本发明涉及一种小球藻深层净化因子的制备方法，属于日用化妆品技术领域。
背景技术：
小球藻深层净化因子(CPEs)，是一种包含了蛋白质、多糖、核酸、多肽、维生素和微量元素等多种物质的混合物，其多样化的物质组成使其具有多种护肤功效：清除自由基、螯合氧化还原重金属离子、强化角质层屏障、调节巨噬细胞体外免疫功能、修复细胞及DNA损伤，抗污染和抗辐射，并且极尽安全无刺激。
目前的小球藻研发和专利主要集中在制备多肽、蛋白等单一成分，如CN102851345A，CN102304168A等，也有制备小球藻多成分的，如CN1367257A，CN101053577A，但该方案主要做粗提取或最终做成固体制剂，不方便在化妆品中添加应用。
现有技术对小球藻抗污染和深层净化的成分的研究和制备报道较少，常规的制备方法如煮沸提取效率低；超声提取不适合大规模生产，并有安全隐患；高温高压或强酸强碱破壁提取会损失部分对抗污染有效的成分；而常规的酶解法则时间长步骤繁琐，并且由于小球藻营养成分丰富，在长时间的酶解和提取过程中会有细菌繁殖引起成分损失的风险。传统的灭菌方法为高温灭菌同样引起有效成分的降解，如美拉德反应等使成分发生变化，颜色加深。
如雾霾、香烟、自由基、重金属、汽车尾气、不良化妆品等污染源对人体皮肤的损伤日益严重，而小球藻深层净化因子是对抗清除这些污染的天然利器，化妆品的制备方式决定更青睐使用液体原料，如何制备出稳定，抗污染活性物质保留好的小球藻深层净化因子提取液具有现实指导意义。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中的缺陷，提供一种小球藻深层净化因子提取液的制备方法，并重点做提取液抗污染和深层净化相关的功效验证，得到一种适合化妆品应用的稳定有效的小球藻深层净化因子提取液，本方法对小球藻深层净化因子的提取效率高，周期短，过程环保安全。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种小球藻深层净化因子提取液的制备方法，其包括如下步骤：
S1：将小球藻分散于水中，在45～55℃下加入纤维素酶和果胶酶，同时进行闪式提取和酶解后，进行膜过滤，收集滤液；温度过低会影响酶解效率和提取效率，温度过高又会影响酶活力并增加杂质的溶出和有效成分的降解；
S2：在步骤S1得到的滤液中加入甘油，在-4～0℃下进行老化，再次进行膜过滤，收集滤液；温度过低有结冻几率，会使大分子蛋白和多糖析出，温度过高老化效果下降，即杂质去除的少；
S3：将步骤S2得到的滤液进行纳滤浓缩，至小球藻的含量为滤液重量的20～30％后，在200MPa、不高于45℃的条件下进行高压灭菌和均质处理，进行膜过滤，得到所述小球藻深层净化因子提取液。
作为优选方案，所述纤维素酶和果胶酶的加入量均为小球藻重量的1.2％，所述纤维素酶和果胶酶的活力单位均为10000U。
作为优选方案，步骤S1中的酶解过程中，每隔15min进行一次闪式提取。
作为优选方案，所述闪式提取的转速为10000～12000转/min。
作为优选方案，步骤S1中的膜过滤是用0.45μm孔径的微米膜进行的。
作为优选方案，步骤S2中的甘油加入量为步骤S1得到的滤液的重量的5～10％。
作为优选方案，步骤S2中的膜过滤是用0.22μm孔径的微米膜进行的。
作为优选方案，步骤S3中的纳滤浓缩是用300D的纳滤膜进行的。
作为优选方案，步骤S3中的高压灭菌和均质处理是在高压均质机中进行的，且控制所述高压均质机的频率为50Hz。
作为优选方案，步骤S3中的膜过滤是用0.1μm孔径的微米膜进行的。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、通过闪式提取产生的快速混合，负压，剪切，高速碰撞等作用结合酶解加速细胞壁破碎进程，并在细胞壁破除后快速提取有效成分，提取周期短效率高；
2、整个工艺过程温度较低，对有效成分的保留比较好，同时减少油脂等小极性杂质的溶出，增加产品稳定性；
3、不使用高温、有机溶剂、强酸强碱等，节能环保安全，同时也注重工艺过程的防菌，使产品更有效安全。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例涉及的小球藻深层净化因子提取液的制备方法如图1所示，包括如下步骤：称取小球藻于闪式提取罐中，加10倍纯化水，加热至50℃，加小球藻质量的1.2％的纤维素酶和果胶酶，闪式提取2min，酶解2h，酶解过程每隔15min开动闪式提取，每次2min；提取结束用0.45微米膜过滤，加甘油至10％，-4℃老化12h，趁冷用0.22微米膜过滤，用300D纳滤膜浓缩至小球藻占提取液质量的25％，200MP高压均质处理，频率为50Hz，通冷却水维持物料温度≤45℃，0.1微米膜过滤即得。所得提取液的总糖含量为1.1％，总多肽0.39％，加速试验稳定性为3.5个月，10％的提取液对Cu2+的螯合率为54.6％，1％的提取液对˙OH的清除率为79.7％，0.01％的提取液后巨噬细胞的吞噬率为192.4％，3D皮肤功效评价实验如表1所示：
表1
实施例2
称取小球藻于闪式提取罐中，加12倍纯化水，加热至45℃，加小球藻质量的1.5％的纤维素酶和果胶酶，闪式提取2min，酶解1.5h，酶解过程每隔15min开动闪式提取，每次2min；提取结束用0.45微米膜过滤，加甘油至5％，-4℃老化15h，趁冷用0.22微米膜过滤，用150D纳滤膜浓缩至小球藻占提取液质量的20％，180MP高压均质处理，频率为50Hz，通冷却水维持物料温度≤45℃，0.1微米膜过滤即得。所得提取液的总糖含量为0.98％，总多肽0.34％，加速试验稳定性为4个月，10％的提取液对Cu2+的螯合率为51.9％，1％的提取液对·OH的清除率为74.1％，0.01％的提取液后巨噬细胞的吞噬率为185.6％，3D皮肤功效评价实验如表2所示：
表2
实施例3
称取小球藻于闪式提取罐中，加8倍纯化水，加热至55℃，加小球藻质量的1.0％的纤维素酶和果胶酶，闪式提取1.5min，酶解2h，酶解过程每隔15min开动闪式提取，每次1.5min；提取结束用0.45微米膜过滤，加甘油至8％，0℃老化18h，趁冷用0.22微米膜过滤，用300D纳滤膜浓缩至小球藻占提取液质量的30％，150MP高压均质处理，频率为50Hz，通冷却水维持物料温度≤45℃，0.1微米膜过滤即得。所得提取液的总糖含量为1.2％，总多肽0.45％，加速试验稳定性为3个月，10％的提取液对Cu2+的螯合率为62.6％，1％的提取液对˙OH的清除率为83.4％，0.01％的提取液后巨噬细胞的吞噬率为197.1％，3D皮肤功效评价实验如表3所示：
表3
对比例1
称取小球藻于提取罐中，加10倍纯化水，加热至50℃，加小球藻质量的1.2％的纤维素酶和果胶酶，酶解6h，酶解过程结束煮沸提取2h；提取结束用0.45微米膜过滤，减压浓缩至小球藻占提取液质量的25％，100℃灭菌1h即得。所得提取液的总糖含量为0.95％，总多肽0.31％，加速试验稳定性为20天，10％的提取液对Cu2+的螯合率为41.2％，1％的提取液对˙OH的清除率为55.1％，0.01％的提取液后巨噬细胞的吞噬率为141.3％，3D皮肤功效评价实验如表4所示：
表4
对比例2
称取小球藻于提取罐中，加10倍纯化水，沸提取3h；提取结束用0.45微米膜过滤，减压浓缩至小球藻占提取液质量的25％，100℃灭菌1h即得。所得提取液的总糖含量为0.32％，总多肽0.09％，加速试验稳定性为一个月，10％的提取液对Cu2+的螯合率为9.1％，1％的提取液对˙OH的清除率为17.4％，0.01％的提取液后巨噬细胞的吞噬率为109.4％，3D皮肤功效评价实验如表5所示：
表5
对比例3
称取小球藻于高压灭菌罐中，加10倍纯化水，121℃高温高压灭菌1h；冷却后用0.45微米膜过滤，减压浓缩至小球藻占提取液质量的25％，100℃灭菌1h即得。所得提取液的总糖含量为0.83％，总多肽0.27％，加速试验稳定性为25天，10％的提取液对Cu2+的螯合率为47.3％，1％的提取液对˙OH的清除率为54.7％，0.01％的提取液后巨噬细胞的吞噬率为135.7％，3D皮肤功效评价实验如表6所示：
表6
各实施例和对比例中营养成分的检测方法如下：
总糖：苯酚硫酸法；
总多肽：Folin—酚试剂法(lowry法)；
各实施例和对比例的产品的性能的测试方法如下：
加速试验条件：48℃、4℃、-18～48℃交替、常温光照；
Cu2+清除实验：Cu2+-1.875mmol/L，邻苯二酚紫-20mmol/L，最大吸收波长632nm，
Cu螯合率＝【C(Cu反应前)-C(Cu-样品)】÷C(Cu反应前)×100％；
˙OH清除率：Fenton反应，参考波长630nm，检测波长550nm，
˙OH清除率＝[C(˙OH反应前)-C(˙OH-样品)]÷C(˙OH反应前)×100％。
对巨噬细胞Ana-1吞噬活性的影响实验
取对数生长期的细胞，吹打制成2*105个/mL单细胞悬液，每孔100μL，接种于96孔细胞板，细胞贴壁后弃培养上清液，设对照组、加药组，每组6个复孔，分别培养24，48，72h后，每孔加新鲜配制的0.1％NR和PM2.5悬浊液20μL，轻轻混匀后继续培养3h。之后小心吸弃含有NR的培养液，用生理PBS轻柔洗去未被吞噬的NR。每孔加150μL细胞裂解液(无水乙醇:乙酸＝1:1(v/v))，静置2h，使细胞溶解，震荡混匀后测定540nm处OD值[90]。细胞对NR的吞噬率如下：
吞噬率＝加药组/对照组*100％。
3D皮肤功效评价实验
地点：在上海市中心(徐家汇)收集大气PM2.5，
时间：2016年1月14日-16日(分次提取，1小时/次)共计2小时，
大气条件：实验地段平均每天有700000±300辆汽车通过，
动力：气泵维持恒定流速(1.13±0.113m3/分)。
提取装置如上包括：
PM接收装置→PM10过滤器→3D皮肤→细胞培养处理膜→DMEM培养基→吸扬式气泵
实验步骤：
准备三台装置，将3块3D皮肤做免疫标记。
A、直接培养人3D皮肤5天；B、提取PM2.51小时后培养人3D皮肤5天；C、在3D皮肤上均匀涂抹样品后再提取PM2.51小时，培养3D皮肤5天
5天后使用Leica’s Q500成像分析软件测量A/B/C三种情况下人3D皮肤厚度；检测标记物丝聚蛋白的表达量。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。