ph＝5.0、6.0、6.5、7.4溶液中的紫外可见吸收光谱图。可以看出本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐，随着还原程度的增加，其近红外吸收显著增加。

图16为本发明实施例1所制得的不同还原程度的钼基多金属氧酸盐分散在ph＝5.0溶液中，在1.5w/cm²的808nm激光照射下的升温曲线图。可以看出本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐，随着还原程度的增加，其光热转化效率显著提高。

本发明中的钼基多金属氧酸盐具有ph响应和还原性响应的特点，结合肿瘤微环境中弱酸性和弱还原性的环境性质，可以将本发明中的本发明中的钼基多金属氧酸用作光热疗剂，应用于肿瘤治疗药物中。如本实施例所示，钼基多金属氧酸盐的粒径尺寸可以随着ph值降低而自组装长大(质子俘获自聚集效应)。其ph相应范围可为3至8，与肿瘤酸性微环境相匹配。钼基多金属氧酸盐在ph＝7.4条件下的粒径为0.5～2nm，在ph＝6.5条件下自组装形成粒径大小15～25nm的纳米囊泡，在ph＝4.5条件下自组装形成粒径超过50nm的纳米颗粒。因此这种ph响应特性可以实现其在弱酸性肿瘤区域的自组装，增加的水合动力学直径可以有效提高epr效应，最终提高其在肿瘤区域的富集量。同时，本发明中的钼基多金属氧酸盐的钼元素价态易变，其光热效率受外环境氧化还原势的可逆调控，在肿瘤病灶区的还原氛围中呈现为还原态，具有高效的光热效应，而在正常组织中呈现为氧化态，光热效应很弱。因此，本发明中的钼基多金属氧酸盐可以实现肿瘤微环境(弱酸性和弱还原性)双重环境响应，具有极高的特异性，从而实现肿瘤高特异性光热治疗。

实施例6

光声造影性能测试

实验材料以及器材

本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐，1.5ml的ep管，光声成像仪。

实验方法：

将不同浓度的本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐置于ep管中，测试其825nm处的光声造影性能。

实验结果：

图17为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐水溶液的光声造影图，可以看出实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐，有明显的浓度依赖的光声信号，表明其具有潜在的光声造影功能。

图18为对小鼠进行尾静脉注射实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐水溶液后，不同时间后、该钼基多金属氧酸盐在肿瘤区域聚集的照片，从第二行和第三行可以看出，钼基多金属氧酸盐在肿瘤区域聚集后，可以如果光声造影性能观测到其分布和聚集情况，体现出其光声造影性能。

图19为对小鼠进行尾静脉注射实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐水溶液后，随时间推移在肿瘤区域内钼基多金属氧酸盐的光声造影强度的变化，说明钼基多金属氧酸盐能在短时间内在瘤内实现聚集，并体现出较好的光声造影性能。

实施例7

细胞毒性评价实验

实验材料：

本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐；

细胞模型：

brl-3a大鼠肝细胞、rk-52e大鼠肾细胞以及mcf-7乳腺癌细胞模型。

实验方法：

采用标准mtt方法评价细胞存活率，具体实验方法为：(1)接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔3000个细胞接种到96孔板，每孔培养液体积100μl，置于37℃细胞培养箱中培养。(2)培养细胞：待细胞贴壁后，加入不同浓度的钼基多金属氧酸盐与细胞共培养48h后，用pbs小心清洗数次，继续共培养4h。(3)定量：去除mtt液，每孔加入100μl二甲亚砜溶解结晶紫，选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

实验结果：

图20中图a为氧化性环境下的细胞存活率数据，图b为深还原性环境下细胞存活率数据。分别测试了对brl-3a大鼠肝细胞、nrk-52e大鼠肾细胞以及mcf-7乳腺癌细胞存活率影响，可以看出该材料在500μg/ml的较高浓度下，共培养48h后，各细胞的存活率依然能维持85％以上，表明本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在氧化性环境和深还原性环境下均具有较低细胞毒性。

实施例8

活体安全性实验

实验材料：

本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐；

实验动物：

balb/c雌性小白鼠，平均体重20g，7周龄，购自复旦大学医学院动物房。

实验方法：

尾静脉注射150μl本发明实施例1所制得钼基多金属氧酸盐的生理盐水溶液(剂量为80mgmo/kg)。每隔两天称量体重，检测一个月，并通过常规的h&e观察注射前、注射后的7和30日的组织切片。

实验结果：

图21为balb/c小白鼠尾静脉注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐(80mgmo/kg)一个月内体重变化与空白组对比，注射材料组体重变化与空白组无显著差异。

图22为balb/c小白鼠尾静脉注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐(80mgmo/kg)7天与30天后，各脏器组织的切片图与空白组对比，可以看出，小鼠在注射实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐前后(最长为30日)的心肝脾肺肾各器官均无明显毒性反应，既无应激的肝肾毒性又无长期的组织毒性，表明该材料在活体水平的良好生物相容性。

实施例9

细胞治疗实验

实验材料与仪器：

本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐，808nm激光器；

细胞模型：

mcf-7乳腺癌细胞模型。

实验方法：

采用标准mtt方法评价细胞存活率，具体实验方法为：(1)接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1×10⁴个细胞接种到96孔板，每孔培养液体积100μl，置于37℃细胞培养箱中培养。(2)培养细胞：待12h细胞贴壁后，加入包含不同浓度钼基多金属氧酸盐的新培养基。(3)用不同功率密度的808nm激光器逐孔照射细胞5min，完毕后每孔加0.6mg/ml的mtt试剂盒溶液100μl，继续共培养4h。(3)定量：去除mtt液，每孔加入100μl二甲亚砜溶解结晶紫，选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

实验结果：

图23为不同浓度本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在不同功率密度808nm激光照射下对mcf-7细胞活性的抑制柱状图，可以看出，在激光照射下，本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐，具有良好癌细胞杀伤效率，并且杀伤率与其浓度和激光功率成正相关关系。

图24为不同处理条件下用碘化丙啶和钙黄绿素双染色的mcf-7细胞的共聚焦图片，四种条件分别为：控制组，pom注入组(25μgml^-1mo)，红外激光(nir)照射组(1.5wcm^-2,5min)，pom注入+红外激光照射组。该图表示，当肿瘤细胞只有钼基多金属氧酸盐处理或红外激光辐射处理时，并不能导致肿瘤细胞的死亡，只有同时满足两个条件时，才能实现杀死肿瘤细胞的效果。

图25为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在不同含氧气氛下载808nm处的光吸收，可以看出随着环境气氛中含氧量的逐渐降低，该材料在808nm处的光吸收逐渐增强。图b所示为钼基多金属氧酸盐循环储存于含氧量为21％和2％环境气氛中的紫外可见吸收光谱，可以看出，在含氧量为2％的环境气氛时，其主吸收峰蓝移，且整体吸收强度增强，在低含氧量的环境气氛中其在808nm处的吸收较高含氧量的环境气氛中更强。

图26为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐与mcf-7细胞分别在正常含氧量(21％o2)和低含氧量(2％)气氛中共同培育12小时，再在808nm近红外激光下照射5分钟的升温曲线，可以看出，在低含氧量气氛中培育的样品中体现出更为良好的升温性能，比正常含氧量气氛中培育出的样品温升高出6℃(图a)。利用细胞凋亡实验比较两组样品中的治疗效果(图b)，可以发现在低含氧量气氛中培育的样品其mcf-7细胞的死亡量基本是正常含氧量气氛中样品的一倍，说明该钼基多金属氧酸盐为典型的低含氧量增强的光热治疗剂。

实施例10

活体治疗实验

实验材料：

本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐，808nm激光器和红外热成像仪；

实验动物：

balb/c雌性小白鼠，平均体重20g，7周龄，购自复旦大学医学院动物房。

实验方法：

单肿瘤模型：(1)4t1肿瘤接种：在小鼠左右两大腿皮下分别注射含有1×10⁶4t1细胞的pbs悬液100μl，肿瘤生长至100～130mm³后，待用。(2)将小鼠任意分为4组，每组7只，不同处理组为：a.生理盐水组，尾静脉注射150μl生理盐水；b.钼基多金属氧酸盐组，尾静脉注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐(30mgmo/kg)；c.生理盐水+近红外照射组，尾静脉注射生理盐水1h后，以1.5w/cm²的808nm激光照射肿瘤5min；d.钼基多金属氧酸盐+近红外照射组，尾静脉注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐1h后，以1.5w/cm²的808激光照射肿瘤5min。处理过程中，用红外热成像仪监测肿瘤温度变化。(3)处理结束后，每两天量取肿瘤长(l)与宽(w)，根据公式：v＝l×w²/2计算肿瘤大小，并除以最初肿瘤体积得到相对肿瘤体积；

三肿瘤模型：与单肿瘤模型类似，区别在于在小鼠左右两大腿皮下三个不同位置接种4t1肿瘤。

实验结果：

图27为注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐或生理盐水后，瘤区进行808nm激光照射5min后的热成像图，可以看出，注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐后，808nm激光照射可以有效提高肿瘤温度至52℃，肿瘤周围组织温度无剧烈提高，表明本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐诱导的光热治疗对肿瘤组织良好的特异性。

图28为注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐或生理盐水后，瘤区进行808nm激光照射5min过程中的升温曲线。可以看出在注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐后，在808nm激光照射下，肿瘤温度可以在2min内迅速升高超过50℃，而对照组肿瘤温度虽然也有所提高，但一直低于40℃，无法达到细胞烧伤目的。

图29为注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐或生理盐水，以及瘤区进行808nm激光照射5min后，不同处理组的相对肿瘤体积生长曲线。结果表明，本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐所诱导的近红外光热治疗可以有效抑制肿瘤的生长，并在4天完全根除肿瘤，半个月内不再复发，其它对照组肿瘤生长速度无显著影响，表明利用本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐作为高效光热治疗的可行性。

图30为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐注入两小时后，不同情况下采用苏木精和伊红染色的肿瘤组织照片，从中可以看出，如果只采用钼基多金属氧酸盐或红外光进行处理，肿瘤组织基本没有收到破坏。而同时采用纳米材料和红外光进行处理的样品，肿瘤组织则受到严重的损伤。

图31为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在静脉注射1小时后肿瘤组织中的瘤内分布图，可以看出，尽管存在很高的瘤内组织液压，钼基多金属氧酸盐依然可以在静脉注射1小时后渗透到整个肿瘤区域，说明该钼基多金属氧酸盐具有很好的渗透性。

图32为三肿瘤实验模型，静脉注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐1h后，用808nm激光对肿瘤区域进行光照，并且激光光照范围覆盖所有三个肿瘤。5分钟照射后，对于静脉注射盐水的对比实验，温度加热温区比较均匀，且只能升高到不到40℃(图b)，该温度较低，不能达到显著的热疗效果。图c显示，静脉注射钼基多金属氧酸盐的实验中，肿瘤区域和正常组织间存在明显的温差，其中肿瘤温度升高到47℃，而正常组织的温度则在42℃以下。这种情况下可以实现出对肿瘤良好的治疗效果而不对正常组织造成伤害，表现出该钼基多金属氧酸盐具有很高的特异性肿瘤治疗。

图33为皮下4t1肿瘤的光声氧饱和图片和高分辨超声成像的图品，其中us代表超声成像，pa代表光声成像，从光声成像氧含量图谱中，可以看出肿瘤区域的氧饱和浓度很低，明显低于附近正常组织的氧饱和浓度，说明低氧肿瘤中为大家所熟知的还原性微环境。

图34为静脉注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐1h后，对肿瘤区域及其周边的的肌肉组织和皮肤组织进行xps表征，图谱中观察到的s元素应该来自于组织中的蛋白质。可以看出，在皮肤组织中基本没有探测到钼基多金属氧酸盐。值得注意的是，肿瘤区域相比于正常肌肉组织区域，不仅具有更高的钼基多金属氧酸盐聚集量，且五价mo的比例也明显高于正常肌肉组织区域，五价mo含量的增高将有利于吸收强度的升高，从而利于光热转换效率的提高。

图35为静脉注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐1h后，对肿瘤区域及其周边的的肌肉组织进行光声(pa)信号强度的表征，可以看出，肿瘤区域较高的pa信号说明钼基多金属氧酸盐在肿瘤区域相比于正常肌肉组织区域有着更高的富集，此外，肿瘤区域中pa信号的信号峰位于860nm处，接近于ph＝6.5时的吸收峰位置，相比于正常肌肉组织中881nm的峰位有着明显的蓝移，说明肿瘤的微酸性环境使得其具有吸收峰的蓝移。

应当注意的是，肿瘤微环境中的弱酸性和弱还原性为不同肿瘤共同具有的微环境特征，本发明中钼基多金属氧酸盐的作用机理是基于肿瘤微环境中的弱酸性和弱还原性，即钼基多金属氧酸盐在弱酸性的肿瘤环境中自组装形成大粒子，从而在肿瘤区域形成富集，再利用微环境中的弱还原性，增强在808nm激光处的吸收，从而提高其光热加热性能，从而实现有效的肿瘤特异性光热治疗。肿瘤的类型可以是很多种，如皮肤癌、乳腺癌、淋巴瘤、脑胶质瘤、前列腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌等，作为本发明的一个实施方式，在实施例10中选用乳腺癌作为实验对象。

实施例11

药物代谢动力学实验

实验材料：

本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐；

实验动物：

balb/c雌性小白鼠，平均体重20g，7周龄，购自复旦大学医学院动物房。

实验方法：

尾静脉注射本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐(30mgmo/kg)，(1)选3只老鼠，在注入时间为5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、40小时和72小时后，从尾静脉中抽取20μl血液测量钼基多金属氧酸盐在血液中的浓度变化；(2)选3只老鼠，在注入时间为1小时、4小时、8小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天的时间内收集小鼠的粪便和尿液，测量钼基多金属氧酸盐的代谢排出量；(3)将老鼠分为6组，每组3只，在注入时间为30分钟、1小时、3小时、24小时、48小时和7天后分别处死一组小鼠，分析小鼠主要器官(心脏、肝、脾、肺、肾、肿瘤和脑)的钼基多金属氧酸盐的含量。

图36为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐的血液浓度代谢曲线、尿液及粪便代谢情况和在不同器官组织中的积累量。图a为血液中的mo元素浓度随时间变化的曲线，浓度降低规律符合经典的双组份药代动力学模型，其中心部分和外围部分的终端消除半衰期分别为25分钟和9.9小时。在排泄物的mo含量分析中可以看出尿液中的mo含量快速降低，7天后通过尿液排出的mo含量占总注射剂量的73％(图b和c)，这种代谢说明该钼基多金属氧酸盐可以通过快速的肾过滤和尿液排泄出体外，这因得益于该材料在中性环境时非常小的水合直径(1.7nm)和优异的亲水性。相比而言，在粪便当中的mo浓度则相对较低，在注射后的第二天达到浓度高峰。7天后粪便中mo的排出总量占注射剂量的18％，说明了该钼基多金属氧酸盐可以通过肝进行代谢。值得注意的是，绝大部分钼基多金属氧酸盐可以在7天内排出(考虑到排泄物收集中不可避免的损失，已有91％的钼基多金属氧酸盐被排除)。得益于优异的代谢性能，该材料可以避免体内潜在的长期毒性，表现出优异的生物安全性。

图37为本发明实施例1所制得的钼基多金属氧酸盐在肿瘤和心脏中的清除速率曲线，相比于非网状内皮组织的心脏，钼基多金属氧酸盐在肿瘤组织中的滞留效应非常明显。这得益于钼基多金属氧酸盐epr被动靶向在肿瘤区域后，在肿瘤微酸性环境中自组装由小变大的效应。

综上所述可见，本发明提供的钼基多金属氧酸盐具有极佳稳定性，良好的分散性和较高的生物安全性，其可以实现(1)恶性肿瘤的高效光声成像诊断；(2)根据肿瘤微环境自我调节反馈的特异性近红外光热治疗。在近红外光热治疗方面，与传统基于特殊形貌的贵金属纳米光热疗剂相比，本发明价格低廉、分散性好、可控度高；相比于过渡金属氧化物或硫化物纳米光热疗剂，本发明制备过程对环境无毒无害，可储存性高；与导电高分子纳米光热疗剂相比，本发明热稳定性良好、不易发生热失活。具有弱酸性和弱还原性双重环境响应特性，在提高疗效的同时最大程度地保护周围正常组织。并能通过肾脏快速代谢，具有极佳的生物相容性和组织安全性。所述制备工艺简单经济，可实现批量生产，有望临床转化，对生物医学领域的发展和应用具有重要价值和意义。