本发明属于肿瘤治疗技术领域，尤其是涉及一种靶向肿瘤低氧微环境的中药小分子组合在肿瘤治疗中的应用。
背景技术：
肿瘤是一种严重危害人体健康的重大疾病，虽然传统的治疗方法如手术、化疗和放疗对早期肿瘤控制有了很大提高，但由于肿瘤早期症状的隐蔽性，多数恶性肿瘤一发现即处于中晚期，加上目前肿瘤发生的病因不完全清楚，进一步探索肿瘤发生的原因和发现新的治疗药物仍是肿瘤研究的重要任务。低氧是实体肿瘤的一个典型特征。低氧微环境有利于肿瘤细胞抵抗凋亡和基因异质性，对肿瘤的发生、发展和转移均有促进作用，也降低肿瘤细胞对放化疗的敏感性，是制约肿瘤患者治疗效果的主要障碍之一，靶向低氧微环境已经成为发展肿瘤治疗新方法的重要措施。
技术实现要素：
本发明的目的是针对上述问题，提供一种靶向肿瘤低氧微环境的中药小分子组合在肿瘤治疗中的应用，具有肿瘤预防。治疗效果好的优点。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：一种靶向肿瘤低氧微环境的中药小分子组合在肿瘤治疗中的应用，依次包括以下步骤：
a）对数生长期的人肺癌A549细胞5×103个/孔接种于 96孔板，培养24h后，应用 Lipofectamine2000将构建的低氧诱导因子1α启动子偶联的荧光素酶表达质粒对A549细胞进行转染，建立筛选肿瘤低氧诱导因子1α调节剂的细胞模型；细胞继续培养 12h 后加入5～20µmol/L的筛选复合药物，转入低氧环境下作用 24h；吸取培养上清，1500转离心 10 min，用VEGF ELISA 试剂盒检测培养上清中的VEGF含量，细胞中加入磷酸缓冲盐溶液稀释的荧光素，作用5～10min后用多功能微板读数仪检测各孔荧光强度；根据各加入筛选复合药物的孔相对于未加筛选复合药物的孔的荧光相对值和相对于未加筛选复合药物孔的VEGF相对含量作为评价筛选复合药物调节肿瘤细胞低氧的强弱；荧光相对值为0.8～1.0，VEGF相对含量<0.5时，调节能力为弱；荧光相对值0.5～0.8时，VEGF相对含量0.5～0.8时，调节能力为中等； 荧光相对值<0.5时，VEGF相对含量>0.8时，调节能力为强；选择荧光相对值<0.5，VEGF相对含量>0.8时的筛选复合药物进行肿瘤防治试验；
b）将雌性昆明小鼠的皮肤组织在培养皿中进行体外培养，各皮肤组织的尺寸大小相等，并将皮肤组织分为模型组、组合物高剂量组、组合物中剂量组、组合物低剂量组，每组20个，模型组中不添加筛选复合药物，组合物高剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为300～700mg/kg，组合物中剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为100～300mg/kg，组合物低剂量组中保持培养皿中培养液中筛选复合药物为20～80mg/kg，模型组添加等剂量的生理盐水；于实验第1天在皮肤组织上涂200μl二甲基苯蒽丙酮液，每周1次，共4次；第22天起在相同部位涂0.25%巴豆油丙酮液200μl，每周2次，连续15周；计数各组出现皮肤肿瘤的组数和每组皮肤出现的肿瘤数。
作为优选，所述的筛选复合药物包括桂皮醛、姜辣素、吴茱萸碱、三七皂苷，且按照桂皮醛：姜辣素：吴茱萸碱：三七皂苷为8：1：1：1：1：1的比例组成，上述筛选复合药物使的荧光相对值<0.5时，VEGF相对含量>0.8时，调节能力为强。
作为优选，所述的组合物高剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为500mg/kg，组合物中剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为200mg/kg，组合物低剂量组中保持培养皿中培养液中筛选复合药物为50mg/kg。
作为优选，所述的低氧环境中O2含量为3% ，CO2含量为5%，其余为氮气。
与现有的技术相比，本发明的优点在于：以肿瘤低氧诱导因子1α及其下游VEGF为靶，筛选了靶向肿瘤低氧微环境的中药小分子，并将其组合成复合物开展了肿瘤预防及肿瘤治疗研究，经筛选，发现黄连素、桂皮醛、姜辣素、吴茱萸碱和三七皂苷有较好的调节肿瘤低氧诱导因子1α和VEGF作用，进一步证明黄连素：桂皮醛：姜辣素：吴茱萸碱：三七皂苷=8：1：1：1：1：1组合有最佳的调节低氧诱导因子1α和VEGF作用，有很好的肿瘤预防和治疗效果。
具体实施方式
本方案中一种靶向肿瘤低氧微环境的中药小分子组合在肿瘤治疗中的应用，依次包括以下步骤：
a）对数生长期的人肺癌A549细胞5×103个/孔接种于 96孔板，培养24h后，应用 Lipofectamine2000将构建的低氧诱导因子1α启动子偶联的荧光素酶表达质粒对A549细胞进行转染，建立筛选肿瘤低氧诱导因子1α调节剂的细胞模型；细胞继续培养 12h 后加入10µmol/L的筛选复合药物，转入低氧环境下作用 24h；吸取培养上清，1500转离心 10 min，用VEGF ELISA 试剂盒检测培养上清中的VEGF含量，细胞中加入磷酸缓冲盐溶液稀释的荧光素，作用5～10min后用多功能微板读数仪检测各孔荧光强度；根据各加入筛选复合药物的孔相对于未加筛选复合药物的孔的荧光相对值和相对于未加筛选复合药物孔的VEGF相对含量作为评价筛选复合药物调节肿瘤细胞低氧的强弱；荧光相对值为0.8～1.0，VEGF相对含量<0.5时，调节能力为弱；荧光相对值0.5～0.8时，VEGF相对含量0.5～0.8时，调节能力为中等； 荧光相对值<0.5时，VEGF相对含量>0.8时，调节能力为强；选择荧光相对值<0.5，VEGF相对含量>0.8时的筛选复合药物进行肿瘤防治试验；
b）将雌性昆明小鼠的皮肤组织在培养皿中进行体外培养，各皮肤组织的尺寸大小相等，并将皮肤组织分为模型组、组合物高剂量组、组合物中剂量组、组合物低剂量组，每组20个，模型组中不添加筛选复合药物，组合物高剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为300～700mg/kg，组合物中剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为100～300mg/kg，组合物低剂量组中保持培养皿中培养液中筛选复合药物为20～80mg/kg，模型组添加等剂量的生理盐水；于实验第1天在皮肤组织上涂200μl二甲基苯蒽丙酮液，每周1次，共4次；第22天起在相同部位涂0.25%巴豆油丙酮液200μl，每周2次，连续15周；计数各组出现皮肤肿瘤的组数和每组皮肤出现的肿瘤数。
具体的说，所述的筛选复合药物包括桂皮醛、姜辣素、吴茱萸碱、三七皂苷，且按照桂皮醛：姜辣素：吴茱萸碱：三七皂苷为8：1：1：1：1：1的比例组成，上述筛选复合药物使的荧光相对值<0.5时，VEGF相对含量>0.8时，调节能力为强。
具体的说，所述的组合物高剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为500mg/kg，组合物中剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为200mg/kg，组合物低剂量组中保持培养皿中培养液中筛选复合药物为50mg/kg。
具体的说，所述的低氧环境中O2含量为3% ，CO2含量为5%，其余为氮气。
试验结果：模型组20组皮肤组织全部发生皮肤癌，小鼠皮肤组织出现的肿瘤数为15.6±3.1；组合物高剂量组出现皮肤肿瘤的皮肤组织为6组，小鼠皮肤组织出现的肿瘤数为3.1±2.4（与模型组比较 p<0.05）；组合物中剂量组出现皮肤肿瘤的皮肤组织12组，小鼠皮肤组织出现的肿瘤数为6.5±2.2（与模型组比较 p<0.001）；组合物低剂量组出现皮肤肿瘤的皮肤组织为18组，小鼠皮肤出现的肿瘤数为10.5±2.6（与模型组比较 p<0.05）。
以上结果表明，该筛选复合药物对二甲基苯蒽/巴豆油引起小鼠皮肤癌有明显预防作用。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。