针对TNF‑α的抗体组合物及其应用的制作方法

本发明涉及本新的药物制剂，特别涉及一种针对tnf-α的抗体组合物及其应用。
背景技术：
：类风湿关节炎(ra)是一种常见的关节炎，属于自身免疫疾病，在人群中的发病率为0.3-1％，如不及时治疗，可导致骨破坏和关节损伤。在ra发病中有多种促炎性细胞因子参与，如肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素如il-1,il-6,il-8等(marcfeldmann,ravindern.maini.discoveryoftnf-αasatherapeutictargetinrheumatoidarthritispreclinicalandclinicalstudies.jointbonespine,2009；69:12-18.)。因此，抑制促炎性细胞因子的产生或阻断其生理作用，是目前ra研究领域的热点。近年来许多新研发的生物制剂可通过阻断或下调促炎性细胞因子的活性而控制病情的进展，如tnf-α抑制剂、抗il-6r抗体等，这些生物制剂的主要作用机制有：(1)针对细胞因子或其受体的单克隆抗体；(2)可溶性受体拮抗剂，即不包括跨膜成分和胞内功能区的细胞因子膜受体。受体拮抗剂可与游离的细胞因子结合，抑制后者与细胞表面受体结合。可溶性受体拮抗剂的半衰期较短，可通过加入某些结构如人igg的fc受体或聚乙二醇(polyethyleneglycol,peg)而延长；(3)受体拮抗蛋白，为无生物活性的蛋白质，可与细胞因子竞争结合细胞表面的膜受体。受体拮抗蛋白必须结合90％以上细胞表面受体方认为有效。目前认为,在诸多ra炎症反应的细胞因子中，tnf-α是最重要的促炎性细胞因子之一，其在ra的病情发展、局部炎症反应和组织损伤中均起着重要作用(feldmannm,brennanfm,foxwellbmj,etal.theroleoftnfandil-1inrheumatoidarthritis.currdirautoimmun,2001；3:188-199.)。ra中tnf-α和tnf-α受体(tnfr)水平在血清、滑膜以及滑液中均显著升高，特别是病情严重的活动性患者。ra患者血清中tnf-α水平与关节损伤评分、红细胞沉降率(esr)及贫血呈正相关。tnf-α还与ra患者体重减轻和疾病复发有关。tnf-α可作用于多种细胞，如促进巨噬细胞分泌炎性细胞因子和趋化因子，促进炎症反应。tnf-α的主要作用是：(1)诱导内皮细胞表达黏附分子和血管内皮生长因子(vegf)，促进白细胞与血管内皮黏附、渗透，导致局部的炎症反应；(2)作用于肝细胞，产生c反应蛋白(crp)；(3)在ra中，tnf-α可分别作用于破骨细胞、滑膜细胞和软骨细胞，导致这些细胞的活化，产生金属蛋白酶、胶原酶、基膜溶解酶(stromelysin)及前列腺素e2(pge2)，进一步破坏软骨引起骨侵蚀、关节炎症和软骨破坏；(4)tnf-α还可促使滑膜细胞、巨噬细胞、纤维母细胞和软骨细胞产生il-1,il-8及tnf-α本身而加重组织损伤。因此，抑制tnf-α的作用对控制ra的病情和改善预后非常重要(danieltracey,larsklareskog,erich.sssso,etal.tumornecrosisfactorantagonistmechanismsofactionacomprehensivereview.pharmacologyandtherapeutics,2008；117:244-279)。目前已被美国fda批准的tnf-α抑制剂共有5种：可溶性受体拮抗剂-依那西普(etanercept)，人鼠嵌合抗体-英夫利昔单抗(infliximab)，全人源单抗阿达木单抗(adalimumab)，全人源单抗戈利木单抗(golimumab)和聚乙二醇人源化fab’片段赛妥珠单抗(certolizumabpegol)。etanercept是重组人ii型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，由ii型tnf受体(p75)与igg1的fc部分组成二聚体；infliximab是由人ig稳定区和鼠ig可变区组成的嵌合体，特异性结合tnf；全人源单抗也能特异性结合tnf，其稳定区和可变区均为人源；certolizumabpegol的fab’片段特异性结合tnf，c端连接的聚乙二醇可延长半衰期。tnf抑制剂的主要不良反应有注射部位反应、感染、肿瘤、淋巴增殖性疾病、神经脱髓鞘病变以及狼疮样综合征(d.j.shealy,s.visvanathan.anti-tnfantibodies:lessonsfromthepast,roadmapforthefuture.handbookofexperimentalpharmacology2008；181:101-129.b.gatto.biologicstargetedattnf:design,productionandchallenges.reumatismo,2006；58(2):94-103)。上述的tnf-α抑制剂有静脉制剂，也有皮下制剂。皮下制剂相比于静脉制剂，更加方便患者用药，注射时间大大缩短，无需专业医师注射，在患者接受培训后可自己注射药物。但是皮下制剂也存在不足：制剂成分、ph等因素易使患者注射时产生不适感，甚至明显疼痛，严重的可导致患者不按医嘱用药，尤其是在非致命疾病如炎症疾病的情况下。laursen等比较了患者在注射不同缓冲体系的皮下制剂时产生的疼痛感，发现柠檬酸缓冲液制剂相比于组氨酸缓冲液制剂，使更多的患者产生了疼痛感(laursent,hansenb,fiskers.painperceptionaftersubcutaneousinjectionsofmediacontainingdifferentbuffers.basic&clinicalpharmacology&toxicology,2006；98(2):218–221)。技术实现要素：基于此，有必要针对现有皮下注射制剂由于成分、ph等因素导致的不适、疼痛等问题，提供一种针对tnf-α的抗体组合物。第一方面，本发明提供一种针对tnf-α的抗体组合物，其溶剂包括水，溶质包括抗tnf-α抗体；所述抗体组合物具有4.0-8.0的酸碱度，且所述酸碱度是通过向所述抗体组合物的液体组分中压入二氧化碳调节的。在其中一些实施例中，所述溶质还包括稳定剂、表面活性剂；所述抗tnf-α抗体包括重组人抗tnf-α单克隆抗体bat1406。在其中一些实施例中，所述针对tnf-α的抗体组合物，包括溶质的种类及含量包括：所述抗tnf-α抗体的浓度为20.0-130.0mg/ml；所述稳定剂包括20.0-60.0mg/ml多元醇、70.0-100.0mg/ml糖类中的一种或两种；所述表面活性剂包括0.5-2.0mg/ml聚山梨酯80；所述抗体组合物具有4.0-8.0的酸碱度，且所述酸碱度是通过向所述抗体组合物的液体组分中以10-300mmhg压力压入二氧化碳调节的。在其中一些实施例中，所述针对tnf-α的抗体组合物，包括溶质的种类及含量满足如下优选条件中的一种或者多种：所述抗tnf-α抗体的浓度为20.0-110.0mg/ml；所述多元醇的种类包括甘露醇或山梨醇，所述多元醇的浓度为30.0-50.0mg/ml；所述糖类的种类包括蔗糖或海藻糖，所述糖类的浓度为80.0-90.0mg/ml；所述聚山梨酯80的浓度为0.8-1.5mg/ml；所述抗体组合物具有4.9-5.7的酸碱度，且所述酸碱度是通过向所述抗体组合物的液体组分中以100-300mmhg压力压入二氧化碳调节的。在其中一些实施例中，所述针对tnf-α的抗体组合物，包括溶质的种类及含量满足如下优选条件中的一种或者多种：所述抗tnf-α抗体的浓度为50mg/ml或100mg/ml；所述多元醇的种类包括甘露醇或山梨醇，所述多元醇的浓度为42mg/ml，所述糖类的种类包括蔗糖或海藻糖，所述糖类的浓度为84mg/ml；所述聚山梨酯80的浓度为1.0mg/ml；所述抗体组合物具有5.0-5.4的酸碱度，且所述酸碱度是通过向所述抗体组合物的液体组分中以220mmhg压力压入二氧化碳调节的。在其中一些实施例中，所述针对tnf-α的抗体组合物，所述溶质的种类及其含量包括：所述抗tnf-α抗体的浓度为100.0mg/ml，所述稳定剂为甘露醇，浓度为42.0mg/ml，所述表面活性剂为聚山梨酯80，浓度为1.0mg/ml，所述抗体组合物具有5.0-5.4的酸碱度，且所述酸碱度是通过向所述抗体组合物的液体组分中以220mmhg压力压入二氧化碳调节的。在其中一些实施例中，所述的针对tnf-α的抗体组合物，包括溶质的种类及含量包括：所述抗tnf-α抗体的浓度为70.0-130.0mg/ml；所述稳定剂包括3.0-15.0mg/ml多元醇、5.0-8.0mg/ml氯化钠中的一种或两种，所述表面活性剂包括3.0-10mg/ml聚山梨酯80；所述抗体组合物具有4.0-6.0的酸碱度，且所述酸碱度是通过向所述抗体组合物的液体组分中以20-80mmhg压力压入二氧化碳调节的。在其中一些实施例中，所述的针对tnf-α的抗体组合物，包括溶质的种类及含量满足如下优选条件中的一种或者多种：所述抗tnf-α抗体的浓度为90.0-110.0mg/ml；所述稳定剂的种类包括甘露醇、氯化钠，所述甘露醇的浓度为8.0-12.0mg/ml，所述氯化钠的浓度为6.0-7.0mg/ml；所述表面活性剂包括4.0-8.0mg/ml聚山梨酯80；所述抗体组合物具有4.8-5.5的酸碱度，且所述酸碱度是通过向所述抗体组合物的液体组分中以40-60mmhg压力压入二氧化碳调节的。在其中一些实施例中，所述的针对tnf-α的抗体组合物，包括溶质的种类及含量满足如下优选条件中的一种或者多种：所述抗tnf-α抗体的浓度为100mg/ml；所述甘露醇的浓度为10.0mg/ml，所述氯化钠的浓度为6.5mg/ml；所述聚山梨酯80的浓度为6.0mg/ml；所述抗体组合物具有5.0-5.4的酸碱度，且所述酸碱度是通过向所述抗体组合物的液体组分中以50mmhg压力压入二氧化碳调节的。在其中一些实施例中，所述的针对tnf-α的抗体组合物，包括溶质的种类及含量如下：所述抗tnf-α抗体的浓度为100.0mg/ml，所述稳定剂包括10.0mg/ml的甘露醇、6.5mg/ml氯化钠，所述表面活性剂为聚山梨酯80，浓度为6mg/ml，所述抗体组合物具有5.0-5.4的酸碱度，且所述酸碱度是通过向所述抗体组合物的液体组分中以50mmhg压力压入二氧化碳调节的。第二方面，本发明提供一种针对tnf-α的抗体制剂，包括密闭容器，及保存于密闭容器中所述针对tnf-α的抗体组合物，所述组合物具有4.0-8.0的酸碱度。在一些实施例中，所述的密闭容器包括压力罐、西林瓶、注射针等。第三方面，本发明提供一种根据所述的针对tnf-α的抗体组合物在制备tnf-α引起病症的治疗药物中的应用。在其中一些实施例中，所述治疗药物包括皮下注射制剂。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：目前，皮下注射药物中所含有的缓冲液种类以及浓度与患者注射时产生的疼痛不适感有密切关系，已经通过大量实验确认。本发明抗体组合物，不含常见缓冲体系，以充入二氧化碳的方式来替代缓冲体系并维持制剂稳定的ph，降低患者注射时的疼痛不适感，对于治疗tnf-α相关疾病有重要意义。进一步地，本发明向抗体组合物中加入稳定剂、表面活性剂，并进一步将抗体制剂的配方优选为如下(1)或(2)：(1)溶剂水，所含抗tnf-α抗体的浓度为20.0-130.0mg/ml；所含稳定剂包括20.0-60.0mg/ml多元醇、80.0-90.0mg/ml糖类中的一种或两种；所含表面活性剂包括0.5-2.0mg/ml聚山梨酯80；所含制剂组合物具有4.0-8.0的酸碱度，且所述酸碱度是通过向所述抗体组合物的液体组分中以10-300mmhg压力压入二氧化碳调节的。(2)溶剂水，所含抗tnf-α抗体的浓度为70.0-130.0mg/ml；所述稳定剂包括3.0-15.0mg/ml多元醇、5.0-8.0mg/ml氯化钠中的一种或两种，所述表面活性剂包括3.0-10mg/ml聚山梨酯80；所述抗体组合物具有4.0-6.0的酸碱度，且所述酸碱度是通过向所述抗体组合物的液体组分中以20-80mmhg压力压入二氧化碳调节的。实现了所含抗体成分在液体状态下保质期为30个月的技术效果，还实现了抗体组合物在室温下保存2周、在2～8℃下保质期为30个月的优势效果；同时，所得抗体组合物在高温、光照、抗菌等方面呈现优良效果。另外，在上述(1)或(2)优化配方的基础上，发明人经过多次试验，进一步对二氧化碳压力范围进行优化，及对抗体组合物的溶质种类及含量进行了优化，实现了抗体组合物在保质期、高温、光照、抗菌等方面进一步提升。附图说明图1(图a、图b、图c)重组人抗tnf-α单克隆抗体bat1406的a制剂的室温稳定性实验结果；其中：图a是对实施例1各样品的尺寸排阻色谱测试结果图；图b是对实施例1各样品的毛细管电泳测试结果图；图c是实施例1各样品生物活性测试结果图；图2重组人抗tnf-α单克隆抗体bat1406两种制剂的高温(40℃)条件下15天稳定性实验结果图；图3重组人抗tnf-α单克隆抗体bat1406两种制剂室温光照(4000lx)条件下稳定性实验结果图；图4重组人抗tnf-α单克隆抗体bat1406的a制剂甘露醇浓度筛选试验结果图；图5中a图为重组人抗tnf-α单克隆抗体bat1406对实验小鼠tg197活体关节炎得分的影响；图5中b图为重组人抗tnf-α单克隆抗体bat1406对实验小鼠tg197活体组织病理学得分的影响；图6重组人抗tnf-α单克隆抗体bat1406a制剂低中高剂量皮下给药时血药浓度曲线图；图7重组人抗tnf-α单克隆抗体bat1406a制剂和含缓冲体系制剂皮下给药时血药浓度曲线图。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明的抗体制剂组合物及其用途作进一步详细的说明。为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本发明提供一种针对tnf-α的抗体组合物，其溶剂包括水，溶质包括抗tnf-α抗体；所述抗体组合物具有4.0-8.0的酸碱度，且所述酸碱度是通过向所述抗体组合物的液体组分中压入二氧化碳调节的；进一步地，上述组合物还包括表面活性剂、稳定剂。进一步地，所述针对tnf-α的抗体组合物优选为两种配方，如下：a配方：溶剂水，所含抗tnf-α抗体的浓度为20.0-130.0mg/ml；所含稳定剂包括20.0-60.0mg/ml多元醇、80.0-90.0mg/ml糖类中的一种或两种；所含表面活性剂包括0.5-2.0mg/ml聚山梨酯80；所含抗体组合物具有4.0-8.0的酸碱度，且所述酸碱度是通过向所述抗体组合物的液体组分中以10-300mmhg压力压入二氧化碳调节的；以a配方制备的抗体组合物简称a制剂，例如下表1a；b配方：溶剂水，所含抗tnf-α抗体的浓度为70.0-130.0mg/ml；所述稳定剂包括3.0-15.0mg/ml多元醇、5.0-8.0mg/ml氯化钠中的一种或两种，所述表面活性剂包括3.0-10mg/ml聚山梨酯80；所述抗体组合物具有4.0-6.0的酸碱度，且所述酸碱度是通过向所述抗体组合物的液体组分中以20-80mmhg压力压入二氧化碳调节的。以b配方制备的抗体组合物简称b制剂，例如下表1b；表1a.重组人抗tnf-α单克隆抗体bat1406的a制剂成份列表功能成分名称用量浓度抗tnf-α抗体抗体bat140640mg100mg/ml稳定剂甘露醇16.8mg42mg/ml表面活性剂聚山梨酯800.4mg1mg/mlph调节剂二氧化碳220mmhgph5.0-5.4溶剂注射用水补充至0.4ml-表1b.重组人抗tnf-α单克隆抗体bat1406的b制剂成份列表功能成分名称用量浓度抗tnf-α抗体抗体bat140640mg100mg/ml稳定剂甘露醇4mg10mg/ml表面活性剂聚山梨酯802.4mg6mg/ml稳定剂氯化钠2.6mg6.5mg/mlph调节剂二氧化碳50mmhgph5.0-5.4溶剂注射用水补充至0.4ml-实施例1：抗体组合物的制备本实施例对20l的a制剂的制备进行举例：(1)称量出以下重量的成分：840g甘露醇(稳定剂)，20g聚山梨酯80(表面活性剂)和20l注射用水。二氧化碳在制剂制备完成后充入。(2)将称好的所述甘露醇(稳定剂)、聚山梨酯80(表面活性剂)成分溶解在大约90％重量的所述注射用水中制备溶剂体系。业已证明，添加甘露醇(稳定剂)、聚山梨酯80(表面活性剂)的顺序并不会影响制剂质量，可随意选择。(3)在水浴中对含2.0kg总蛋白的bat1406抗体浓缩物进行解冻，然后在搅拌状态下添入所述溶剂体系至抗体浓缩物，直到达到总溶液的最终重量。(4)在步骤(3)所得混合溶液中充入二氧化碳调节ph，添加最终体积的注射用水，然后将所述制剂通过0.22μm孔径的亲水性聚偏二氟乙烯的过滤膜进行除菌，过滤膜可将制剂过滤到无菌容器中。所使用的过滤介质是过滤消毒的氨气。然后按照上述方法，通过过滤对包含它的所有成分的制剂进行过滤，所不同的是所述制剂是通过两层无菌0.22μm的膜过滤器过滤的。在消毒之后，对所述试剂进行包装，以便在西林瓶或预填充注射器中使用，以上容器均通过微生物侵入试验验证，符合《药品生产质量管理规范(2010年修订)》要求。技术人员可以理解的是，本文所提到的重量和/或重量与体积比可以利用所述成分的公知的分子量换算成摩尔和/或摩尔浓度。本文所列举的重量是用于所述体积的。技术人员可以理解的是，在需要不同的制剂体积时，可以成比例地调整所述重量。例如16l、14l、12l、10l、5l制剂分别包括80％、70％、60％、50％、25％的所列举的重量。b制剂的制备方法同上述a制剂。实施例2：室温条件下稳定性研究制备bat1406抗体的pbs样品a1(20mg/ml)和a制剂的低浓度样品a2(4mg/ml)、中浓度样品a3(20mg/ml)、高浓度样品a4(100mg/ml)，置于室温条件下保存2周。a1-a4编号样品的配方组成见表2a：表2a样品分别进行毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,ce)、尺寸排阻色谱(size-exclusionchromatography,sec)和生物活性(tnf-α诱导的l929细胞毒中和实验)检测，测定的结果见表2b和图1。结果表明：bat1406抗体a制剂低(a2样品)、中(a3样品)、高(a4样品)三个浓度的样品在室温条件下放置2周，主峰降解趋势一致，范围为98.95-95.17％，明显优于pbs样品a1(98.66-87.27％)；ce-sds(nr)的结果表明，bat1406抗体a制剂低(a2样品)、中(a3样品)、高(a4样品)三个浓度的样品在室温条件下放置10天，主峰降解趋势一致，范围为93.20-89.05％，明显优于pbs样品a1(93.79-82.36％)；生物活性的结果表明，bat1406抗体a制剂低、中、高三个浓度的样品在室温条件下放置2周，活性基本保持不变，范围为98.52-97.49％，明显优于pbs样品a1(98.49-90.27％)。整体比较可知：本发明制备的制剂效果显著优于现有采用pbs缓冲液制备的制剂；就本申请制剂而言，a制剂低、中、高三个浓度的样品相比，中、高两个浓度的样品稳定性更佳。表2b.a1-a4编号样品的室温稳定性实验结果实施例3：制剂ph影响因素研究制备bat1406抗体a制剂(具体配方见表1a)浓度为100mg/ml的样品10l，存放于压力罐中，充入不同量的二氧化碳，放置于4℃，检测不同二氧化碳气压时，压力罐中制剂ph。测定的结果列于表3a。表3a.bat1406a制剂的二氧化碳气压对ph影响实验结果二氧化碳气压(mmhg)制剂ph值3004.762704.982405.062105.151805.301505.511005.84制备bat1406抗体a制剂(具体配方见表1a)浓度为100mg/ml的样品10l，存放于西林瓶和注射针(材料信息见表3b)中，西林瓶和注射针中充入二氧化碳，气压为220mmhg，放置于室温，考察西林瓶和注射针密封性及二氧化碳气压变化对制剂ph的影响。测定的结果列于表3c。表3b.包装材料信息名称厂商西林瓶肖特玻璃科技(苏州)有限公司胶塞法国stemi注射针管碧迪医疗器械(上海)有限公司表3c.bat1406a制剂的ph受保存时间影响实验结果保存时间制剂ph0d5.163d5.186d5.2112d5.2215d5.25发明人通过多次试验证明，本发明的制剂在二氧化碳以10-300mmhg压力压入调节酸碱度至4.0-8.0的情况下均能实现较好的舒适效果。进一步地，通过上述本实施例结果表明：当二氧化碳气压范围为100-300mmhg时，制剂ph为4.76-5.84；保存a制剂的西林瓶及注射针的密封性良好，充入的二氧化碳气压为220mmhg，室温保存15天，制剂ph的变化范围为5.16-5.25，基本满足实验要求。同理，bat1406的b制剂(具体配方参见表1b)二氧化碳的气压范围为40-60mmhg，优选为50mmhg。实施例4：高温(40℃)条件下稳定性研究分别制备bat1406的a制剂(具体配方见表1a)、b制剂(具体配方见表1b)，置于高温(40℃)条件下保存15天，样品分别进行sec和离子交换层析(ionexchangechromatography，iec)检测，测定的结果见表4和图2。表4.a制剂、b制剂在高温(40℃)条件下15天稳定性实验结果结果表明：a制剂、b制剂样品在高温(40℃)放置15天，b制剂主峰下降较a制剂快，sec聚体和片段也会多一些；a制剂的iec主峰下降趋势跟b制剂一致，但是在iec酸区上的表现比b制剂好。说明抗体a制剂在高温下的稳定性要优于b制剂。实施例5：室温光照(4000lx)条件下稳定性研究制备bat1406抗体的a制剂(具体配方见表1a)和b制剂(具体配方见表1b)，采用带遮光材料的西林瓶保存，置于室温光照(4000lx)条件下保存2周。样品进行iec检测，测定的结果见图3。结果表明：bat1406抗体a制剂和b制剂样品在室温光照(4000lx)条件下放置2周，a制剂的iec主峰基本保持不变，b制剂主峰下降较a制剂快，说明尽管a制剂、b制剂均具有较好的光稳定性，而抗体a制剂在光照(4000lx)条件下的稳定性要优于b制剂。实施例6：甘露醇浓度筛选试验为了使制剂中的甘露醇浓度达到最佳，将a制剂中的甘露醇浓度从60mg/ml以3mg/ml为梯度，直到18mg/ml，配制15个(编号1-15，浓度依次降低)不同甘露醇浓度的bat1406抗体a制剂(100mg/ml)，除了a制剂甘露醇浓度部分不同于表1a，其余部分均与表1a相同。保存温度40℃，时间周期为4周。样品分别进行sec和iec检测，检测结果见图4。结果显示：综合sec主峰和iec主峰数据图可以看出，甘露醇在20-60mg/ml均可以对bat1406抗体起到良好的保护作用，而甘露醇浓度为42mg/ml时(即编号7制剂)，对于抗体的保护作用最佳。同理，对b配方的甘露醇浓度进行了优选，结果发现，甘露醇在3-15mg/ml均可以对bat1406抗体起到良好的保护作用，而甘露醇浓度为10mg/ml时，对于抗体的保护作用最佳。实施例7：微生物研究通过对a制剂、b制剂进行微生物研究，确定所述制剂是否能支持微生物生长。具体地，向所述a制剂(具体配方见表1a)、b制剂(具体配方见表1b)分别接种大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、蜡状芽孢杆菌，接种量为100cfu/ml，接种后室温放置15天，检测接种过的制剂中的总体微生物生长，评价指标主要有显微镜下微生物的数目以及制剂浊度的变化，其中，浊度缺乏表明没有总体微生物生长。其中，本实施例所用微生物包括大肠埃希氏菌(cicc-10003)、金黄色葡萄球菌(cicc-10306)，铜绿假单胞菌(wdcm-00024)，蜡状芽孢杆菌(cicc-10352)。检测结果见表5：在室温20-25℃保存15天，所述a制剂、b制剂不支持微生物生长。表5.a制剂、b制剂的微生物检测结果实施例8：不溶性微粒研究制剂中的不溶性微粒粒径在1-50μm、肉眼不可见，可随血液流动却不能被代谢而可能对人体造成难以发现和潜在的严重危害，因此不溶性颗粒控制被列入注射剂质量标准。分别配制bat1406a制剂的低、中、高浓度样品，其中：a1样品抗体部分浓度为4mg/ml，其余部分均同表1a；a2样品抗体部分浓度为20mg/ml，其余部分均同表1a；a3样品组成同表1a；分别配制bat1406b制剂的低、中、高浓度样品，其中：b1样品抗体部分浓度为4mg/ml，其余部分均同表1b；b2样品抗体部分浓度为20mg/ml，其余部分均同表1b；a3样品组成同表1b；使用贝克曼实验室液体颗粒计数器(型号hiac9703+)对制剂中不溶性颗粒进行计数。检测结果见表6。表6.两种类型制剂的不溶性微粒检测结果制剂制剂浓度≥10μm微粒数≥25μm微粒数a14mg/ml8.91.4a220mg/ml11.22.3a3100mg/ml15.82.5b14mg/ml9.51.8b220mg/ml13.22.5b3100mg/ml17.12.9由表6可知，a制剂和b制剂的不溶性微粒数均符合《中国药典(2015版)》不溶性微粒检查标准。实施例9：两种制剂生物活性对比研究将100mg/mlbat1406抗体制剂组合物(表1a制剂)保存在2-8℃冰箱中，每3个月进行一次体外tnf-α中和试验(l-929生物活性检测)，每个样品重复2次，时间周期为36个月，以0月的a制剂(表1a)活性作为100％相对活性，设置制剂的正常相对活性范围是80-125％；参照上述a制剂的检测方法对b制剂(表1b)进行检测；上述对a制剂、b制剂的检测结果见表7。表7.两种制剂的长期保存活性检测结果结果表明：本发明的a制剂至少有30个月的保质期，b制剂至少有24个月的保质期。实施例10：重组人抗tnf-α单克隆抗体bat1406蛋白序列重组人抗tnf-α单克隆抗体bat1406，是通过基因工程技术，在cho细胞中表达的，并且通过一系列标准的层析步骤纯化获得的。bat1406属于igg1抗体，分子量约为148kda，由2条igg1z,a重链和2条κ轻链组成。每条重链含有451个氨基酸，分子量为49kda，其重链氨基酸序列如seqidno.1所示；每条轻链含有214个氨基酸，分子量为24kda，轻链氨基酸序列如seqidno.2所示。实施例11：重组人抗tnf-α单克隆抗体bat1406的表达和纯化参照woodetal.,jimmunol.145:3011(1990)等的方法，特异性结合tnf-α的单克隆抗体在cho细胞表达。含抗体基因的表达载体用常规的分子生物学方法构建(molecularcloning)，以cho细胞(atccccl61)的一种衍生细胞系作为宿主细胞表达。高产稳定细胞系的构建过程简单描述如下：宿主细胞悬浮生长于cdchoagttm培养基(gibco,ca)，取处于对数生长期的宿主细胞离心，重悬于新鲜的cdchoagttm培养基，计数并调节细胞密度到1.24×107cells/ml，取800ul上述细胞悬液加入电击杯，然后加入已线性化的质粒40ug，用移液枪吹打使细胞与质粒混合均匀。用bio-rad电转仪转化，仪器参数设定为电容：960ufd，电压：300v。通常电击时间为15-20毫秒为正常。把电击后的细胞立即重悬于37℃预热的cdchoagttm培养基，每孔100ul加入96孔板，2-3天后加入等量的筛选培养基(cdchoagtmedia+50um蛋氨酸亚氨基代砜(msx))。测定96孔板细胞培养上清中抗体的表达水平。表达水平较高的克隆从96孔板转移到24孔板，待细胞生长到一定数量，把细胞转入6孔板，使每孔5ml培养基含2×105个细胞，测定细胞的抗体产量和产率。通常20-30个克隆被转到摇瓶做进一步评价。最后5-8个表达量最高的克隆进行亚克隆和进一步的表达筛选。收获培养液，通过低速离心使细胞和培养基分离，通过高速离心把上清进一步澄清。初步纯化用阳离子交换层析(porosxs介质)能够达到预期目的，在有效捕获目标蛋白同时有效去除了大部分的杂蛋白，纯度达到90％以上。初步纯化后，通过详细的工艺研究，采用了阴离子(gigacapq-650m)及阳离子(cmceramichyperdf)交换层析进行进一步的分离纯化，达到去除内毒素、hcp、dna、酸性异构体等的目的。实施例12：重组人抗tnf-α单克隆抗体bat1406的药效学研究药效学研究主要进行了重组人抗tnf-α单克隆抗体在体外药效试验和体内动物模型的药效学研究。其中体外试验主要进行下面几个方面的药效学检测：与tnf的结合能力，抗体特异性、对tnf与受体结合的竞争性，对tnf-α生物学活性的抑制作用以及细胞毒实验等。以抗体特异性结合为例，比较重组人抗tnf-α单克隆抗体与tnf-α的结合能力。具体实验方法如下：首先用pbs将rhtnf-α、rhtnf-β或者rmtnf-α稀释成50ng/50μl，将稀释好的rhtnf-α、rhtnf-β或者rmtnf-α加到微量96孔酶标板中，50μl/孔，4℃过夜。次日用含3％bsa的pbs封闭，100μl/孔，置37℃2小时。弃上清后，然后往对应孔中分别加入不同浓度的重组人抗tnfα单抗bat1406和人igg(抗体终浓度为60.75ug/ml，3倍稀释，10个梯度，复孔)，37℃下作用2小时。弃上清后，pbst洗板5次，拍干。然后以1：10000加入羊抗人ap二抗，50μl/孔，37℃2小时。弃上清后，pbst洗板8次，加入pnpp显色液，50μl/孔。od405读数，作标准曲线。结果表明不同浓度的重组人抗tnfα单抗,bat1406对rhtnf-α有特异性结合并呈现浓度梯度结果，结果保持一致；但是不同浓度的重组人抗tnfα单抗bat1406对rhtnf-β或者rmtnf-α没有特异结合。阴性对照人igg对rhtnf-α、rhtnf-β或者rmtnf-α都没有特异结合，证明了bat1406只与rhtnf-α结合(ic50＝3×10-9m)，而不与rhtnf-β和rmtnf-α结合。动物体内药效学评价主要进行了急性动物模型和慢性动物模型。其中急性动物模型为d半乳糖敏感小鼠和rhtnf-α诱导的家兔发热模型。以腹腔注射1μgrhtnf-α+20mgd-半乳糖胺的小鼠为研究模型，研究重组人抗tnf-α单抗bat1406拮抗rhtnf-α和d-半乳糖胺的毒性作用，验证了重组人抗tnf-α单克隆抗体注射液具有拮抗1μgrhtnf-α+20mgd-半乳糖胺的毒性作用，提高小鼠存活率的作用。根据rhtnf-α诱导的家兔发热基础体温值变化的模型，实验表明重组人抗tnf-α单抗bat1406具有拮抗rhtnf-α诱导的兔体温升高作用。慢性动物模型为人可溶性tnf转基因鼠(tg197)自发性多发性关节炎模型。利用tg197(稳定表达stnf)转基因小鼠模型，可进行重组人抗tnf-α单抗bat1406的体内药效评价。本研究采用的注射方式是腹腔注射，腹腔内注射的给药方案的确定主要是参考了其他抗tnf-α单克隆抗体在tg197小鼠试验中的历史数据，转基因小鼠分为4组(g1-g4)：每组含不同年龄和性别的8只小鼠，g1组注射生理盐水，g2-g4组分别注射3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg的bat1406抗体。为了防治关节炎，在形成关节炎之前，从第三周开始，按10ul/g体重的用量，每周注射两次实验品，到第十周为止。为控制病变开始时的组织病理学状态，另增加一对照组转基因小鼠(4只)，该组在第一次用药前处死。所有动物在第十周都处死，收集血清和踝关节。血清贮存于-80℃以便做进一步分析，踝关节用于病理学评估。关节炎病变程度采用评分系统，组织病理学评估采用病理学评分系统。实验结果表明实验产品bat1406在3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg的剂量范围内，大部分符合tg197关节炎病理学和活体抑制效果的典型药剂应答。10mg/kg和30mg/kg剂量的bat1406在活体组织病理学的关节炎病理学和组织病理学上都具有很好的抑制效果，统计学上无差异，所获得的分数都比治疗前低，可证明bat1406抗体在tg197关节炎模型上有治疗效果(见图5a、图5b)。实施例13：重组人抗tnf-α单克隆抗体bat1406的药代动力学研究本实施例的目的是以含缓冲体系的bat1406制剂为对照，对本申请不含缓冲体系的bat1406抗体制剂组合物(a制剂)的安全性等进行评价，为未来临床合理用药提供参考依据。利用通过验证的sd大鼠血浆中bat1406抗体elisa含量测定方法，测定bat1406抗体制剂组合物在sd大鼠单次给药后血浆中药物浓度，研究给予高、中、低剂量bat1406抗体制剂组合物后，bat1406抗体在sd大鼠体内的暴露与剂量关系，及其药代动力学特征；通过比较相同抗体剂量bat1406a制剂和bat1406含缓冲体系制剂(前期开发)在sd大鼠体内的动力学特征，进而评价本发明不含缓冲体系制剂与bat1406含缓冲体系制剂(前期开发)两种制剂的生物等效。以a制剂为例，研究方案如下：bat1406a制剂低、中、高剂量组分别为10mg/kg，30mg/kg和100mg/kg(此处的剂量具体指根据sd大鼠的体重对其注射的用量)，bat1406含缓冲体系制剂剂量为30mg/kg，每组8只，雌雄各半，给药方式采用腹腔注射，于给药后1h、4h、24h、48h、72h、96h、7day、9day、11day、13day、15day、22day、29day分别剪尾取血样，采集的血样置于冰浴肝素抗凝离心管中，5min之内进行离心，分离血浆存于-70℃冰箱中冻存待用。血浆样品中bat1406抗体含量的测定方法：首先用可与bat1406抗体fab段发生特异性结合的重组rhtnf-α蛋白包被酶标板，以捕获生物样品中的bat1406抗体，再加入酶标山羊抗人抗体(igg-hrp)，与捕获的bat1406抗体结合，最后加入底物显色，2mol/l硫酸溶液终止反应后，450nm读取各孔的od值。将bat1406抗体标准样品的吸光度和标准样品的浓度经四参数拟合得标准曲线，用所获得的标准曲线对同一块酶标板上测定的待测样品1406抗体的浓度进行定量。以8只鼠所得药代动力学参数的均数代表每一剂量组的药代动力学参数；bat1406抗体不同剂量、不同制剂组间血药浓度的比较采用独立样本t-检验进行统计学判断，结果见表10、表11。表10.bat1406a制剂不同剂量给药后血药浓度均值比较采血时间(h)低剂量组(μg/ml)中剂量组(μg/ml)高剂量组(μg/ml)00.20.51.91415.31013.54502.54193.4553.62241.324180.9421.81831.448124.2337.51733.896145.6277.61114.416893.7226.2956.3216102.5180.5754.726480.3141.6402.331251.487.0278.436023.349.1106.25288.122.771.66964.36.813.8表11含缓冲体系制剂(30mg/kg)和a制剂(30mg/kg)皮下注射血药浓度比较结果(表10、11)显示：在给药后1h，各组的血药浓度达到最高值，之后逐渐下降。比较a制剂与含缓冲体系制剂给药后对应时间点的血药浓度，从表11所列t检验p值可见，两种制剂采用同样的给药方式，对应点的血药浓度没有显著性差异(p>0.05)。实施例14本实施例提供一种抗体组合物样品，原料组成见表12中的z1样品、z2样品，同时，还为z1样品、z2样品设置了对照(d-z1样品、d-z2样品)，并对各样品的舒适性能进行测试，疼痛感的测试参照birthahansen等.painperceptionaftersubcutaneousinjectionsofmediacontainingdifferentbuffers.basic&clinicalpharmacology&toxicology.2006,98,218–221。测试结果见表13。表12表13z1样品z2样品d-z1样品d-z2样品疼痛评分疼痛评分2疼痛评分1疼痛评分4疼痛评分3根据表13测试结果可知，本发明样品的疼痛评分显著低于对照样品，说明本发明显著降低了疼痛级别。实施例15本实施例提供一种以a配方获得抗体制剂样品，原料组成见表14，并对各样品的性能进行测试，测试结果见表15。表14表15在上述实施例1-13的基础上，根据上述表14、表15可知，a1样品、a2样品的效果稍次于a3样品、a4样品，而a3样品、a4样品的效果又相对稍次于表1a所述配方制剂，这说明，本发明存在优选方案。实施例16本实施例提供一种以b配方获得抗体制剂样品组合物样品，原料组成见表16，并对各样品的性能进行测试，测试结果见表17。表16表17在上述实施例1-13的基础上，根据上述表16、表17可知，b1样品、b2样品的效果稍次于b3样品、b4样品，而b3样品、b4样品的效果又相对稍次于表1b所述配方制剂，这说明，本发明存在优选方案。对比例本对比例提供如下四个对比样品，其中：d1样品和d2样品是实施例15中a1样品的对比样品，d3样品和d4样品是实施例16中b1样品的对比样品，本对比例样品组成如下表18所示，对各样品的检测结果如下表19所示。表18表19通过表19的效果可知，对于本申请组合物来讲，酸碱度的调节方式及压力的范围选择对效果的实现起着至关重要的作用。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。sequencelisting<110>百奥泰生物科技（广州）有限公司<120>针对tnf-α的抗体组合物及其应用<130>agp17113801gz<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>451<212>prt<213>artificialsequence<220><223>artificialsequence<400>1gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyarg151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheaspasptyr202530alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045seralailethrtrpasnserglyhisileasptyralaaspserval505560gluglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alalysvalsertyrleuserthralaserserleuasptyrtrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalserseralaserthrlysglyproser115120125valpheproleualaproserserlysserthrserglyglythrala130135140alaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrval145150155160sertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproala165170175valleuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthrval180185190proserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhis195200205lysproserasnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercys210215220asplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleugly225230235240glyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumet245250255ileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhis260265270gluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluval275280285hisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyr290295300argvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasngly305310315320lysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproile325330335glulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnval340345350tyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalser355360365leuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglu370375380trpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpropro385390395400valleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrval405410415asplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmet420425430hisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuser435440445proglylys450<210>2<211>214<212>prt<213>artificialsequence<220><223>artificialsequence<400>2aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnglyileargasntyr202530leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyralaalaserthrleuglnserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspvalalathrtyrtyrcysglnargtyrasnargalaprotyr859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelysargthrvalalaala100105110proservalpheilepheproproseraspgluglnleulyssergly115120125thralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarggluala130135140lysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnsergln145150155160gluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuser165170175serthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysvaltyr180185190alacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlysser195200205pheasnargglyglucys210当前第1页12