本发明涉及一种组合物，特别涉及一种治疗肝损伤的复方葛花组合物，以及该组合物的制备方法和用途。该组合物由葛花、密蒙花和菊花有效成分提取物组成，属于中药有效成分提取物领域。本复方制剂在治疗肝损伤上有很好的疗效。
背景技术：
肝脏是人体的重要器官，其主要负责机体代谢、解毒和胆汁生成等生理活动。肝损伤是多种肝脏疾病共有的一种病理状态，其损伤机制主要为氧化应激、细胞凋亡、细胞因子过表达、微循环障碍和非特异性炎症细胞肝内聚集等。肝损伤患者约占世界人口总数10％，损伤类型主要包括机械性肝损伤、药物性肝损伤和酒精性肝损伤，其严重影响患者生活质量并危害生命健康。因此，对肝损伤的预防与治疗成为当前医学的重要研究领域。目前，用于治疗肝损伤的药物主要为西药，如：肝泰乐、肌苷片等，但其在使用过程中存在毒副作用大和治疗靶点单一等劣势。中药复方治疗肝损伤多是根据辩证论治佐以组方遣药，其合理的组方在治疗肝损伤方面效果显著。复方提取液具有成分多样，治疗靶点分散且毒副作用低的特点。本复方组合物以中医理论与现代药理学研究成果为指导，结合临床实践，以葛花与密蒙花和菊花相互配伍，发挥协同作用提高肝损伤的治疗效果，药理学研究显示配伍后抗肝损伤作用优于单味药物。本发明所涉及的复方葛花组合物包括葛花、密蒙花和菊花三味药的有效成分提取物，三者配伍用于肝损伤的治疗目前还未见报道。
葛花，豆科植物葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥花。味甘、性平，功效护肝解毒、解酒醒脾。
密蒙花，马钱科植物密蒙花Buddleja officinalis Maxim.的干燥花蕾及花序。味甘、性寒，功效清热养肝、明目退翳。
菊花，菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥头状花序。味苦甘、性寒，功效平肝明目、清热解毒。
技术实现要素：
本发明提供一种治疗肝损伤的复方葛花组合物。该组合物由葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物以及药学上可接受的辅料组成。该组合物中葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物的重量配比为2∶(2～0.5)。
在本发明的优选实施方案中，上述重量配比优选为2∶(0.5～1)，更优选为2∶1。
密蒙花、菊花有效成分混合提取物由密蒙花和菊花按1∶1等重量混合提取。
药学上可接受的辅料为淀粉、环糊精、微晶纤维素和/或水。
本发明还提供了上述复方葛花组合物的制备方法，包括以下步骤：
将葛花粉碎成粉末状，采用水蒸汽蒸馏法提取挥发油，将药渣用10～12倍量体积浓度95％乙醇溶液加热回流提取3次，每次2小时，合并滤液，回收乙醇溶液得到乙醇溶液提取物。乙醇溶液提取物用水溶解后，经AB-8大孔树脂吸附，分别用水、体积浓度50％乙醇溶液、体积浓度95％乙醇溶液洗脱，收集体积浓度50％乙醇溶液洗脱液，浓缩、干燥后与挥发油部分混合均匀，即得葛花有效成分提取物。
将密蒙花和菊花等重量混合后粉碎成粉末状，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，将药渣用8～10倍量体积浓度75％乙醇溶液加热回流提取3次，每次3小时，合并滤液，回收乙醇溶液得到乙醇溶液提取物。乙醇溶液提取物用水溶解后，经D-101大孔树脂吸附，分别用水、体积浓度20％乙醇溶液、体积浓度50％乙醇溶液、体积浓度95％乙醇溶液洗脱，收集体积浓度20％和体积浓度50％乙醇溶液的洗脱液，浓缩、干燥后与挥发油部分混合均匀，即得密蒙花、菊花有效成分混合提取物。
将葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物按2∶(2～0.5)的重量配比组合即得到治疗肝损伤的复方葛花组合物，其中，上述重量配比优选为2∶(0.5～1)，更优选为2∶1。
本发明复方葛花组合物在制备治疗肝损伤药物中的应用，加入药学上可接受的辅料可进一步制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、口服液等口服制剂。
本发明的有益效果为：葛花具有护肝解毒作用，以此为君药，配伍具有养肝清热作用的密蒙花和具有平肝清热作用的菊花，发挥协同作用，增强保肝、护肝的功效，配伍合用较之单味药物的作用更佳，可以发挥中医药的配伍优势，综合改善肝损伤的各种症状。本发明是发掘祖国传统医药宝库，在肝损伤治疗基础上，选用纯中药按照中医基础理论组方，经严格筛选，结合现代先进工艺制法组合而成。该组合物可达到治疗肝损伤的药效，具有疗效显著、毒副作用小和操作简便等特点。
具体实施方式
一、组合物制剂制备方法最佳实施例
1.制备方法优选实施例
粉碎的葛花药材经水蒸汽蒸馏法提取挥发油，干燥后的药渣用10倍量体积浓度95％乙醇溶液加热回流提取3次，每次2小时，合并滤液，回收乙醇溶液得到乙醇溶液提取物。乙醇溶液提取物用水溶解后，经AB-8大孔树脂吸附，分别用水、体积浓度50％乙醇溶液、体积浓度95％乙醇溶液各洗脱8倍柱体积，收集体积浓度50％乙醇溶液洗脱液，浓缩干燥后与挥发油部分混合均匀，即得葛花有效成分提取物。
粉碎的密蒙花和菊花药材(1∶1等重量混合)经水蒸气蒸馏法提取挥发油，干燥后的药渣用10倍量75％乙醇溶液加热回流提取3次，每次3小时，合并滤液，回收乙醇溶液得到乙醇溶液提取物。乙醇溶液提取物用水溶解后，经D-101大孔树脂吸附，分别用水、体积浓度20％乙醇溶液、体积浓度50％乙醇溶液、体积浓度95％乙醇溶液各洗脱8倍柱体积，收集体积浓度20％和体积浓度50％乙醇溶液洗脱液，浓缩干燥后与挥发油部分混合均匀，即得密蒙花、菊花有效成分混合提取物。
按上述制备方法得到的葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物按重量比为2∶(2～0.5)，优选为2∶(0.5～1)，更优选为2∶1组合，加入药学上可接受的辅料可进一步制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、口服液。葛花与密蒙花和菊花的有效提取物在上述重量比范围内的组合形成的复方组合物，达到了相互配伍，发挥协同作用提高肝损伤的治疗效果，药理学研究显示配伍后抗肝损伤作用优于单味药物。
2.制剂实施例
实施例：复方葛花组合物片剂的制备
葛花有效成分提取物与密蒙花、菊花有效成分混合提取物以2∶1重量比组合，加入淀粉、环糊精、微晶纤维素。将上述组分混合均匀，加滑石粉适量，压片，制成片剂。
实施例：复方葛花组合物胶囊剂的制备
葛花有效成分提取物与密蒙花、菊花有效成分混合提取物以2∶1重量比组合，加入淀粉、环糊精、微晶纤维素。将上述组分混合均匀，80目筛制颗粒，60目筛整粒，填充胶囊，制成胶囊剂。
二、药效研究实施例
1.复方葛花组合物对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的影响
样品：空白对照组，模型对照组，阳性药对照组(联苯双酯)，葛花有效成分提取物与密蒙花、菊花有效成分混合提取物以2∶1重量比组合的复方葛花组合物(FFGH)高、中、低剂量组，葛花(GH)有效成分高、中、低剂量组，密蒙花菊花有效成分混合物(MMHJH)高、中、低剂量组。
实验动物：昆明种小鼠
实验方法：每组小鼠雌雄各半，共取144只，分12组，每组12只，各受试药物组每日灌胃给药一次，阳性药对照组给药剂量为10mg/kg，FFGH高、中、低组给药剂量为48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，GH高、中、低组给药剂量为48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，MMHJH高、中、低组给药剂量为48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，空白对照组、模型对照组给予同体积蒸馏水，上述给药剂量参考2015版《中国药典》和相关用药指导后按人鼠给药比例折算后确定，连续给药7天，于第6天晚9点禁食，于第7天早9点灌胃给药，2小时后进行造模。造模方法：除空白对照组外，其余各组腹腔注射0.15％四氯化碳豆油溶液0.2mL/10g体重，禁食10小时后摘眼球取血，取离心血清测定谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)，结果见表1，统计方法采用t检验。
表1：受试药物对CCL4致急性肝损伤血清ALT和AST的影响(n＝12)
注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01
上述结果表明：对血清ALT，模型组与空白组比较具有显著性差异P＜0.01，指标显著升高；FFGH组与模型组比较，高、中剂量具有显著性差异P＜0.01，低剂量具有差异P＜0.05，可回调升高指标；GH组与模型组比较，高剂量组具有差异P＜0.05，中、低剂量组未见差异；MMHJH组与模型组比较，高、中、低剂量组未见差异。对血清AST，模型组与空白组比较具有显著性差异P＜0.01，指标显著升高；FFGH组与模型组比较，高剂量具有显著性差异P＜0.01，中、低剂量具有差异P＜0.05，可回调升高指标；GH组与模型组比较，高、中剂量组具有差异P＜0.05，低剂量组未见差异；MMHJH组与模型组比较，高剂量组具有差异P＜0.05，中、低剂量组未见差异。可见复方葛花组合物能回调肝损伤时血清ALT和AST指标，葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物能部分回调指标。但其降酶作用复方葛花组合物明显优于其余受试药物，协同配伍组成复方降酶药效优势明显。
2.复方葛花组合物对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的影响
样品：空白对照组，模型对照组，阳性药对照组(硫普罗宁)，葛花有效成分提取物与密蒙花、菊花有效成分混合提取物以2∶1重量比组合的复方葛花组合物(FFGH)高、中、低剂量组，葛花(GH)有效成分高、中、低剂量组，密蒙花菊花有效成分混合物(MMHJH)高、中、低剂量组。
实验动物：Wistar种大鼠
实验方法：实验各组除空白对照组外用30％CCL4豆油溶液灌胃，每间隔5天灌胃一次，连续三个月。阳性药对照组给药剂量为120mg/kg，FFGH高、中、低组给药剂量为48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，GH高、中、低组给药剂量为48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，MMHJH高、中、低组给药剂量为48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，空白对照组、模型对照组给予同体积蒸馏水，上述给药剂量参考2015版《中国药典》和相关用药指导后按人鼠给药比例折算后确定，实验于末次给药2小时将动物摘眼球取血，检测血中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)的浓度。结果见表2、表3，统计方法采用t检验。
表2：受试药物对CCL4致慢性肝损伤血清ALT和AST的影响(n＝12)
注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01
上述结果表明：对血清ALT，模型组与空白组比较具有显著性差异P＜0.01，指标显著升高；FFGH组与模型组比较，高剂量具有显著性差异P＜0.01，中、低剂量具有差异P＜0.05，可回调升高指标；GH组与模型组比较，高剂量组具有差异P＜0.05，中、低剂量组未见差异；MMHJH组与模型组比较，高剂量组具有差异P＜0.05，中、低剂量组未见差异。对血清AST，模型组与空白组比较具有显著性差异P＜0.01，指标显著升高；FFGH组与模型组比较，高剂量具有显著性差异P＜0.01，中剂量具有差异P＜0.05，可回调升高指标，低剂量组未见差异；GH组与模型组比较，高、中剂量组具有差异P＜0.05，低剂量组未见差异；MMHJH组与模型组比较，高剂量组具有差异P＜0.05，中、低剂量组未见差异。可见复方葛花组合物能回调肝损伤时血清ALT和AST指标，葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物能部分回调指标。但其降酶作用复方葛花组合物明显优于其余受试药物，协同配伍组成复方药效优势明显。
表3：受试药物对CCL4致慢性肝损伤血清TP和ALB的影响(n＝12)
注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较，Δp＜0.05，ΔΔP＜0.01
上述结果表明：对血清TP，模型组与空白组比较具有显著性差异P＜0.01，指标显著降低；FFGH组与模型组比较，高剂量具有显著性差异P＜0.01，中剂量具有差异P＜0.05，可回调降低指标，低剂量组无影响；GH组与模型组比较，高剂量组具有差异P＜0.05，中、低剂量组未见差异；MMHJH组与模型组比较，高剂量组具有差异P＜0.05，中、低剂量组未见差异。对血清ALB，模型组与空白组比较具有显著性差异P＜0.01，指标显著降低；FFGH组与模型组比较，高剂量具有显著性差异P＜0.01，中、低剂量具有差异P＜0.05，可回调降低指标；GH组与模型组比较，高、中剂量组具有差异P＜0.05，低剂量组未见差异；MMHJH组与模型组比较，高剂量组具有差异P＜0.05，中、低剂量组未见差异。可见复方葛花组合物能回调肝损伤时血清TP和ALB指标，葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物能部分回调指标。复方葛花组合物明显优于其余受试药物，协同配伍组成复方降酶药效优势明显。
3.复方葛花组合物对大鼠肝组织胶原蛋白含量的影响
样品：空白对照组，模型对照组，阳性药对照组(硫普罗宁)，葛花有效成分提取物与密蒙花、菊花有效成分混合提取物以2∶1重量比组合的复方葛花组合物(FFGH)高、中、低剂量组，葛花(GH)有效成分高、中、低剂量组，密蒙花菊花有效成分混合物(MMHJH)高、中、低剂量组。
实验动物：Wistar种大鼠
实验方法：实验各组除空白对照组外用30％CCL4豆油溶液灌胃，每间隔5天灌胃一次，连续三个月。阳性药对照组给药剂量为120mg/kg，FFGH高、中、低组给药剂量为48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，GH高、中、低组给药剂量为48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，MMHJH高、中、低组给药剂量为48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，空白对照组、模型对照组给予同体积蒸馏水，上述给药剂量参考2015版《中国药典》和相关用药指导后按人鼠给药比例折算后确定，实验于末次给药2小时取肝脏组织匀浆，用无水乙醇、丙酮脱水、脱脂制成肝粉。取10mg肝粉加入6mol/L HCL1.5ml，沸水水浴5小时，待冷却后取上清液在550nm波长比色。按公式求得羟脯氨酸含量，再折算成胶原蛋白的含量。结果见表4，统计方法采用t检验。
胶原蛋白ug/mg肝粉＝羟脯氨酸含量÷13.4％
表4：受试药物对CCL4致大鼠肝组织胶原蛋白的影响(n＝12)
注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01
上述结果表明：对于肝组织胶原蛋白含量，模型组与空白组比较具有显著性差异P＜0.01，指标显著升高；FFGH组与模型组比较，高剂量具有显著性差异P＜0.01，中剂量具有差异P＜0.05，可回调降低指标，低剂量组无影响；GH组与模型组比较，高剂量组具有差异P＜0.05，中、低剂量组未见差异；MMHJH组与模型组比较，高剂量组具有差异P＜0.05，中、低剂量组未见差异。可见复方葛花组合物能回调肝损伤时肝脏组织胶原蛋白含量，葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物能部分回调指标。复方葛花组合物明显优于其余受试药物，协同配伍组成复方抗肝纤维化药效优势明显。
4.复方葛花组合物对大鼠胆汁排出量的影响
样品：空白对照组，阳性药对照组(去氧胆酸)，葛花有效成分提取物与密蒙花、菊花有效成分混合提取物以2∶1重量比组合的复方葛花组合物(FFGH)高、中、低剂量组，葛花(GH)有效成分高、中、低剂量组，密蒙花菊花有效成分混合物(MMHJH)高、中、低剂量组。
实验动物：Wistar种大鼠
实验方法：实验前禁食12～16小时，用20％乌拉坦(0.89ml/kg)麻醉，背位固定，开腹后找到胃幽门部，以幽门部为准翻转十二指肠，即可见到白色的十二指肠乳头部，从乳头部追踪到胆总管，暴露胆总管，结扎下端，向胆总管近端插入外径1mm左右的塑料管，形成漏管引流胆汁。待胆汁流量稳定20分钟后，各给药组于十二指肠注射药物，正常对照组给予同体积蒸馏水，测定给药后30，60，90，120，180分钟胆汁流量。结果见表5，统计采用t检验。
表5：复方葛花组合物对大鼠胆汁排出量的影响(n＝12)
注：与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01
上述结果表明：各受试药物组与空白组比较，30min和60min时均未出现胆汁量排除增加；90min时与空白组比较FFGH组高剂量组具有显著差异P＜0.01，中、低剂量具有差异P＜0.05，增加胆汁排出量；120min时与空白组比较FFGH组高、中剂量组具有显著差异P＜0.01，胆汁分泌量增加。180min时与空白组比较FFGH组高剂量组具有显著差异P＜0.01，中剂量组具有差异P＜0.01，胆汁分泌量增加。可见复方葛花组合物具有利胆作用，葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物不及配伍后应用。复方葛花组合物明显优于其余受试药物，协同配伍组成复方利胆药效优势明显。
综上所述，葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物按比例组合后所得复方葛花组合物经实验证明，对急性肝损伤模型具有显著治疗作用，可通过降低ALT和AST发挥降酶保肝的抗肝损伤作用。对慢性肝损伤模型也表现出显著治疗作用，可通过降低ALT、AST、TP和ALB发挥降酶保肝的抗肝损伤作用。复方葛花组合物其可降低慢性肝损伤中肝脏组织胶原蛋白含量，可通过减轻肝纤维化发挥抗肝损伤作用。同时，通过对胆汁排出量实验，发现复方葛花组合物具有显著的利胆保肝抗肝损伤作用。通过以上研究可以发现，复方葛花组合物的抗肝损伤作用强于葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物，说明联合应用不是简单的治疗相加作用而是协同配伍增强疗效。因此，复方葛花组合物具有保肝、降酶、利胆、降低肝纤维化程度等抗肝损伤的综合作用，可达到治疗肝损伤的药效。