黄芪甲苷在预防和治疗2型糖尿病肾病中的应用的制作方法

本发明涉及黄芪甲苷的新应用，更具体的说，涉及黄芪甲苷在制备预防和治疗2型糖尿病肾病药物中的应用。

背景技术：

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的重要并发症，并逐渐成为慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)的主要致病因素。Akt及其相关信号通路(mTOR,NFκB和Erk1/2)的功能紊乱在DN的进展中起到重要作用。

黄芪甲苷(Astragaloside IV，AS-IV)是从中药黄芪提取出来的有效单体化合物，能增强机体免疫力、提高机体的抗病能力。中国CN 1569884A号发明专利公开了一种黄芪甲苷的制法及在制备防治糖尿病肾病药物中的应用，通过腹腔注射高剂量链脲霉素(STZ)的方式构造1型糖尿病肾病大鼠模型，并通过灌胃给药黄芪甲苷的治疗实验，证明黄芪甲苷对1型DN具有一定的保护作用，然而，对于2型DN尚未有研究报道。1型糖尿病肾病为胰岛素依赖性糖尿病，2型糖尿病肾病为非胰岛素依赖性糖尿病，二者在发病机制、诊断及治疗策略上有本质的不同。

技术实现要素：

本发明基于黄芪甲苷对于2型DN的研究，发现黄芪甲苷对2型DN具有较强的防治作用，本发明的目的在于提供一种黄芪甲苷在制备预防和治疗2型糖尿病肾病药物中的应用。

本发明为了达到上述目的，提供如下技术方案：

1、研究AS-IV治疗对db/db小鼠尿白蛋白排泄率的影响；

2、研究AS-IV治疗对db/db小鼠生理及代谢指标的影响；

3、研究AS-IV治疗对db/db小鼠改善肾小球损伤的影响；

4、研究AS-IV治疗对db/db小鼠改善肾小管损伤的影响；

5、研究AS-IV治疗对db/db小鼠Akt及其相关信号通路的影响；

6、研究AS-IV治疗对db/db小鼠肝功能的影响；

实施本发明，具有如下有益效果：本发明旨在探讨黄芪甲苷对2型DN的保护作用及其作用机制，结果显示：黄芪甲苷可减少2型糖尿病db/db小鼠的尿白蛋白排泄率，改善肾小球及肾小管病理损伤，减少尿液NAG,NGAL和TGF-β1的排泄，黄芪甲苷亦能抑制Akt/mTOR、NFκB、Erk1/2信号通路的活化，并没有表现明显的肝毒性。根据上述研究可以得出结论：黄芪甲苷对2型DN具有一定的保护作用，其作用机制与抑制Akt/mTOR、NFκB、Erk1/2信号通路有关。使用现有的制备工艺将黄芪甲苷制成口服给药剂型、注射给药剂型、粘膜给药剂型或者经皮给药剂型的药物，或者片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、贴剂或者凝胶剂的药物，可以用于预防和治疗2型糖尿病肾病。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为黄芪甲苷对小鼠的尿白蛋白排泄率的影响结果，图1(a)为黄芪甲苷对小鼠的尿白蛋白排泄率的影响结果，图1(b)为黄芪甲苷对小鼠肌酐清除率的影响结果；其中，与wild type组比较，*P<0.05，***P<0.001；与db/db组比较，^﹟P<0.05，^﹟﹟﹟P<0.001；

图2为黄芪甲苷对小鼠代谢指标的影响结果，图2(a)为黄芪甲苷对小鼠血糖的影响结果，图2(b)为黄芪甲苷对小鼠糖化血红蛋白的影响结果，图2(c)为黄芪甲苷对小鼠尿糖的影响结果，图2(d)为黄芪甲苷对小鼠血清胰岛素的影响结果；其中，与wild type组比较，**P<0.01，***P<0.001；

图3为黄芪甲苷对小鼠生理指标的影响结果，图3(a)为黄芪甲苷对小鼠体重的影响结果，图3(b)为黄芪甲苷对小鼠肾重的影响结果；其中，与wild type组比较，***P<0.001；

图4为黄芪甲苷对小鼠肾小球损伤的影响结果，图4(a)为黄芪甲苷对小鼠肾小球血管襻面积的影响结果，图4(b)为黄芪甲苷对小鼠肾小球血管襻体积的影响结果，图4(c)为黄芪甲苷对小鼠肾小球基底膜厚度的影响结果，图4(d)为黄芪甲苷对小鼠足突宽度的影响结果，图4(e)为PAS染色及电镜显示黄芪甲苷对小鼠肾小球的影响结果；其中，与wild type组比较，**P<0.01，***P<0.001；与db/db组比较，^﹟P<0.05，^﹟﹟﹟P<0.001；

图5为黄芪甲苷对小鼠肾小球系膜基质比例及纤维连结蛋白含量的影响结果，图5(a)为黄芪甲苷对小鼠肾小球系膜基质比例的影响结果，图5(b)为黄芪甲苷对小鼠纤维连接蛋白(fibronectin)水平的影响结果，图5(c)为免疫印迹实验显示黄芪甲苷对小鼠肾组织纤维连接蛋白的影响结果，图5(d)为免疫组织化学染色显示黄芪甲苷对小鼠纤维连接蛋白表达的影响结果；其中，与wild type组比较，*P<0.05，***P<0.001；

图6为黄芪甲苷对小鼠肾小管损伤的影响结果，图6(a)为黄芪甲苷对小鼠尿液NAG的影响结果，图6(b)为黄芪甲苷对小鼠尿液NGAL的影响结果，图6(c)为黄芪甲苷对小鼠尿液TGF-β1的影响结果，图6(d)为黄芪甲苷对小鼠近端肾小管面积的影响结果，图6(e)为黄芪甲苷对小鼠近端肾小管管腔面积的影响结果，图6(f)为黄芪甲苷对小鼠近端肾小管管壁面积的影响结果，图6(g)为黄芪甲苷对小鼠肾小管基底膜厚度的影响结果，图6(h)为PAS染色及电镜显示黄芪甲苷对小鼠肾小管的影响结果；其中，与wild type组比较，**P<0.01，***P<0.001；与db/db组比较，^﹟P<0.05，^﹟﹟P<0.01；

图7为黄芪甲苷对小鼠肾组织Akt及其相关信号通路的影响结果，图7(a)为免疫印迹实验显示黄芪甲苷对Akt及其相关信号通路蛋白的影响结果，图7(b)为黄芪甲苷对小鼠p-Akt的影响结果，图7(c)为黄芪甲苷对小鼠p-mTOR的影响结果，图7(d)为黄芪甲苷对小鼠p-NF-κB p65的影响结果，图7(e)为黄芪甲苷对小鼠p-Erk1/2的影响结果；其中，与wild type组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与db/db组比较，^﹟P<0.05，^﹟﹟P<0.01；

图8为黄芪甲苷对小鼠肝功能的影响结果，图8(a)为黄芪甲苷对血清谷丙转氨酶(ALT)的影响结果，图8(b)为黄芪甲苷对小鼠血清谷草转氨酶(AST)的影响结果；其中，与wild type组比较，**P<0.01。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的实施例进行具体描述。

早期DN主要表现为肾小球高滤过和微量白蛋白尿，其病理变化主要为肾小球、肾小管基底膜增厚及系膜扩张。DN发病尚不明确，治疗手段匮乏。Akt及其相关信号通路(mTOR,NFκB和Erk1/2)在细胞的生长和增殖中起到重要作用，Akt信号通路失调在人类癌症、糖尿病、心血管及神经系统疾病中也起到重要作用。最近研究显示Akt过度激活与DN进展密切相关，斯达汀、曲格列酮、雷帕霉素或者西罗莫司可通过抑制Akt及其相关信号通路过度激活起到对DN的肾脏保护作用。黄芪甲苷是黄芪的主要有效成分，属于皂甙类化合物，分子量为784.97kDa，具有抗炎、抗病毒、抗癌等作用。AS-IV主要用于心脏、肝脏及神经系统，其作用机制与抑制Akt及其相关信号通路有关。现有的研究表明AS-IV对1型DN小鼠具有一定的肾脏保护作用，然而对于2型DN尚未有研究报道，其所应用的1型DN动物模型与本发明中使用的2型DN模型在发病机制上有本质的区别。

本发明旨在观察AS-IV对2型DN肾病的保护作用及其对Akt相关信号通路的影响。

一、实验方法

1、动物模型：八周龄雄性野生型小鼠(wild type)和db/db小鼠(BKS.Cg-Dock7^m+/+Lepr^db/JNju)，购买于南京大学模式动物研究中心。动物研究实验严格按照广州中医药大学动物伦理相关准则和条例进行。实验动物受控在恒定室温20±1℃，12小时光照和12小时黑暗循环的条件下，同时自由摄食和饮水。实验小鼠随机分配到以下几组(每组8-10只)：正常对照小鼠喂养常规食物(野生型小鼠作为正常组，即本发明图表中wild type组)、db/db小鼠喂养常规食物(db/db组)、db/db小鼠喂养添加AS-IV的食物(db/db+AS-IV组)。AS-IV购买于成都ConBon生物科技有限公司(中国)，以1g/kg标准比例添加到小鼠的食物中。以上实验处理持续12周。

2、生理和代谢参数：每两周称量小鼠体重，采用血糖仪(罗氏公司，巴塞尔，瑞士)测量各组小鼠的血糖，并用代谢笼(泰尼百斯，意大利)收集尿液。通过12周处理后，处死小鼠，并采集血样和肾脏组织样本。使用Ultra2糖化血红蛋白分析仪测量糖化血红蛋白(HbA_1C)的含量。采用罗氏全自动生化分析仪测量尿液和血液的生化指标，包括尿肌酐、葡萄糖、NAG(尿N-乙酰-β-葡萄糖苷酶)，血肌酐、ALT、AST。肌酐清除率(Ccr)是通过尿肌酐×尿液体积×1000/血肌酐/1440计算得出，并用微升/每分钟表示。

3、组织准备：处死小鼠后，立即取出肾脏，称重，在磷酸盐缓冲液中冲洗，沿纵切面切取一定量肾脏组织用10％福尔马林固定，并按照组织病理学和免疫组化的方法进行研究。取1立方毫米的肾皮质组织固定在2.5％戊二醛溶液中，随后采用1％锇酸处理，在电子显微镜下进行分析。剩余的肾脏组织立即在液氮中冷冻并储存在-80℃用于后续实验研究。

4、光镜：石蜡切片(4微米厚)采用PAS染色法用来评价肾小球和肾小管的病理损伤情况。使用4.10版本的NIS-Elements图像处理软件(尼康公司，日本东京)进行图片处理分析，每个切片测量40-50肾小球血管襻面积(glomerular tuft area，GTA)，20-30肾小球系膜基质面积，80-100肾小管和肾小管管腔面积(长短轴比小于1.5)。通过威贝尔(Weibel)发明的方法测量肾小球血管襻体积(glomerular tuft volume，GTV)，这种测量方法仅需肾小球的随机横截面积的平均值并按照以下的公式计算：V_G＝Area^1.5×β/K，其中V_G是指肾小球体积，β＝1.38，和K(分配系数)设定为1.10。肾小管管壁面积等于肾小管面积减去肾小管管腔面积。

5、免疫组化：肾组织石蜡切片(4微米厚)，脱蜡，水化，将切片放入煮沸的10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6)中20分钟进行抗原修复，后冷却至常温。通过3％过氧化氢处理10分钟后，用山羊血清对切片进行封闭处理30分钟，随后加入纤维连接蛋白一抗在4℃孵育过夜(ab2413，1：200，Abcam公司，英国剑桥)。缓冲液冲洗切片后，再加入HRP-聚合物偶联的抗鼠/兔的lgG二抗(中国福州迈新生物技术开发有限公司)在室温孵育15分钟，使用二氨基联苯胺盐酸盐溶液作为显示试剂，测定过氧化物酶活力。

6、ELISA：按照厂家说明书进行ELISA实验，检测血清胰岛素(德国默克公司)、尿白蛋白(美国Bethyl公司)、尿TGF-β1(达科为，中国深圳)和尿NGAL(美国R&Dsystem公司)的含量。

7、免疫印迹实验(Western blot)：将冷冻的肾皮质组织在裂解缓冲液中匀浆，平衡总蛋白浓度后通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，并将蛋白转移到PVDF膜上，将PVDF膜放入用含0.5g/l脱脂奶粉的TBST缓冲液中，室温反应1小时，封闭膜上的非特异性位点，然后加入一抗，在4℃摇晃孵育过夜。洗涤后，采用ChemiDoc^TMMP成像系统(美国Bio-Rad公司)对蛋白条带进行检测和分析，结果使用β-actin作为内参进行比较。p-Akt(#4060)抗体,p-mTOR(#5536)抗体,p-NF-κB p65(#3033)抗体和p-Erk1/2(#4370)抗体均购于美国CST公司；β-actin抗体(A2228)购于美国西格玛公司；纤维连接蛋白抗体(ab2413)购于英国Abcam公司。

8、统计分析

计量资料使用平均值±标准差表示。两组样本间的统计差异采用独立样本t检验进行分析，多组样本之间的比较使用单因素方差分析，统计分析采用SPSS 16.0统计软件处理。P<0.05时视为在统计学上具有显著性差异。

二、结果

1、AS-IV可减少db/db小鼠白蛋白尿的排泄率，对肾小球高滤过没有改善作用

图1为黄芪甲苷对小鼠的尿白蛋白排泄率的影响结果，图1(a)为黄芪甲苷对小鼠的尿白蛋白排泄率的影响结果，图1(b)为黄芪甲苷对小鼠肌酐清除率的影响结果；与wild type组小鼠比较，db/db组小鼠尿白蛋白明显升高并逐渐增加，12周时，db/db小鼠肾小球滤过率明显升高。AS-IV干预8周后，db/db+AS-IV组小鼠白蛋白排泄率明显降低，该效果维持至12周。但是，经过12周干预后，肾小球滤过率并没有明显下降。

2、生理及代谢指标变化

表1示出了各组小鼠的新陈代谢特征，如表1所示，与wild type组小鼠相比，db/db组小鼠8周时显示多饮多尿多便症状，AS-IV干预后这些症状明显改善；图2为黄芪甲苷对小鼠代谢指标的影响结果，图2(a)为黄芪甲苷对小鼠血糖的影响结果，图2(b)为黄芪甲苷对小鼠糖化血红蛋白的影响结果，图2(c)为黄芪甲苷对小鼠尿糖的影响结果，图2(d)为黄芪甲苷对小鼠血清胰岛素的影响结果；0,2,4,6,8,10,12周时db/db小鼠血糖明显升高，12周时糖化血红蛋白也明显升高。尿糖、血清胰岛素水平12周时也明显升高。AS-IV治疗对血糖、糖化血红蛋白、尿糖、血清胰岛素无明显影响。

表1新陈代谢特征(n＝8每组)

与wild type组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；与db/db组比较，^﹟P<0.05,^﹟﹟P<0.01。

图3为黄芪甲苷对小鼠生理指标的影响结果，图3(a)为黄芪甲苷对小鼠体重的影响结果，图3(b)为黄芪甲苷对小鼠肾重的影响结果；与wild type组小鼠相比，db/db组小鼠体重和肾重明显增大，AS-IV治疗可以减轻体重和肾重，但并未显示出统计学差异。

3、AS-IV可改善肾小球损伤

图4为黄芪甲苷对小鼠肾小球损伤的影响结果，图4(a)为黄芪甲苷对小鼠肾小球血管襻面积的影响结果，图4(b)为黄芪甲苷对小鼠肾小球血管襻体积的影响结果，图4(c)为黄芪甲苷对小鼠肾小球基底膜厚度的影响结果，图4(d)为黄芪甲苷对小鼠足突宽度的影响结果，图4(e)为PAS染色及电镜显示黄芪甲苷对小鼠肾小球的影响结果；12周时，db/db小鼠肾小球血管襻面积和体积增大，肾小球基底膜增厚，足突变宽。AS-IV干预可改善这些变化。PAS染色及电镜显示各组变化特点。

图5为黄芪甲苷对小鼠肾小球系膜基质比例及纤维连结蛋白含量的影响结果，图5(a)为黄芪甲苷对小鼠肾小球系膜基质比例的影响结果，图5(b)为黄芪甲苷对小鼠肾组织纤维连接蛋白水平的影响结果，图5(c)为免疫印迹实验显示黄芪甲苷对小鼠肾组织纤维连接蛋白的影响结果，图5(d)为免疫组织化学染色显示黄芪甲苷对小鼠纤维连接蛋白表达的影响结果；与wild type组比较，db/db组肾小球系膜基质比例及纤维连接蛋白表达均明显增多，AS-IV干预可减少这些改变，但并未显示出统计学差异。

4、AS-IV改善肾小管损伤

图6为黄芪甲苷对小鼠肾小管损伤的影响结果，图6(a)为黄芪甲苷对小鼠尿液NAG的影响结果，图6(b)为黄芪甲苷对小鼠尿液NGAL的影响结果，图6(c)为黄芪甲苷对小鼠尿液TGF-β1的影响结果，图6(d)为黄芪甲苷对小鼠近端肾小管面积的影响结果，图6(e)为黄芪甲苷对小鼠近端肾小管管腔面积的影响结果，图6(f)为黄芪甲苷对小鼠近端肾小管管壁面积的影响结果，图6(g)为黄芪甲苷对小鼠肾小管基底膜厚度的影响结果，图6(h)为PAS染色及电镜显示黄芪甲苷对小鼠肾小管的影响结果；12周时，与wild type组比较，db/db组NAG、NGAL、TGF-β1排泄均明显增高，近端肾小管、管腔及管壁面积增大，肾小管基底膜明显增厚。AS-IV治疗可明显减少NAG、NGAL、TGF-β1排泄，减小肾小管、管腔及管壁面积，减小基底膜厚度。

5、AS-IV抑制p-Akt(Ser473),p-mTOR(Ser2448),p-NF-κB p65(Ser536)和p-Erk1/2(Thr202/Tyr204)的活化

图7为黄芪甲苷对小鼠肾组织Akt及其相关信号通路的影响结果，图7(a)为免疫印迹实验显示黄芪甲苷对Akt及其相关信号通路蛋白的影响结果，图7(b)为黄芪甲苷对小鼠p-Akt的影响结果，图7(c)为黄芪甲苷对小鼠p-mTOR的影响结果，图7(d)为黄芪甲苷对小鼠p-NF-κB p65的影响结果，图7(e)为黄芪甲苷对小鼠p-Erk1/2的影响结果；12周时，db/db小鼠肾皮质p-Akt(Ser473)、p-mTOR(Ser2448)、p-NF-κB p65(Ser536)和p-Erk1/2(Thr202/Tyr204)含量明显增加，AS-IV干预可明显减少这些蛋白水平。

6、AS-IV干预12周后未显示明显肝毒性

图8为黄芪甲苷对小鼠肝功能的影响结果，图8(a)为黄芪甲苷对ALT的影响结果，图8(b)为黄芪甲苷对小鼠AST的影响结果；12周时，db/db小鼠血生化显示ALT、AST明显升高，db/db+AS-IV组与db/db组无明显差别。

上述实验结果表明，黄芪甲苷作为中药黄芪的主要活性成分，可减少2型糖尿病db/db小鼠的尿白蛋白排泄率，改善肾小球及肾小管病理损伤，减少尿液NAG、NGAL和TGF-β1的排泄。黄芪甲苷亦能抑制Akt/mTOR、NFκB和Erk1/2信号通路的活化，并没有表现明显的肝毒性。综上，黄芪甲苷对2型DN具有一定的保护作用，其作用机制与抑制Akt及其相关信号通路有关。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。