一种含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料的制作方法

本发明涉及一种抗菌海藻酸钙敷料，尤其涉及一种含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料，以及该抗菌海藻酸钙敷料的制备方法和应用。

背景技术：

在处理病人伤口时，需要在伤口上覆盖敷料，防止细菌侵入和防止水分损失。传统的敷料如纱布、棉垫等对创面虽有保护作用，但保湿吸液能力差，只能吸收自身重量的4-5倍，而且对于一些伤口在移除传统敷料时，敷料容易粘连伤口组织，造成二次伤口破坏。

用海藻酸钙纤维做成的医用敷料能与创口渗出液及血液中的钠离子进行离子交换，释放出钙离子，钙离子能加速毛细血管末端中血块的形成，有很好的止血效果；在使用过程中，海藻酸钙由于离子交换逐渐转换为水溶性的海藻酸钠，在创口表面形成凝胶层，防止创面组织与敷料的粘连，并能使创面保持一定温度与湿度，促进伤口愈合。海藻酸钙的吸液量可达自身重量的10-20倍。海藻酸钙敷料是一类性能非常好的功能型敷料。

在海藻酸钙敷料中添加抗菌剂将提高该敷料的抗菌性，更加完善其功能。纳米银有较强的抗菌性能，但是由于纳米银的不稳定性以及对人体细胞的毒性较大，美国FDA已经明确禁止纳米银在医疗方面的使用，我国CFDA在医用某些方面限制了纳米银的使用。

近年来，稳定性更好、对人体细胞毒性更小的纳米金作为抗菌剂的研究逐渐被报道。Zhao yuyun等(Zhao Y,Tian Y,Cui Y,et al.Small molecule-capped gold nanoparticles as potent antibacterial agents that target gram-negative bacteria[J].Journal of the American Chemical Society,2010,132(35):12349-12356；Zhao Y,Chen Z,Chen Y,et al.Synergy of non-antibiotic drugs and pyrimidinethiol on gold nanoparticles against superbugs[J].Journal of the American Chemical Society,2013,135(35):12940-12943.和Zhao Y,Ye C,Liu W,et al.Tuning the composition of AuPt bimetallic nanoparticles for antibacterial application[J].Angewandte Chemie International Edition,2014,53(31):8127-8131.)报道的氨基嘧啶或氨基嘧啶/含氨基小分子的双组份药物修饰的纳米金抗菌剂和纳米金铂双金属抗菌剂有很强的广谱抗菌性，其对人体细胞的毒性远远低于纳米银，并且不会产生细菌耐药性，是一类非常有前途的抗菌剂。Anna Regiel-Futyra(Regiel-Futyra A,Kus-M,Sebastian V,et al.Development of Noncytotoxic Chitosan–Gold Nanocomposites as Efficient Antibacterial Materials[J].ACS applied materials&interfaces,2015,7(2):1087-1099.报道的壳聚糖络合的纳米金也具有优异的抗菌性和对人体细胞低的毒性。

上述报道合成的纳米金需要透析处理，工艺较复杂，工艺有待进一步简化；单纯的纳米金溶液不易用于临床的伤口治疗与修复，抗菌性能有待进一步提高。

目前，国内外尚无公开文献报道添加纳米金制作的抗菌海藻酸钙敷料。

技术实现要素：

因此，基于现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种具有广谱抗菌性且对人体细胞毒性较低的含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料，还提供了所述含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料的制备方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料，所述含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料为附着有具有抗菌作用的含金纳米颗粒的海藻酸钙织物或海藻酸钙填充条。优选地，所述织物为无纺织物、机织物或针织物。

根据本发明提供的含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料，其中，所述含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料中含金纳米颗粒的含量为0.01～1％重量百分比。优选地，所述含金纳米颗粒的平均粒径小于50nm，优选为1～10nm。

根据本发明提供的含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料，其中，所述具有抗菌性能的含纳米金的纳米颗粒选自纳米金、由单组份或多组分小分子药物或大分子修饰的纳米金、以及含纳米金的双组份或多组分金属纳米颗粒中的一种或多种。

优选地，所述由单组份或多组分小分子药物或大分子修饰的纳米金为以含氨基嘧啶类小分子作为单组份修饰的纳米金颗粒或以含氨基嘧啶类小 分子/氨基类小分子作为双组份修饰的纳米金颗粒，所述含氨基嘧啶类小分子与金元素的摩尔含量比为0.5:1～2:1，所述氨基类小分子与金元素的摩尔含量比为0.5:1～2:1。最优选地，所述含氨基嘧啶类小分子为4,6-2氨基-2-巯基嘧啶，氨基类小分子为二甲双胍。

或优选地，所述含纳米金的双组份或多组分金属纳米颗粒为纳米金-铂双金属纳米颗粒。最优选地，所述纳米金-铂双金属纳米颗粒由80％原子百分比的金和20％原子百分比的铂组成。

根据本发明提供的含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料，其中，所述具有抗菌作用的含金纳米颗粒是通过将纳米金浆喷涂至海藻酸钙织物或海藻酸钙填充条或它们各自的半成品而附着于所述海藻酸钙织物或海藻酸钙填充条上的。对于海藻酸钙织物而言，当其为无纺织物时，其半成品可以为梳理机或铺网机形成的海藻酸钙棉网，当其为机织物或针织物时，其半成品可以为热压机干燥之前的中间产品；对于海藻酸钙填充条而言，其半成品可以为梳理机形成的海藻酸钙棉网。或所述具有抗菌作用的含金纳米颗粒是通过将海藻酸钙纤维浸入纳米金浆后再制成海藻酸钙织物或海藻酸钙填充条而附着于所述海藻酸钙织物或海藻酸钙填充条上的。

本发明还提供了上述含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)制备海藻酸钙纤维；

(2)用所述海藻酸钙纤维制备织物或填充条，并在制备过程之中或之后喷加纳米金浆；

(3)对织物或填充条进行干燥，制得所述的含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料。该敷料可经进一步分切、包装、灭菌等操作以按需制备敷料产品。

优选地，当步骤(2)中制备织物且所述织物为无纺织物时，则在梳理机形成的海藻酸钙棉网上喷加纳米金浆，当制备织物且所述织物为机织物或针织物时，则在热压机干燥之前喷加纳米金浆，当制备填充条时，则在梳理机形成的海藻酸钙棉网上喷加纳米金浆。

根据本发明的含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料的制备方法，其中，使用气动喷雾器来喷加纳米金浆。优选地，喷涂距离为100～1000mm，喷涂电压为5～110V，气压为0.1～0.5KPa。

根据本发明提供的含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：

(1)制备海藻酸钙纤维；

(2)将所述海藻酸钙纤维浸入纳米金浆中2～30分钟；

(3)用丙酮、异丙醇和乙醇中的一种或多种对海藻酸钙纤维进行脱水、干燥；

(4)将经步骤(3)处理后的海藻酸钙纤维制成海藻酸钙织物或海藻酸钙填充条，即为所述的含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料。该敷料可经进一步分切、包装、灭菌等操作以按需制备敷料产品。

根据本发明提供的含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料的制备方法，其中，所述纳米金浆为所述具有抗菌作用的含金纳米颗粒在水中的分散液。优选地，所述纳米金浆的金含量为0.001～5％重量百分比，相当于10-50000ppm，优选为0.1～5％重量百分比，相当于1000-50000ppm，例如可以为0.8～5％重量百分比，进一步可以为1～5％重量百分比。其中，1ppm通常可换算为1mg/L。

更优选地，所述海藻酸钙纤维是通过以下步骤制得：

(1)将海藻酸钠或海藻酸钾用水溶解，过滤；

(2)经过喷丝板喷出初生丝；

(3)利用氯化钙溶液为凝固液凝固海藻酸钙纤维；

(4)海藻酸钙纤维经过牵引，加热后拉伸；

(5)用去离子水、丙酮和乙醇中的一种或多种进行洗涤；

(6)干燥。

经过上述步骤制备的海藻酸钙纤维通常为长纤维，可切断为短纤维以进行后续加工。

更进一步优选地，所述步骤(3)氯化钙溶液的浓度为1-10％重量百分比，所述步骤(4)的加热温度为60-90℃，优选为75～90℃。

根据本发明提供的含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料的制备方法，其中，所述纳米金浆可以通过以下步骤制得：

(a)按照配比，将氯金酸溶液与含氨基嘧啶类小分子和/或氨基类小分子的溶液或氯铂酸钾溶液混合，得到混合溶液；

(b)在搅拌下向所述混合溶液中快速加入还原剂，充分反应后即得到所述纳米金浆；

其中，所述还原剂的加入时间不超过5分钟，优选不超过1分钟，更优选10～60秒。

优选地，步骤(a)中所述含氨基嘧啶类小分子和/或氨基类小分子的溶液还可以包括有机酸或无机酸。优选为乙酸、丙酸或盐酸。更优选地，酸在混合溶液中的质量百分比为0.0005％～10％。优选地，步骤(a)中所述含氨基嘧啶类小分子和/或氨基类小分子的溶液中还可以包括非离子表面活性剂。优选为吐温或聚乙二醇。更优选地，非离子表面活性剂在所述混合溶液中的质量百分比为0.001％～10％。

优选地，步骤(b)中所述还原剂可以选自硼氢化钠、柠檬酸钠和抗坏血酸钠中的一种或多种。步骤(b)中所述充分反应温度可以为室温或室温以下，例如可以为25℃以下，时间可以为0.5～3小时。

优选地，步骤(b)中所述含纳米金的纳米颗粒在所述纳米金浆中的浓度为10～2000ppm，优选为400～1000ppm，更优选为800～1000ppm。更进一步优选地，所述还原剂与氯金酸的摩尔比或者所述还原剂与氯金酸和氯铂酸钾的摩尔比为1:1～10:1。

更优选地，上述含纳米金的纳米颗粒的制备方法不包含纯化所述纳米金浆的步骤。进一步优选地，纯化所述纳米金浆的步骤包括用透析袋透析处理或离心过滤处理。换言之，本发明生产方法不需要用透析袋透析处理或离心过滤处理等方式来纯化含金纳米颗粒。作为更进一步的限定，上述纳米金浆的制备方法也可以表述为由步骤(a)和步骤(b)组成。

本领域技术人员容易理解，在制备氯金酸溶液时使用的氯金酸原料可以为四水合氯金酸。

本发明还提供了上述含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料或按照上述方法而制备的抗菌海藻酸钙敷料在在制备用于治疗烧伤、烫伤、褥疮感染药物中的应用。

本发明制得的含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料，具有优异的广谱抗菌性，无细菌耐药性，对人体细胞毒性小的抗菌纳米金添加到海藻酸钙敷料中，具有吸液功能、保湿功能、止血功能、抗菌而对人体细胞毒性小的作用，可用于治疗各种烧伤、烫伤、褥疮感染等各种创伤感染，是一种极为优良的医用敷料。

背景中所报道的抗菌纳米金的制备方法中，还原剂是以滴加的方式加入，对于工业化生产，背景报道的滴加方式耗时太长，不能实现，而在本发明提供的含金纳米颗粒的制备方法中，还原剂为一次性快速加入到所述混合溶液，因此更节约时间，有助于提升生产效率。

背景报道的纳米金溶液在反应完成后需要用透析袋透析或离心沉淀，对于工业化生产，背景报道的后处理方法复杂，设备昂贵。而在本发明提供的含金纳米颗粒的制备方法不需要透析或离心沉淀处理，因此工艺更为简单，降低了生产成本，进一步提升了生产效率。

通过试验检测证明，本发明提供的制备方法所制备的含金纳米颗粒的抗菌效果远优于还原剂滴加和/或经过透析处理所制备的含金纳米颗粒。

本发明提供制备方法所制备的含金纳米颗粒的细胞毒性明显低于纳米银溶液和硝酸银溶液。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了实施例1的纳米金与商购纳米银的透射电镜(TEM)图；

图2示出了含实施例1所制备的含金纳米颗粒溶液、纳米银溶液和硝酸银溶液的细胞毒性比较。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

以下实施例中使用的试剂和仪器如下：

仪器：

电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-OES)；型号iCAP 6300；购自：美国Thermo Scientific公司

透射电子显微镜(TEM)；型号Tecnai G2 20S-TWIN；购自：美国FEI公司

实施例1

本实施例用于说明本发明的含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料及其制备方法。

制备海藻酸钙纤维：

(1)将10公斤海藻酸钠用水溶解得到200公斤纺丝液，过滤；

(2)经过喷丝板喷出初生丝；

(3)利用5％(重量百分比)氯化钙溶液为凝固液凝固海藻酸钙纤维；

(4)海藻酸钙纤维经过牵引，经过90℃水浴加热后拉伸；，

(5)用去离子水、丙酮进行洗涤；

(6)干燥得到长纤维10公斤。

制备含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料：

(1)将长纤维切断称为短纤维进行无纺布生产；

(2)在铺网机的海藻酸钙棉网上用气动喷雾器喷加为4,6-2氨基-2-巯基嘧啶/二甲双胍作为双组份修饰的纳米金的纳米金浆，纳米金浆含金量为5％(重量百分比)，每公斤纤维上喷入该溶液200g。喷涂距离为100mm， 喷涂电压为5V，气压为0.1KPa；

(3)经针刺、热压机干燥，制成带纳米金的海藻酸钙无纺布；

(4)还可以把无纺布分切为敷料片，随后进行包装、灭菌，即成为含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料。

上述4,6-2氨基-2-巯基嘧啶/二甲双胍作为双组份修饰的纳米金的制备方法为：

(a)将40g的四水合氯金酸溶于10L的去离子水中，得到氯金酸溶液。将一定量的4,6-2氨基-2-巯基嘧啶和二甲双胍溶于10L的去离子水中，还加入一定量的吐温80和乙酸，以有助于促进氨基嘧啶类小分子与氨基类小分子充分溶解于水中，得到含氨基嘧啶类小分子和/或氨基类小分子的溶液。将两溶液混合，得到混合溶液。

(b)将一定量的抗坏血酸钠溶于5L的去离子水中，在搅拌下将上述抗坏血酸钠溶液快速加入(用时40s)到上述混合溶液中，在室温以下搅拌1小时至充分反应，不需采用透析等纯化工艺，即得到约25L的浓度约为800ppm的(按照投料比算出的)含有上述4,6-2氨基-2-巯基嘧啶/二甲双胍作为双组份修饰的纳米金颗粒的纳米金浆。

根据投料比，4,6-2氨基-2-巯基嘧啶与金元素的摩尔含量比为2:1，二甲双胍与金元素的摩尔含量比为0.5:1，还原剂抗坏血酸钠与氯金酸的摩尔含量比为3:1，乙酸占纳米金浆的质量百分比为0.01％，表面活性剂吐温80占纳米金浆的质量百分比为0.01％。

通过常温溶剂水挥发，使纳米金浆的含金量约为5％重量百分比，相当于50000ppm。

在该含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料中，经ICP-OES测定每片海藻酸钙敷料的含金量为1％(重量百分比)。经200KV六硼化镧透射电子显微镜测定，该敷料中的纳米金颗粒的平均粒径为5nm。其透射电镜图如图1所示(以商购自张家港耐尔纳米科技有限公司的纳米银作对比)。

对比例1

按照与实施例1相同的制备方法制得对比例1的纳米金浆，经过常温溶剂水蒸发，制成纳米金抗菌溶液，使其与实施例1中的纳米金海藻酸钙敷料有相同的纳米金质量百分含量。

对比例1.1

按照与对比例1相似的制备方法制得对比例1.1的纳米金抗菌溶液，其区别在于，对比例1.1中还原剂以滴加的方式加入到混合溶液中，并且采用透析处理24小时的方式得到纳米金抗菌溶液，加入纯化水，使其与对比例1中的纳米金抗菌溶液有相同的纳米金质量百分含量。

试验例1

通过试验例1中的抗菌实验，证明对比例1的纳米金抗菌溶液要优于对比例1.1的纳米金抗菌溶液。

比较方法如下：采用最小抑菌浓度MIC(mg/L)来衡量，采用微孔稀释方法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.，Methodsfor determining bactericidal activity of antimicrobial agents,M26-A,1999.)，将100μL不同浓度的纳米金加入到96微孔板中，10μL相同浓度(10⁴CFU/mL)的细菌培养液加入每个微孔中，37℃培养24小时后观察，没有可看见的细菌生长的微孔中最少的浓度即为最小抑菌浓度(MIC)。

测试结果见表1。从测试结果可见，对比例1的纳米金抗菌溶液的抗菌效果远优于对比例1.1的纳米金抗菌溶液的抗菌效果。说明采用与对比例1制备方法相同的含金纳米颗粒制备的含纳米金的抗菌凝胶，其抗菌效果也应远优于采用与对比例1.1制备方法相同的含金纳米颗粒制备的含纳米金的抗菌凝胶。

表1对比例1和对比例1.1的纳米金抗菌溶液的抗菌性能比较

实施例2

本实施例用于说明本发明的含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料及其制备方法。

制备海藻酸钙纤维：

(1)将5公斤海藻酸钠用水溶解得到100公斤纺丝液，过滤；

(2)经过喷丝板喷出初生丝；

(3)利用1％(重量百分比)氯化钙溶液为凝固液凝固海藻酸钙纤维；

(4)海藻酸钙纤维经过牵引，经过75℃水浴加热后拉伸；

(5)用去离子水、乙醇进行洗涤；

(6)干燥得到长纤维5公斤。

制备含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料：

(1)将长纤维切断称为短纤维进行医用海藻填充条生产；

(2)在梳理机形成机的海藻酸钙棉网上用气动喷雾器喷加含4,6-2氨基-2-巯基嘧啶作为单组份修饰的纳米金的纳米金浆，纳米金浆含金量为0.1％(重量百分比)，每公斤纤维上喷入该溶液100g。喷涂距离为500mm，喷涂电压为50V，气压为0.35KPa；

(3)经热压定型机干燥，制成带纳米金的海藻酸钙填充条；

(4)还可以把海藻填充条分切，随后进行包装、灭菌，即成为含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料。

上述4,6-2氨基-2-巯基嘧啶作为单组份修饰的纳米金的制备方法为：

(a)将40g的四水合氯金酸溶于10L的去离子水中，得到氯金酸溶液。将一定量的4,6-2氨基-2-巯基嘧啶溶于10L的去离子水中，还加入一定量的吐温80和乙酸，得到含氨基嘧啶类小分子的溶液。将两溶液混合，得到混合溶液。

(b)将一定量的抗坏血酸钠溶于5L的去离子水中，在搅拌下将上述抗坏血酸钠溶液快速加入(用时1min)到上述混合溶液中，在室温以下搅拌1小时至充分反应，不需采用透析等纯化工艺，即得到约25L的浓度约为800ppm的(按照投料比算出的)含有上述4,6-2氨基-2-巯基嘧啶作为单组份修饰的纳米金颗粒的纳米金浆。

根据投料比，4,6-2氨基-2-巯基嘧啶与金元素的摩尔含量比为0.5:1，还原剂抗坏血酸钠与氯金酸的摩尔含量比为3:1，乙酸占纳米金浆的质量百分 比为0.0005％，表面活性剂吐温80占纳米金浆的质量百分比为0.001％。

通过常温溶剂水挥发，使纳米金浆的含金量约为5％重量百分比，相当于50000ppm。

在该含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料中，经ICP-OES测定，每片海藻酸钙敷料的含金量为0.01％(重量百分比)。经200KV六硼化镧透射电子显微镜测定，该敷料中的纳米金颗粒的平均粒径为6nm。

对比例2

按照与实施例2相同的制备方法制得对比例2的纳米金浆，再加入一定量去离子水，制成纳米金质量百分比为0.01％的抗菌溶液，使其与实施例2中的纳米金海藻酸钙敷料有相同的纳米金质量百分含量。

实施例3

本实施例用于说明本发明的含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料及其制备方法。

制备步骤如下：

(1)将5公斤海藻酸钠用水溶解得到100公斤纺丝液，过滤；

(2)经过喷丝板喷出初生丝；

(3)利用10％(重量百分比)氯化钙溶液为凝固液凝固海藻酸钙纤维；

(4)海藻酸钙纤维经过牵引，经过90℃水浴加热后拉伸；，

(5)用去离子水进行洗涤制成的海藻酸钙纤维；

(6)将海藻酸钙纤维松散的浸入金含量为1％(重量百分比)的纳米金-铂(双金属纳米颗粒Au₈₀Pt₂₀)溶液(即纳米金浆)中30分钟，浸泡期间多次搅动；

(7)离心脱水机脱水；

(8)乙醇浸泡30分钟；

(9)离心脱水机脱水；

(10)自然挂干；

(11)将长纤维切断成短纤维，再经过纤维的开松、梳理、铺网、针刺等制成带纳米金(纳米金-铂双金属)的海藻酸钙无纺布；

(12)还可以将无纺布分切为敷料片，随后进行包装、灭菌，即成为含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料。

上述纳米金-铂双金属纳米颗粒的制备方法为：

(a)将27g的四水合氯金酸和8g氯铂酸钾溶于10L的去离子水中，得到混合溶液。

(b)将一定量的硼氢化钠溶于10L的去离子水中，在搅拌下将上述硼氢化钠溶液快速加入(用时50s)到上述混合溶液中，在室温以下搅拌1小时至充分反应，不需采用透析等纯化工艺，即得到约20L的含有纳米金-铂双金属纳米颗粒的纳米金浆。

根据投料比，还原剂硼氢化钠与氯金酸和氯铂酸钾的摩尔含量比为4:1，金的原子百分比为80％，铂的原子百分比为20％，因此该金-铂纳米颗粒可表示为Au₈₀Pt₂₀纳米颗粒。

通过常温溶剂水挥发，使纳米金-铂浆的含金-铂量约为1％重量百分比，相当于10000ppm。

在该含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料中，经ICP-OES测定，每片海藻酸钙敷料的含金量为0.1％(重量百分比)。经200KV六硼化镧透射电子显微镜测定，该敷料中的纳米金颗粒的平均粒径为4nm。

对比例3

按照与实施例3相同的制备方法制得对比例3的纳米金-铂双金属纳米颗粒，经过常温溶剂水蒸发，制成纳米金抗菌溶液，使其与实施例3中的纳米金海藻酸钙敷料有相同的纳米金质量百分含量。

试验例1

将实施例1采用的4,6-2氨基-2-巯基嘧啶/二甲双胍作为双组份修饰的纳米金颗粒与纳米银溶液(购自张家港耐尔纳米科技有限公司)的抗菌性能相比较，说明本发明的含该纳米金颗粒的海藻酸钙敷料也应具有良好的抗菌性能。

比较方法如下：采用最小抑菌浓度MIC(mg/L)来衡量，采用微孔稀释方法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.，Methodsfor determining bactericidal activity of antimicrobial agents,M26-A,1999.)，将100μL不同浓度的纳米金或纳米银加入到96微孔板中，10μL相同浓度(10⁴CFU/mL)的细菌培养液加入每个微孔中，37℃培养24小时后观察，没有可看见的细菌生长的微孔中最小的纳米金或纳米银的浓度即为最小抑 菌浓度(MIC)。测试结果见表2。

从测试结果可见，实施例1采用的纳米金颗粒对大肠杆菌和绿脓杆菌的MIC都小于市售含纳米银抗菌剂的MIC，由此说明，该纳米颗粒对大肠杆菌和绿脓杆菌的抗菌性能优于纳米银溶液，采用该纳米颗粒的海藻酸钙敷料的大肠杆菌和绿脓杆菌的抗菌性能优于纳米银溶液。

表2实施例1与纳米银溶液的抗菌性能比较结果

试验例2

通过不同纳米金含量的海藻酸钙敷料抑菌圈实验，来说明含纳米金的抗菌海藻酸钙敷料的抑菌活性。

按照《药品微生物检验手册》第18章第1节管碟法进行试验。对实施例1-3和对比例1-3进行抑菌圈试验。试验结果见表3。

测试结果可见，尽管各实施例的纳米金重量百分比和类型不同，但均可观察到明显的抑菌圈，说明含纳米金的海藻酸钙敷料对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌均有良好的抑菌效果。且同一浓度同一类型的含纳米金的海藻酸钙敷料的抑菌圈均大于纳米金抗菌溶液，说明含纳米金的海藻酸钙敷料的抑菌效果要优于有相同纳米金含量相同纳米金类型的纳米金抗菌溶液。

表3不同纳米金含量的海藻酸钙敷料和溶液抑菌圈测试结果

(单位：mm)

试验例3细胞毒性实验

细胞毒性试验操作过程：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在含有10％牛胎血清的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中培养。在96微孔板的每个孔中加入10⁴个HUVEC细胞，每个孔中加入含不同浓度的纳米颗粒(2-巯基-4,6-二氨基嘧啶/二甲双胍双组分修饰的纳米金颗粒)的纳米金溶液(纳米金浆)、纳米银溶液、硝酸银溶液到200微升。微孔介质中在37℃下培养48小时，没有加入抗菌剂的HUVEC细胞作为对照。培养完后，微孔中的溶液用磷酸缓冲溶液(PBS，0.01mol/L，pH 7.4)洗一次，加入10％(v/v)的CCK-8溶液在微孔介质中，在37℃下培养2小时。在酶联免疫检测仪450nm处测量各样品孔以及对照孔的吸光值。计算各个样品孔细胞相对活力。各样品孔细胞相对活力定义为：各个孔吸光值/对照孔的吸光值×100％。试验结果见图2。

从图2所示的试验结果可知，本发明采用的含金纳米颗粒在不同浓度下的细胞毒性均明显低于纳米银溶液和硝酸银溶液。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神 和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。