本发明涉及生物医药领域，更具体的说是涉及一种A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法。
背景技术：
流行性脑脊髓膜炎(简称流脑，下同)是一种由奈瑟氏脑膜炎球菌(Neisseriameningitidis)引起的急性呼吸道传染病。一百多年来，一直在世界各地流行或散在发生，感染病原菌后可引起败血症、脑膜炎。易感人群主要为儿童，以暴发型病死率最高，可达40%～60%。当今世界各大洲发病率在1/10万～10/10万，总病死率在5%～15%，高达20%的脑膜炎患者会有神经系统后遗症，包括智力受损和耳聋等。根据荚膜多糖型别进行血清学分类可分13个血清型，其中A群、B群、C群约占流行菌群的90%。A群脑膜炎球菌是较大流行的主要致病血清群，特别是在所谓的非洲“流脑流行带”，每隔7-14年就会出现一次较大流行。
我国于1938年、1949年、1959年、1967年和1977年曾发生过5次全国性流脑流行；其中以1967年春季流行最为严重，发病率高达403/10万，病死率为5.49%。我国过去90%以上的病例是A群病菌致病，现在B群或C群病菌有时亦引起流脑暴发。2003年开始，C群流脑的发病率明显上升。目前A群和C群共占所有血清群的50%以上，且C群仍有进一步增高的趋势。因此，目前我国预防流脑工作的重点是以预防A 群和C 群为主。
荚膜多糖是大分子物质，分离纯化比单糖或小分子寡糖复杂。在荚膜多糖的分离纯化中，需去除核酸、蛋白质、内毒素等杂质。目前国内上市的A群C群脑膜炎球菌荚膜多糖都是按照传统方法制备而成。即首先采用液体发酵的方法制备细菌培养物，然后将杀菌后的培养液利用离心法去除菌体。再用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）与多糖形成复合物，再进行纯化处理，由于成本较高，纯化处理主要采用苯酚抽提，因此苯酚抽提成为了生产规模纯化荚膜多糖的主要方法。但是苯酚抽提法，需要使用大量的苯酚，对人体和环境的危害很大，而且最终的多糖制品中含有少量的苯酚残留物。
另外，A群多糖疫苗对2岁以下儿童的免疫原性差，保护期短，C群多糖疫苗对2岁以下儿童不产生免疫性。因此，世界卫生组织不推荐A群C群流脑多糖疫苗用于婴幼儿的常规免疫接种。流脑多糖在较大儿童和成年人中能诱发很高的杀菌抗体，但对18月龄以下婴幼儿不能诱生有效杀菌抗体，也不能诱发免疫记忆；其原因是多糖属T细胞非依赖性抗原，在免疫系统机能发育尚不完善的2岁以下婴幼儿中，多糖类抗原不能刺激机体产生有效抗体，所以多糖疫苗对这一高危人群不能起到有效保护作用。 为了改变多糖的非T细胞依赖性，人们将多糖共价偶联到一种蛋白载体上，使之转变为T细胞依赖性抗原，从而解决了在2岁以下婴幼儿免疫原性差的问题。这种新一代结合疫苗不仅在任何年龄段人群中均可诱生出高浓度的以IgG为主的保护性抗体，并可产生明显的免疫回忆反应。目前市售的流脑多糖结合疫苗包括，C群流脑多糖结合疫苗，A群C群流脑多糖结合疫苗。
目前，国产的所有已经上市的结合疫苗（如b型流感嗜血杆菌结合疫苗、A群C群脑膜炎球菌结合疫苗）全部采用同一种化学结合方法制备而成，即用溴化氰（CNBr）活化多糖的邻位羟基，活化后的多糖与己二酰肼（ADH）反应生成多糖-ADH衍生物。然后在碳二亚胺（EDAC）的催化作用下，多糖-ADH衍生物与载体蛋白共价结合。该工艺有个很大的缺点是在多糖的活化过程中会使用到溴化氰。溴化氰为极毒而且性质活泼的物质，受热、遇水放出剧毒气体如氰化氢和氰化氢，遇酸易引起爆炸。随着对环保意识的增强，以及对工人工作环境状况的重视，人们一直在寻找合适的方法来避免在疫苗制造过程中使用象溴化氰这样剧毒的化学试剂。使用现代的技术对传统的生产工艺进行改进以减少或弃用有毒化学试剂对于保护人类健康以及减少环境污染都具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明提供一种更安全有效的A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，该方法有效的避免了避免纯化过程对苯酚的使用，以及制备衍生物过程对溴化氰的使用，以使得整个制备过程无毒伤害，能够减少环境污染，对环境起到一定的保护作用。
为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
（1）将脑膜炎球菌进行发酵培养并进行杀菌处理，得到已杀菌的培养液；
（2）脑膜炎球菌荚膜多糖制备
将已杀菌的培养液离心收集上清，再加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖沉淀物，再用氯化钙溶液将多糖沉淀物充分搅拌3-5小时至多糖和CTAB解离后离心收集上清液Ⅰ，在上清液Ⅰ中加入乙醇至终浓度25%v/v，在2-8℃下静置过夜；再次离心收集上清液Ⅱ，在上清液Ⅱ加入乙醇至终浓度75%v/v，振摇使多糖沉淀下来静置18小时以上，离心收集沉淀，再将沉淀洗净干燥后即得粗制多糖；
（3）将粗制多糖溶解于缓冲液A中，粗制多糖的溶解浓度为5～10mg/ml，溶解后的粗制多糖经澄清过滤后，上样于用缓冲液预先平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱，收集未吸附的流穿峰，然后上样于以缓冲液B预先平衡好的Capto Adhere层析柱，以缓冲液B作为流动相进行洗脱，收集含有多糖的目标峰，再将收集的多糖溶液以注射用水为超滤液，用超滤膜包进行脱盐，脱盐后的溶液即为A群C群脑膜炎球菌多糖溶液，其中缓冲液A为20mM Tris-HCl，0.5%脱氧胆酸钠，pH 8.0；缓冲液B为20mM Tris-HCl，pH 8.0；
（4）将5mg/mL的A群C群脑膜炎球菌多糖溶液，在搅拌下加入CDAP，其中A群C群脑膜炎球菌多糖和CDAP的质量比为1:0.5-1.5，并调混合溶液的pH值范围为9.0-11.0，静置10-40min后加入ADH反应15min得到反应物溶液，其中A群C群脑膜炎球菌多糖和ADH的质量比为1:3.5，将反应物溶液透析后得A群C群脑膜炎球菌多糖-ADH衍生物；
（5）将A群C群脑膜炎球菌多糖-ADH衍生物和破伤风类毒素按质量比为1:1混合，调pH值范围为5.5-5.7，加入EDAC，并于2-8℃搅拌反应5-6h后，再进行透析得反应物，再将反应物用层析法进行纯化，收集外水体积洗脱组份，除菌过滤后得原液；
（6）在原液中加入0.2mol/L氯化钠溶液并补加蒸馏水调整混合液的浓度符合注射剂量，再加入冻干保护剂即得A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。
步骤（1）具体为在流脑半综合培养基上进行脑膜炎球菌种接种，温度35～37℃，培养16～24小时，经过三代扩增培养后接种至种子罐培养，温度35～37℃，培养4～6小时制备数量适宜的生产用种子，然后将种子罐培养物接种至500L发酵罐培养，温度35～37℃，培养时间6～12小时后加入甲醛杀菌。
步骤（3）中粗制多糖的溶解浓度为6～8mg/ml 。
步骤（3）中溶解后的粗制多糖需经0.45µm滤膜进行澄清过滤。
步骤（3）中超滤膜包的截留分子量为300KD。
步骤（4）中A群C群脑膜炎球菌多糖和CDAP的质量比为1:0.5。
步骤（4）加入CDAP后调整混合溶液的pH值范围为11.0±0.2。
步骤（4）加入CDAP后静置时间为25-30min
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，该方法有效的避免了避免纯化过程对苯酚的使用，以及制备衍生物过程对溴化氰的使用，以使得整个制备过程无毒伤害，能够减少环境污染，对环境起到一定的保护作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。本发明的实施方式包括但不限于下列实施例。
以下实施例中的所有产品均为市售产品。
实施例1
A群脑膜炎球菌多糖制备
开启A群脑膜炎球菌工作种子批菌种1只，接种至2支流脑半综合培养基试管，温度35～37℃，培养16～24小时，为第一代菌种。将每1支第一代菌种传种于2瓶流脑半综合培养基，温度35～37℃培养16～24小时，为第二代菌种。将每1瓶第二代菌种传种于6瓶流脑半综合培养基，温度35～37℃培养16～24小时，为第三代菌种。将三代菌种采集到500ml生理盐水溶液中混匀，接种于50L种子罐，温度35～37℃，培养时间4小时。然后将50L种子罐培养物接种至500L发酵罐培养，温度35～37℃，培养时间8小时后加入终浓度为1%（v/v）的甲醛溶液杀菌。
将已杀菌的培养液离心收集上清。然后加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖沉淀物。多糖沉淀物用氯化钙溶液搅拌3小时使多糖和CTAB解离。离心收集上清液Ⅰ，上清液Ⅰ加入乙醇至终浓度为25%（v/v），2～8℃静置过夜，离心收集上清液Ⅱ，上清液Ⅱ加入乙醇至终浓度为75%（v/v），充分振摇使多糖沉淀，静置18小时以上，离心收集沉淀，然后用无水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即为粗制多糖。
将粗糖溶解于缓冲液（20mM Tris-HCl，0.5%脱氧胆酸钠，pH 8.0）中，溶解浓度为5mg/ml。溶解后的样品经0.45µm滤膜澄清过滤后，上样于用缓冲液（20mM Tris-HCl，0.5%脱氧胆酸钠，pH 8.0）预先平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱，收集未吸附的流穿峰，然后上样于以缓冲液（20mM Tris-HCl，pH 8.0）预先平衡好的Capto Adhere层析柱，以20mM Tris-HCl，pH 8.0缓冲液作为流动相进行洗脱，收集含有多糖的目标峰。然后将收集的多糖溶液以注射用水为超滤液，用截留分子量为300KD的超滤膜包进行脱盐。脱盐后的溶液即为A群C群脑膜炎球菌多糖溶液，取样检测质量指标。由下表可见，制得的三批C群多糖的各项质量指标均符合药典要求。
将A群流脑多糖配制溶液，然后在搅拌下加入CDAP，其中A群流脑多糖和CDAP的质量比为1:0.5，并调混合溶液的pH值范围为11.0±0.2，静置25-30min后加入ADH反应15min得到反应物溶液，其中A群流脑多糖和ADH的质量比为1:3.5，将反应物溶液透析后得A群流脑多糖-ADH衍生物；
将A群流脑多糖-ADH衍生物和破伤风类毒素按质量比为1:1混合，调pH值范围为5.5-5.7，加入EDAC，并于2-8℃搅拌反应5-6h后，再进行透析得反应物，再将反应物用层析法进行纯化，收集外水体积洗脱组份，除菌过滤后得原液；
在原液中加入0.2mol/L氯化钠溶液并补加蒸馏水调整混合液的浓度符合注射剂量，再加入冻干保护剂即得A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。
实施例2
开启C群脑膜炎球菌工作种子批菌种1只，接种至2支流脑半综合培养基试管，温度35～37℃，培养16～24小时，为第一代菌种。将每1支第一代菌种传种于2瓶流脑半综合培养基，温度35～37℃培养16～24小时，为第二代菌种。将每1瓶第二代菌种传种于6瓶流脑半综合培养基，温度35～37℃培养16～24小时，为第三代菌种。将三代菌种采集到500ml生理盐水溶液中混匀，接种于50L种子罐，温度35～37℃，培养时间4小时。然后将50L种子罐培养物接种至500L发酵罐培养，温度35～37℃，培养时间8小时后加入终浓度为1%（v/v）的甲醛溶液杀菌。
将已杀菌的培养液离心收集上清。然后加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖沉淀物。多糖沉淀物用氯化钙溶液搅拌3小时使多糖和CTAB解离。离心收集上清液Ⅰ，上清液Ⅰ加入乙醇至终浓度为25%（v/v），2～8℃静置过夜，离心收集上清液Ⅱ，上清液Ⅱ加入乙醇至终浓度为75%（v/v），充分振摇使多糖沉淀，静置18小时以上，离心收集沉淀，然后用无水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即为粗制多糖。
将粗糖溶解于缓冲液（20mM Tris-HCl，0.5%脱氧胆酸钠，pH 8.0）中，溶解浓度为5mg/ml。溶解后的样品经0.45µm滤膜澄清过滤后，上样于用缓冲液（20mM Tris-HCl，0.5%脱氧胆酸钠，pH 8.0）预先平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱，收集未吸附的流穿峰，然后上样于以缓冲液（20mM Tris-HCl，pH 8.0）预先平衡好的Capto Adhere层析柱，以20mM Tris-HCl，pH 8.0缓冲液作为流动相进行洗脱，收集含有多糖的目标峰。然后将收集的多糖溶液以注射用水为超滤液，用截留分子量为300KD的超滤膜包进行脱盐。脱盐后的溶液即为A群C群脑膜炎球菌多糖溶液，取样检测质量指标。由下表可见，制得的三批C群多糖的各项质量指标均符合药典要求。
将C群流脑多糖配制成5mg/mL的溶液，然后在搅拌下加入CDAP，其中C群流脑多糖和CDAP的质量比为1:1.0-1.5，并调混合溶液的pH值范围为9.0-10.0，静置10-40min后加入ADH反应15min得到反应物溶液，其中C群流脑多糖和ADH的质量比为1:3.5，将反应物溶液透析后得C群流脑多糖-ADH衍生物；
将C群流脑多糖-ADH衍生物和破伤风类毒素按质量比为1:1混合，调pH值范围为5.5-5.7，加入EDAC，并于2-8℃搅拌反应5-6h后，再进行透析得反应物，再将反应物用层析法进行纯化，收集外水体积洗脱组份，除菌过滤后得原液；
在原液中加入0.2mol/L氯化钠溶液并补加蒸馏水调整混合液的浓度符合注射剂量，再加入冻干保护剂即得C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。
按照上述的实施例，即可很好的完成本发明。
如上所述即为本发明的实施例。本发明不局限于上述实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。