一种人造血管及其制备方法与流程

本发明属于组织工程血管领域，更具体地，涉及一种人造血管及其制备方法。

背景技术：

目前，自体血管如大隐静脉、乳内动脉是临床上用于冠状动脉搭桥手术和其他小口径血管搭桥手术最为主要的桥血管。目前美国食品药品监督管理局(FDA)批准进行临床试验的两个脱细胞基质管道小口径血管分别是：

(1)Nicolas L’Heureux等首次将不含人工合成材料的脱细胞基质组织工程血管应用于临床，大动物恒河猴腹主动脉移植实验6周通畅率为100％(n＝3)，动静脉瘘管I期临床实验1个月通畅率为78％(7/9)，6个月通畅率为60％(5/8)。Nicolas L’Heureux等虽然制备出自体脱细胞基质管道，但制备过程复杂，制备一根管道时间7-9月，花费1.5万美金，远期通畅率不理想，很难推广应用于临床。

(2)Laura Niklason等将人尸体血管平滑肌细胞体外种植于可降解聚乳酸(PGA)管上，然后于生物反应器中体外动态培养8周，PGA降解后形成富含细胞和细胞外基质(胶原纤维)的管状组织，最后脱细胞形成以胶原纤维为主要成分的组织工程血管(含少量残余PGA)，即同种异体脱细胞基质管道，大动物狒狒动静脉瘘管移植实验6个月通畅率100％(3/3)，FDA批准二期临床试验6月通畅率63％，12、18、24月通畅率分别是28％、18％、15％。由于是同种异体移植物存在移植免疫反应，并且制备过程复杂，制备时间至少2个月，易导致血栓形成、内膜增生，通畅率不佳，而且使用尸体血管平滑肌细胞有传播如艾滋病、乙型肝炎病毒等疾病风险。

上述两种脱细胞基质管道由于管壁结构致密，周围细胞不能进入管壁参与重构，管壁细胞外基质成分不能有效更新，特别不能合成维持动脉管壁弹性的弹力纤维，严重影响其机械性能和通畅率。

Charles Sparks,Gordon Campbell,Yasuhide Nakayama及Rotmans Joris等不同研究小组制备未脱细胞自体血管移植物回植体内动脉，存在力学性能薄弱、血栓形成、管壁细胞增生导致血管通畅率低，同时制备过程中使用对机体有毒性的生物材料，很难实现临床转化。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种人造血管及其制备方法，其目的在于通过将自体组织管道经过脱细胞以及共价结合肝素修饰，获得一种人造血管，由此解决现有技术的人造血管力学性能差、抗凝血功能薄弱以及免疫反应导致血管通畅率低的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种人造血管，包括由自体细胞外基质构成的管壁，所述管壁共价结合有抗凝分子。

优选地，所述抗凝分子为肝素，所述肝素含量为每毫克人造血管5～10微克。

优选地，所述人造血管管壁厚度为124.9～690.5微米，优选厚度为400～650微米。

优选地，所述管壁爆破压力为3157±216mmHg，缝合张力为3.94±0.46N，最大拉伸应力为2.41±0.22MPa，最大拉伸应变为30.63±2.74％。

按照本发明的另一个方面，提供了一种人造血管的制备方法，包括如下步骤：

(1)脱细胞处理：将自体组织管道采用3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸试剂化学脱细胞方法脱去管道的细胞成分，获取自体脱细胞基质管道；

(2)共价结合抗凝分子：将抗凝分子以共价结合的方式结合到步骤(1)获取的自体脱细胞基质管道的表面，获得人造血管。

优选地，所述步骤(1)包括如下步骤：

(1-1)脱细胞试剂的配置：将3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸、EDTA.Na2、NaCl、NaOH和无菌去离子水制备成500mL溶液，其摩尔浓度分别为6～10mmol/L、20～30mmol/L、0.10～0.15mmol/L和0.8～1.2mol/L，即为脱细胞试剂，其中3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸摩尔浓度优选为8mmol/L、EDTA.Na2摩尔浓度优选为25mmol/L、NaCl摩尔浓度优选为0.12mmol/L，NaOH摩尔浓度优选为1mol/L；

(1-2)脱细胞处理：将所述自体组织管道放入装有步骤(1-1)配置好的脱细胞试剂中，室温下处理2～3h，然后每2～3h更换一次所述脱细胞试剂，共更换4～6次，优选为5次，获取自体脱细胞基质管道。

优选地，所述步骤(2)包括如下步骤：

(2-1)肝素接枝试剂的配制

(a)采用0.5mol/L的MES缓冲液配制含30～50mg/ml EDC和10～30mg/ml的Sulfo-NHS溶液，得到A溶液；

(b)采用0.5mol/L的MES缓冲液配制40～80mg/ml的肝素溶液得到B溶液；

(c)将所述A溶液和B溶液等体积混合均匀，室温下孵育30～60分钟，然后用氢氧化钠溶液调节溶液pH值至7.0，最后用微过滤器过滤，得到清液为无菌肝素接枝试剂。

(2-2)将步骤(1)得到的自体脱细胞基质管道置于装有所述肝素接枝试剂的容器中，震荡处理3～5小时，即得到所述的人造血管。

优选地，所述步骤(2-1)肝素接枝试剂中EDC的浓度优选为40mg/ml，所述Sulfo-NHS的浓度优选为20mg/ml，所述肝素的浓度优选为60mg/ml。

优选地，所述步骤(2-1)中MES缓冲液的pH值为5.5。

优选地，所述步骤(2-1)中的(c)步骤的微过滤器孔径为0.2微米。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果。

(1)本发明利用异物反应原理，将无毒、体内不降解的Teflon管置于皮下制备得到自体组织管道，并以其为原料制备得到本发明的人造血管，组织结构及力学性能接近正常动脉，用于自体血管替代物时不用考虑免疫排斥反应，而且无传播如艾滋病、乙型肝炎病毒等疾病风险。

(2)本发明采用的CHAPS+EDTA脱细胞方法相对温和且对细胞外基质的结构和力学性能保存较好，脱细胞效果好，通过脱细胞处理使得自体脱细胞基质管壁结构允许周围细胞进入管壁参与管壁重构，有效合成弹力纤维和胶原纤维，提高体内重构后力学性能和通畅率，并接近正常自体动脉结构及力学性能。

(3)本发明采用Sulfo-NHS/EDC介导的肝素共价结合组织工程血管在体内没有细胞毒性，具有良好的生物相容性，良好的抗凝血功能，通畅率高。

(4)本发明的人造血管制备周期短、费用低，并可制备成不同内径，完全优于以往脱细胞基质管道，具有很好的临床应用前景。

附图说明

图1是实施例4所述的脱细胞前后自体组织管道爆破压力检测结果；

图2是实施例4所述的脱细胞前后自体组织管道缝线抗拉强度检测结果；

图3是实施例4所述的脱细胞前后自体组织管道最大拉伸应力检测结果；

图4是实施例4所述的脱细胞前后自体组织管道最大拉伸应变检测结果；

图5是实施例5所述的人造血管移植术后1个月超声检查结果，A为人造血管移植侧颈动脉，B为对侧正常颈动脉；

图6是实施例5所述的人造血管移植术后2个月超声检查结果，A为人造血管移植侧颈动脉，B为对侧正常颈动脉；

图7是实施例5所述的人造血管移植术后1个月CT血管造影检查结果；

图8是实施例6所述的脱细胞前后自体组织管道切片后进行DAPI染色结果，A为脱细胞前，B为脱细胞后；

图9是实施例6所述的脱细胞前后的自体组织管道标本DNA定量检测结果；

图10是实施例7所述的甲苯胺蓝对接枝肝素的脱细胞基质管道进行肝素接枝的定性以及稳定性检测，A为共价结合肝素的完整自体组织管道，B为共价结合肝素的纵向剖开的自体组织管道。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明利用异物反应原理，将无毒、体内不降解的Teflon管置于皮下组织，使之形成管状组织。然后对管状组织进行脱细胞和肝素化修饰处理后，获得自体细胞外基质管道，即本发明所述的人造血管，具体方案分为下面几步：

(A)将管状Teflon(外径1/16英寸，约1.59mm)，置于皮下组织2～5周后取出，对获得的自体组织管道进行力学性能检测和组织学检测，其中4、5周自体组织管道具有最佳力学性能和组织学结构组，为节省制备时间，采用4周自体管道进行脱细胞和共价结合肝素处理。

(B)采用化学脱细胞方法(CHAPS试剂)，脱去自体组织管道细胞成分，获取自体脱细胞基质管道。

(C)采用Sulfo-NHS/EDC将肝素共价结合到自体脱细胞基质管道，获得具有抗凝血活性的自体细胞外基质管道，此即所述的人造血管。

本发明的人造血管制备方法具体步骤如下：

(1)自体组织管道的制备

将直径与需要替代的血管内径相匹配的特氟龙(Teflon)管裁剪至合适长度，75％酒精消毒30分钟，置于皮下组织，2～5周后取出，优选4周将皮下Teflon管连同包绕新生组织取出，抽除Teflon管，获得自体组织管道。4周对应的自体组织管道以及最终的人造血管产品厚度最合适，对应的人造血管产品性能最佳。

(2)脱细胞处理

(2-1)脱细胞试剂的配置：将3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(简称CHAPS试剂)、EDTA.Na2、NaCl、NaOH和无菌去离子水制备成500mL溶液，其摩尔浓度分别为6～10mmol/L、20～30mmol/L、0.10～0.15mmol/L和0.8～1.2mol/L，即为脱细胞试剂，其中CHAPS试剂摩尔浓度优选为8mmol/L，EDTA.Na2的摩尔浓度优选为25mmol/L，NaCl的摩尔浓度优选为0.12mmol/L、NaOH的摩尔浓度优选为1mol/L；

(2-2)脱细胞处理：将所述自体组织管道放入装有步骤(1-1)配置好的脱细胞试剂中，室温下处理2～3h，然后每2～3h更换一次所述脱细胞试剂，共更换4～6次，优选5次，获取自体脱细胞基质管道。

(2-3)洗涤步骤：将步骤(1-2)获取的自体脱细胞基质管道采用无菌PBS溶液充分洗涤，以洗脱残余的脱细胞试剂。

(3)共价结合抗凝分子，本发明中抗凝分子优选肝素：

(3-1)肝素接枝试剂的配置

(a)采用0.5mol/L的MES缓冲液(pH值为5.5)配制含30～50mg/ml EDC(碳二亚胺)和10～30mg/ml的Sulfo-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液，得到A溶液，其中EDC的浓度优选为40mg/ml，Sulfo-NHS的浓度优选为20mg/ml；

(b)采用0.5mol/L的MES缓冲液配制40～80mg/ml的肝素溶液得到B溶液，肝素浓度优选为60mg/ml；

(c)将所述A溶液和B溶液等体积混合均匀，室温下孵育30～60分钟，然后用氢氧化钠溶液调节溶液pH值至7.0，最后用0.2微米的微过滤器过滤，得到清液为无菌肝素接枝试剂。

(3-2)将步骤(1)得到的自体脱细胞基质管道置于装有所述肝素接枝试剂的容器中，震荡处理3～5小时，即得到所述的人造血管。

CHAPS是一种两性离子去垢剂，同时具有非离子型和离子型去垢剂的性能，包括破坏脂-脂、脂-蛋白相互作用或者溶解包浆及细胞核，其去细胞作用较为温和，对细胞外基质结构破坏性小，EDTA是一种调节渗透性的试剂，通过改变浓度，可以配置成低渗或者高渗性溶液，其作用主要是导致细胞裂解，并不能去除细胞或者细胞成分，本实验所用的脱细胞材料为通过异物反应原理制备的自体组织管道，组织结构及力学性能较正常动脉血管接近，且其目的是用于自体血管替代物，不用考虑免疫排斥反应，CHAPS+EDTA脱细胞方法相对温和且对细胞外基质的结构和力学性能保存较好。

Sulfo-NHS/EDC可以将肝素上的羧基激活成为琥珀酰亚胺酯，琥珀酰亚胺酯然后与胶原蛋白表面的氨基发生共价结合，最终将肝素依靠共价键锚定在胶原表面。Sulfo-NHS/EDC介导的肝素共价结合组织工程血管在体内是没有细胞毒性，且具有良好的生物相容性。

以下为实施例：

实施例1

(1)自体组织管道的制备

将直径与需要替代的血管内径相匹配的特氟龙(Teflon)管裁剪至合适长度，75％酒精消毒30分钟，置于皮下组织，4周后将皮下Teflon管连同包绕新生组织取出，抽除Teflon管，获得自体组织管道，其厚度为324.1±57.4微米(n＝6，n为检测样本的个数，以下n的含义相同)。

(2)脱细胞处理

(2-1)脱细胞试剂的配置

按照上表的配方，将精准称量的试剂加入干净的广口玻璃瓶中，摇床上振荡2～3h，使试剂充分溶解，此时溶液变澄清，制备成脱细胞试剂，于4℃保存备用。

(2-2)自体组织管道脱细胞

将自体组织管道放入无菌离心管中，每管加入10ml配置好的3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸溶液，置于摇床上，室温处理3h，然后每3h更换一次3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸溶液，共5次。脱细胞完成后，换用无菌PBS溶液10ml，放置于摇床上，洗涤30min，依法重复洗涤5遍，以洗脱残余3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸试剂，避免细胞毒性。最后将处理好的脱细胞管道置入生理盐水4℃保存备用。

(3)共价结合肝素

(3-1)共价结合肝素试剂

A溶液配方

A溶液配置：将a液配方中的试剂按量加入干净50ml离心管中，振荡混匀，避光，4℃过夜。

B溶液配置：先将20ml MES-buffer加入50ml干净离心管中，然后缓慢将称量好的肝素加入离心管中，一边加入一边晃动，最后置于摇床上过夜，以使肝素充分溶解。

肝素接枝试剂配置：翌日，将a、b液等体积混合，室温孵育30min，用1M NaOH溶液调节PH至7，最后用0.2微米过滤器过滤，置于50ml无菌离心管中，避光4℃保存备用。

(3-2)共价结合肝素

将脱细胞处理好的自体脱细胞基质管道放置于编号的6孔板中，每孔样本加入配置好的肝素接枝试剂5ml，摇床、避光、5h，即得到本发明所述的人造血管，其厚度为525±125微米(n＝6)，完成后置于生理盐水溶液中4℃保存备用。体外细胞毒性试验检测证实无细胞毒性。实施例1为优选实施例。

实施例2

(1)自体组织管道的制备

将直径与需要替代的血管内径相匹配的特氟龙(Teflon)管裁剪至合适长度，75％酒精消毒30分钟，置于皮下组织，2周后将皮下Teflon管连同包绕新生组织取出，抽除Teflon管，获得自体组织管道，其厚度为154.3±56.4微米(n＝6)。

(2)脱细胞处理

(2-1)脱细胞试剂的配置

按照上表的配方，将精准称量的试剂加入干净的广口玻璃瓶中，摇床上振荡2～3h，使试剂充分溶解，此时溶液变澄清，制备成脱细胞试剂，于4℃保存备用。

(2-2)自体组织管道脱细胞

将自体组织管道放入无菌离心管中，每管加入10ml配置好的3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸溶液，置于摇床上，室温处理2h，然后每2h更换一次3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸溶液，共5次。脱细胞完成后，换用无菌PBS溶液10ml，放置于摇床上，洗涤30min，依法重复洗涤5遍，以洗脱残余3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸试剂，避免细胞毒性。最后将处理好的脱细胞管道置入生理盐水4℃保存备用。

(3)共价结合肝素

(3-1)共价结合肝素试剂

A溶液配方

A溶液配置：将a液配方中的试剂按量加入干净50ml离心管中，振荡混匀，避光，4℃过夜。

B溶液配置：先将20ml MES-buffer加入50ml干净离心管中，然后缓慢将称量好的肝素加入离心管中，一边加入一边晃动，最后置于摇床上过夜，以使肝素充分溶解。

肝素接枝试剂配置：翌日，将a、b液等体积混合，室温孵育50min，用1M NaOH溶液调节PH至7，最后用0.2微米过滤器过滤，置于50ml无菌离心管中，避光4℃保存备用。

(3-2)共价结合肝素

将脱细胞处理好的自体脱细胞基质管道放置于编号的6孔板中，每孔样本加入配置好的肝素接枝试剂5ml，摇床、避光、3h，即得到本发明所述的人造血管，其厚度为249.9±125微米(n＝6)，完成后置于生理盐水溶液中4℃保存备用。体外细胞毒性试验检测证实无细胞毒性。

实施例3

(1)自体组织管道的制备

将直径与需要替代的血管内径相匹配的特氟龙(Teflon)管裁剪至合适长度，75％酒精消毒30分钟，置于皮下组织，5周后将皮下Teflon管连同包绕新生组织取出，抽除Teflon管，获得自体组织管道，其厚度为352.1±43.2微米(n＝6)。

(2)脱细胞处理

(2-1)脱细胞试剂的配置

按照上表的配方，将精准称量的试剂加入干净的广口玻璃瓶中，摇床上振荡2～3h，使试剂充分溶解，此时溶液变澄清，制备成脱细胞试剂，于4℃保存备用。

(2-2)自体组织管道脱细胞

将自体组织管道放入无菌离心管中，每管加入10ml配置好的3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸溶液，置于摇床上，室温处理2.5h，然后每2.5h更换一次3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸溶液，共5次。脱细胞完成后，换用无菌PBS溶液10ml，放置于摇床上，洗涤30min，依法重复洗涤5遍，以洗脱残余3-[(3－胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸试剂，避免细胞毒性。最后将处理好的脱细胞管道置入生理盐水4℃保存备用。

(3)共价结合肝素

(3-1)共价结合肝素试剂

A溶液配方

A溶液配置：将a液配方中的试剂按量加入干净50ml离心管中，振荡混匀，避光，4℃过夜。

B溶液配置：先将20ml MES-buffer加入50ml干净离心管中，然后缓慢将称量好的肝素加入离心管中，一边加入一边晃动，最后置于摇床上过夜，以使肝素充分溶解。

肝素接枝试剂配置：翌日，将a、b液等体积混合，室温孵育60min，用1M NaOH溶液调节PH至7，最后用0.2微米过滤器过滤，置于50ml无菌离心管中，避光4℃保存备用。

(3-2)共价结合肝素

将脱细胞处理好的自体脱细胞基质管道放置于编号的6孔板中，每孔样本加入配置好的肝素接枝试剂5ml，摇床、避光、4h，即得到所述的人造血管，其厚度为570.5±120微米(n＝6)，完成后置于生理盐水溶液中4℃保存备用。体外细胞毒性试验检测证实无细胞毒性。

实施例4

将实施例1所述的进行脱细胞处理后的自体组织管道(自体细胞外基质管道)与未脱细胞处理的自体组织管道分别进行爆破压力、缝线抗拉强度以及最大拉伸应力和最大拉伸应变分别进行检测和比较，检测结果表明两种自体组织管道各项测试测量值的差异均不具有统计学意义，说明本发明对自体组织管道的脱细胞处理对自体组织管道的力学性能影响不大，具体测试方法及结果如下：

(1)爆破压力(Burst pressure)检测

爆破压力由自制的、带有精密压力表的测压系统完成。测压系统中填满PBS缓冲液，将长度为5cm的待测组织管道连接于测压系统，用7号丝线固定，缓慢增加测压系统内的压力，直至压力骤降，自体细胞外基质管道出现破口，记录下最大压力值，此值即为爆破压力。

未脱细胞自体组织管道爆破压为3696±194mmHg(n＝6),脱细胞后爆破压为3157±216mmHg(n＝6)，P＞0.05，差异不具有统计学意义。(图1)

(2)缝线抗拉强度(Suture retention strength)检测

缝线抗拉强度(Suture retention strength)是指缝线将组织撕裂时的力，此处依照ANSI/AAMI/ISO 7198标准进行测定。准备2cm长的待测组织管道，将6-0Prolene线缝于管道的一端，边距为2mm，间隔120度角另缝一根，总共缝3针，将每根缝线单独打结形成一个环，将管道的无缝线端和其中1根缝线分别固定在万能拉力试验机上，调节拉伸速度为50mm/min，记录下最大拉力，依次固定另外2根缝线进行测试，将3次测试结果取平均值所得结果即为缝线抗拉强度。

未脱细胞自体组织管道缝合张力为4.97±0.55N(n＝6)，脱细胞后缝合张力为3.94±0.46N(n＝6)，P＞0.05，差异不具有统计学意义。(图2)

(3)最大拉伸应力(Ultimate tensile strength，UTS)和最大拉伸应变(ultimate strain)

将待测组织管道切成5mm宽的圆环，测定并记录其厚度和直径。将其两端挂在回型针上，然后将2根回型针固定在万能拉伸试验机上，初始拉伸长度为拉断长度的10％左右，调节拉伸速度为50mm/min，最大拉伸应力和最大拉伸应变分别为圆环被拉断时的最大应力和应变。

未脱细胞自体组织管道最大拉伸应力为3.16±0.30MPa(n＝6),脱细胞后最大拉伸应力为2.41±0.22MPa(n＝6)，P＞0.05，差异不具有统计学意义。(图3)

未脱细胞自体组织管道最大拉伸应变为24.33±2.15％(n＝6),脱细胞后最大拉伸应变为30.63±2.74％(n＝6)，P＞0.05，差异不具有统计学意义。(图4)

实施例5

将实施例1制备得到的人造血管对小型猪进行自体血管移植实验，实验总共完成8只小型猪自体血管移植物移植，其中5只随访1个月，另外3只随访2个月，处死前行超声检查，1个月随访终点处死前另外行CTA检查，超声检查血管通畅性，1个月时通畅率为100％(5/5)，2个月时通畅率为67％(2/3)。

(1)小型猪颈总动脉移植实验:移植术后1个月超声示血管移植物段无血栓形成，内膜光滑、无粥样斑块、无明显内膜增生。(图5，其中A为移植血管超声，B为对侧正常血管超声)

(2)小型猪颈总动脉移植实验：移植术后2个月超声示血管移植物段无血栓形成，内膜光滑，彩色多普勒示血管移植物血流通畅。(图6，其中A为移植血管超声，B为对侧正常血管超声)

CT血管造影发现血管移植物通畅，无狭窄及瘤样变，与正常小型猪颈总动脉匹配较好。(图7，箭头所指处为吻合口)

实施例6

将脱细胞前后的实施例1制备的自体组织管道切片后进行DAPI染色(图8，A为脱细胞前，B为脱细胞后)，蓝色荧光代表细胞核，脱细胞前自体组织管道可以观察到很多细胞核，脱细胞后自体组织管道没有检测到蓝色荧光存在，细胞核染色阴性，证明管壁细胞脱除完全。

对脱细胞前后的自体组织管道标本进行DNA定量检测，脱细胞前标本DNA含量为0.081±0.010μg/㎎(n＝6)，脱细胞后标本DNA含量为0.011±0.003μg/㎎(n＝6)，P＜0.05，其差异具有统计学意义。(图9)

实施例7

利用甲苯胺蓝对实施例1中接枝肝素的脱细胞基质管道进行肝素接枝的定性以及稳定性检测(图10，A为共价结合肝素的完整自体组织管道，B为共价结合肝素的纵向剖开的自体组织管道)，图示A、B左侧为肝素结合定性检测结果，自体脱细胞基质管道管呈现特异性蓝色，表示肝素成功地结合在自体脱细胞基质管道上，图10A、B右侧为肝素结合稳定性检测，即将图10A和B左侧的接枝肝素的自体组织管道在37摄氏度水浴的摇床洗脱12小时，以检测肝素接枝的稳定性。自体脱细胞基质管道管颜色比左侧稍浅但未消失，表示经过水浴洗脱后，少部分未稳定结合的肝素被洗脱掉，大部分肝素与自体脱细胞基质管道结合稳定，未被洗脱。肝素结合定量检测结果:单位质量自体脱细胞基质管道共价结合肝素质量为8.2±0.9μg/mg(n＝6)。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。