本发明涉及生物制剂领域，具体涉及一种含有rhIL-12治疗非活动性乙肝的药物组合物。
背景技术：
：乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致，为我国常见的疾病，具有一定的传染性，其中，乙型肝炎患者和HBV携带者为本病的主要传染源。临床表现为乏力、畏食、恶心、腹胀、肝区疼痛等症状，严重者可发展为肝硬化和肝癌，严重影响我国人民的健康。目前乙肝治疗主要包括抗病毒、免疫调节、抗纤维化和对症治疗。多采用核苷类似物、干扰素-α(IFN-α)及长效干扰素(PEGIFN-α)等药物进行单一或联合用药，这种治疗方法可以明显抑制HBV的DNA复制，并使传染性较强的乙肝e抗原(HBeAg)在血清中逐渐阴转。从而使受损的肝功能恢复正常。但这些疗法最后都无法清除血清中的乙肝表面抗原(HBsAg)，也不能使血清中产生乙肝表面抗体(HBsAb)。其根本原因在于感染者的免疫功能受到HBsAg的抑制。在先天固有免疫功能方面，参与非特异性免疫反应的重要蛋白分子Toll样受体(TLR3、TLR7)的功能被抑制，HBV的持续存在使先天免疫清除功能失效。而在获得性免疫方面，由于HBV持续存在，在CD4+、CD8+T细胞出现对免疫应答具有负性调节作用的程序性死亡-1受体(PD1)以及其配体(PDL-1)高表达，导致T细胞转变为耗竭T细胞(Tcellexhausted)即无功能T细胞，使其不能很好地清除HBV，更不能形成免疫记忆，从而不能监控HBsAg的产生，导致HBsAg的持续存在及血清中持续阳性。因此，在目前的治疗方法治疗下，HBsAg持续存在而不能完全清除。有鉴于此，探索和寻找一种可以激活先天固有免疫和后天获得性免疫以彻底治愈乙型肝炎的药物或治疗方法就成为一项紧迫而又有意义的工作。中国专利申请200610123433.1公开了一种治疗性乙肝疫苗组合物，该组合物每毫升含有10～20μg重组HBsAg蛋白疫苗、10～20μg重组人白介素12、9～18亿绿脓杆菌菌苗制剂和余量的水溶液。该发明的组合物可以活化多个免疫靶点如NKT细胞、NK细胞、DC和T细胞(CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆性T细胞)，对打破HBV免疫耐受，重建细胞免疫功能，对抑制和清除HBV将产生良好效果。技术实现要素：为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种含有rhIL-12治疗非活动性乙肝的药物组合物。本发明的发明人通过大量的实验发现，重组人白介素-12(rhIL-12)与乙型肝炎疫苗(重组HBsAg蛋白疫苗)和细胞免疫佐剂(母牛分枝杆菌疫苗)联用，可以提高宿主对HBV的特异性和非特异性免疫反应，更好地治愈HBV感染，并促使HBsAg血清阴转，可用于治疗处于免疫耐受期、免疫清除期或非活动性HBsAg携带期的慢性乙型肝炎。进一步地，本发明的发明人发现，每毫升治疗非活动性乙肝的药物组合物中，各组份在下述的浓度范围内均有较好的治疗效果，其中，重组人白介素-1210～20μg、重组HBsAg蛋白疫苗10～60μg和母牛分枝杆菌疫苗5～20μg。进一步地，本发明的发明人发现，当每毫升治疗非活动性乙肝的药物组合物含有重组人白介素-1210μg、重组HBsAg蛋白疫苗60μg和母牛分枝杆菌疫苗10μg时的治疗效果最佳。进一步地，本发明所述的治疗非活动性乙肝的药物组合物的剂型为水针剂，所述的水针剂中用于溶解重组人白介素-12、重组HBsAg蛋白疫苗和母牛分枝杆菌疫苗所用的溶剂为注射用水或生理盐水。进一步地，本发明所述的治疗非活动性乙肝的药物组合物的剂型为冻干粉针剂，用于溶解冻干粉针剂的溶剂为注射用水或生理盐水。本发明所述的rhIL-12是一种既可以激活人体先天固有免疫(如TLR3、TLR7和NK细胞)，又可以恢复耗竭的T细胞功能，且可以下调PD1的细胞因子。rhIL-12能使活化的T细胞增殖并增加其细胞毒活性，诱导NK细胞和T细胞产生大量的内源性的γ-干扰素(IFN-γ)，这种内源性IFN-γ可以进入肝细胞等感染了HBV的细胞内阻止HBV的复制和再生产过程，形成细胞内非溶细胞性病毒清除模式，清除细胞内的HBV的DNA及HBsAg。rhIL-12还可通过调节辅助性T细胞(Th1/Th2细胞)发育，促使其向Th1细胞分化，启动和调节细胞介导的免疫反应。本发明所述的重组HBsAg蛋白疫苗为酵母细胞、哺乳动物细胞或其他可用细胞表达的基因工程重组蛋白，为具有治疗作用的特异性免疫调节剂。一定剂量的重组HBsAg蛋白疫苗长期反复免疫可以诱导机体免疫系统产生特异性的免疫应答(趋向Th1型)，上调非溶细胞性和溶细胞性的细胞免疫应答，并能降低HBV感染后HBV的复制和表达。本发明所述的母牛分枝杆菌疫苗为双向免疫调节剂，具有较强的细胞免疫增强作用，能够激发特异性的Th1免疫，并下调Th2，从而控制免疫病理反应。母牛分枝杆菌疫苗对免疫功能低下和亢进者均有调节和治疗的作用，以其作为细胞免疫佐剂，结合rhIL-12和重组HBsAg蛋白疫苗对HBV感染者实施联合免疫治疗，可同时提高HBV感染者的细胞免疫和体液免疫功能，以打破免疫耐受状态，有效清除体内的HBV，以达到彻底治愈HBV感染，并使HBsAg血清阴转的目的。本发明通过探索rhIL-12对健康人及慢性乙型肝炎患者(包括免疫耐受期、免疫清除期、非活动性HBsAg携带期)的外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)诱生IFN-γ(主要由Th1细胞分泌)和IL-4(主要由Th2细胞分泌)的情况，了解rhIL-12对增强慢性乙型肝炎患者Th1优势表达，调整Th1/Th2细胞平衡的作用。结果显示，rhIL-12呈剂量关系地促进健康人以及免疫耐受期、免疫清除期、非活动性HBsAg携带期患者的PBMCs诱生IFN-γ，但对PBMCs诱生IL-4无明显影响。以上结果表明，rhIL-12可增强Th1型细胞因子的优势表达，rhIL-12对不同临床分期的慢性乙型肝炎患者PBMCs均具有增强细胞免疫功能的作用。进一步地，本发明分别将rhIL-12、重组HBsAg蛋白疫苗、母牛分枝杆菌疫苗单独应用或者两两组合应用或者三者组合应用以评价对健康人和慢性乙型肝炎(CHB)患者的PBMCs诱生IFN-γ的影响，并以抗人CD3单抗作为阳性对照，确定rhIL-12、重组HBsAg蛋白疫苗、母牛分枝杆菌疫苗三者增强CHB患者PBMCs对HBV抗原产生特异性细胞免疫应答的影响。结果显示，重组HBsAg蛋白疫苗、母牛分枝杆菌疫苗单独刺激慢性乙肝患者或健康人的PBMCs时，仅有少量IFN-γ产生。单独应用rhIL-12刺激，产生的IFN-γ与阴性对照组比较有统计学差异(P＜0.05)，但仍处于较低水平。用重组HBsAg蛋白疫苗或母牛分枝杆菌疫苗联合rhIL-12刺激慢性乙肝患者和健康人的PBMCs，发现联合组与单独组比较，IFN-γ水平都有明显上升，差异有统计学意义(P＜0.01)。用重组HBsAg蛋白疫苗和母牛分枝杆菌疫苗联合rhIL-12刺激慢性乙肝患者和健康人的PBMCs，发现三种刺激物联合组与重组HBsAg蛋白疫苗或母牛分枝杆菌疫苗联合rhIL-12两种刺激物联合组比较，IFN-γ水平都有明显上升，差异有统计学意义(P＜0.01)。以上结果表明，rhIL-12、重组HBsAg蛋白疫苗、母牛分枝杆菌疫苗三者联合应用具有协同作用，可显著增强慢性乙型肝炎患者PBMCs的细胞免疫功能。进一步地，本发明还探讨了rhIL-12、重组HBsAg蛋白疫苗、母牛分枝杆菌疫苗三者联合应用对健康志愿者PBMCs诱生IFN-γ来源的主要细胞亚群及PD-1、TLR的表达的影响。结果显示，健康愿者PBMCs经抗原联合rhIL-12孵育后，CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞内分泌IFN-γ的细胞百分数与阴性对照组比较有显著差异(P＜0.05)；CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞PD-1的表达与阴性对照组比较有显著差异(P＜0.01)；CD14+细胞TLR3、TLR7的表达与阴性对照组比较有显著差异(P＜0.01)；CD1a+细胞TLR3、TLR7的表达与阴性对照组比较有显著差异(P＜0.01)。以上结果表明，抗原联合rhIL-12可活化T淋巴细胞亚群，促进CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞分泌IFN-γ，并抑制CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞表达PD-1；抗原联合rhIL-12还可活化单核细胞和树突状细胞(DC细胞)，促进CD14+细胞和CD1a+细胞表达Toll样受体，增强特异性免疫和非特异性免疫功能，打破HBV免疫耐受，重建细胞免疫功能，对抑制和清除HBV将产生良好效果。此外，小鼠动物试验证实，单独应用重组HBsAg蛋白疫苗或母牛分枝杆菌疫苗，小鼠血清中仅有少量IFN-γ产生。与生理盐水组比较，单独应用rhIL-12可显著增加小鼠血清中IFN-γ的含量(P＜0.001)，用重组HBsAg蛋白疫苗和母牛分枝杆菌疫苗联合rhIL-12进行应用，增加小鼠血清中IFN-γ的含量更为明显(P＜0.001)。与现有技术相比，本发明的优势在于：本发明所述的治疗非活动性乙肝的药物组合物可活化T淋巴细胞亚群，促进CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞产生大量的内源性IFN-γ，并可抑制CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞表达PD-1，改善获得性免疫功能；还可活化单核细胞和树突状细胞(DC细胞)，促进CD14+细胞和CD1a+细胞表达Toll样受体，改善先天免疫功能；所述的药物组合物可打破HBV免疫耐受，重建细胞免疫功能，更好地治愈HBV感染，并促使HBsAg血清阴转。具体实施方式以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。实施例1rhIL-12对健康人及CHB患者PBMCs诱生IFN-γ的作用1.试验资料：本实施例中的rhIL-12购自广州市恺泰生物科技有限公司；人IFN-γELISA试剂盒购自BD/Pharmingen公司(BectonDickinson/PharMingenUSA)；RPMI-1640培养液、谷氨酰胺和Hanks液购自GIBCO公司(USA)；葡聚糖泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)购自上海华精生物科技公司；胎牛血清购自GIBCO。筛选健康人20例，CHB患者62例(其中免疫耐受期21例、免疫清除期22例、非活动性HBsAg携带期19例)。其中，健康人选择标准：HBsAg阴性，HBsAb阳性。所有乙肝患者均不合并丙型肝炎感染，所有受试者年龄为15-55岁，性别不限。2.试验方法：取健康人或CHB患者外周静脉血5ml，肝素20U/ml抗凝，经RPMI-1640培养基1:1稀释后，使用Ficoll淋巴细胞分离液按常规方法分离单个核细胞(PBMCs)，再用RPMI-1640基础培养液洗两次，最终用1ml含10％灭活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640悬浮细胞，计数细胞，调整细胞浓度为2×106/ml。取配置好的100μl细胞悬液加入96孔培养板，再加入100μl用RPMI-1640(10％FBS，室温)稀释好的不同浓度的rhIL-12，并设RPMI-1640基础培养液空白对照孔和抗人CD3单抗(eBioscience公司)阳性对照孔，同一浓度刺激孔均设复孔，置37℃、5％CO2培养箱孵育72h后，在无菌条件下收集无细胞上清液，ELISA方法测定IFN-γ和IL-4含量，结果见下表1-4。3.数据处理：数据用表示，采用SPSS13.0统计软件进行重复测量方差分析。满足方差齐性条件，用ONE-WAYANOVA；不满足参数条件，采用Kruskal-Wallis检验，显著性检验标准为P＜0.05。4.试验结果表1rhIL-12对健康人PBMCs诱生IFN-γ和IL-4的影响注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，***P＜0.001；与rhIL-120.01ng/m1组比较，#P＜0.05，###P＜0.001。结果显示，rhIL-120.01ng/m1、0.1ng/m1和1.0ng/m1三个剂量与健康人PBMCs孵育72h后产生的IFN-γ水平，具有剂量依赖关系。其中，0.1ng/m1和1.0ng/m1rhIL-12组与阴性对照组相比均有显著差异(P＜0.05，P＜0.001)，与0.01ng/m1rhIL-12组比较也具有显著差异(P＜0.05，P＜0.001)。各rhIL-12浓度对PBMCs诱生IL-4无明显差异。表2rhIL-12对免疫耐受期患者PBMCs诱生IFN-γ和IL-4的影响注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与rhIL-120.01ng/m1组比较，##P＜0.01。结果显示，rhIL-120.01ng/m1、0.1ng/m1和1.0ng/m1三个剂量与免疫耐受期患者的PBMCs孵育72h后产生的IFN-γ水平呈明显的量效关系。其中，0.01ng/m1、0.1ng/m1和1.0ng/m1rhIL-12组与阴性对照组相比均有显著差异(P＜0.05，P＜0.01)，并且1.0ng/m1rhIL-12组与0.01ng/m1rhIL-12组比较具有显著差异(P＜0.05)。各rhIL-12浓度对PBMCs诱生IL-4无明显差异。表3rhIL-12对免疫清除期患者PBMCs诱生IFN-γ和IL-4的影响注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，***P＜0.001；与rhIL-120.01ng/m1组比较，##P＜0.01，###P＜0.001。结果显示，rhIL-120.01ng/m1、0.1ng/m1和1.0ng/m1三个剂量与免疫清除期患者的PBMCs孵育72h后产生的IFN-γ水平呈明显的量效关系。其中，0.01ng/m1、0.1ng/m1和1.0ng/m1rhIL-12组与阴性对照组相比均有显著差异(P＜0.05，P＜0.001)，并且0.1ng/m1rhIL-12组和1.0ng/m1rhIL-12组与0.01ng/m1rhIL-12组比较均具有显著差异(P＜0.01，P＜0.001)。各rhIL-12浓度对PBMCs诱生IL-4无明显差异。表4rhIL-12对非活动性HBsAg携带期患者PBMCs诱生IFN-γ和IL-4的影响注：与阴性对照组比较，**P＜0.01，***P＜0.001；与rhIL-120.01ng/m1组比较，##P＜0.01，###P＜0.001。结果显示，rhIL-120.01ng/m1、0.1ng/m1和1.0ng/m1三个剂量与免疫清除期患者的PBMCs孵育72h后产生的IFN-γ水平呈明显的量效关系。其中，0.1ng/m1rhIL-12组与阴性对照组相比均有显著差异(P＜0.01)，并与0.01ng/m1rhIL-12组比较均具有显著差异(P＜0.001)。各rhIL-12浓度对PBMCs诱生IL-4无明显差异。综上所述，rhIL-12呈剂量关系地促进健康人以及免疫耐受期、免疫清除期、非活动性HBsAg携带期乙肝患者的PBMCs诱生IFN-γ，但对PBMCs诱生IL-4无明显影响。rhIL-12可增强Th1型细胞因子的优势表达，rhIL-12对不同临床分期的慢性乙型肝炎患者PBMCs均具有增强细胞免疫功能的作用。实施例2rhIL-12与特异性抗原联合应用对BALB/c小鼠产生IFN-γ的影响1.试验资料：本实施例中的rhIL-12购自广州市恺泰生物科技有限公司；RPMI1640基础培养液、FBS购自GIBCO公司(USA)；Ficoll淋巴细胞分离液购自上海华精生物科技公司。清洁级BALB/c小鼠40只，雌雄各半，体重20g，购自南方医科大学实验动物中心。2.试验方法：将40只小鼠随机分入生理盐水组(生理盐水150μl/只)及rHBsAg组(10μg/只)、母牛分枝杆菌组(10μg/只)、rhIL-12组(0.3μg/只)、rHBsAg(10μg/只)+母牛分枝杆菌(10μg/只)+rhIL-12(0.3μg/只)组，共五组，每组8只，雌雄各半。给药两次，第一次给药72h后再给药一次。注射部位为小鼠颈背部皮下。分别于给药前，第一次给药后24、72h以及第二次给药后24h眼眶采血，分离血清检测IFN-γ浓度，结果见表5。3.数据处理：数据用表示，采用SPSS13.0统计软件进行重复测量方差分析。满足方差齐性条件，用ONE-WAYANOVA；不满足参数条件，采用Kruskal-Wallis检验，显著性检验标准为P＜0.05。4.试验结果表5rmIL-12对BALB/c小鼠血清中产生IFN-γ影响注：与生理盐水组比较，***P＜0.001；与rhIL-12组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。结果显示，给药后小鼠血清中IFN-γ的浓度在24h达到高峰，rmIL-12组和rHBsAg+母牛分枝杆菌+rhIL-12组与生理盐水组比较明显升高(P＜0.001)。至72h时血清中的IFN-γ恢复接近给药前水平。此时再给药一次，24h时rmIL-12组和rHBsAg+母牛分枝杆菌+rhIL-12组血清中的IFN-γ与生理盐水组比较明显升高(P＜0.001)。实施例3rhIL-12与特异性抗原联合应用对健康人及CHB患者PBMCs产生IFN-γ的作用1.试验资料：本实施例中的rhIL-12购自广州市恺泰生物科技有限公司；rHBsAg购自深圳康泰生物科技有限公司；注射用母牛分枝杆菌购自安徽智飞龙科马生物制药有限公司；人IFN-γELISA试剂盒均购自BD公司。筛选慢性乙肝患者15例，年龄17-49岁，平均31.17岁。所有患者排除甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)感染和其他原因(药物、酒精、中毒)等造成的急慢性肝损害。另选取9名健康志愿者作为对照，对照组全部接种过重组HBsAg疫苗，血清中除了HBsAb阳性外，其余HBV血清学指标均为阴性。2.试验方法：健康人及乙肝患者PBMCs的分离及培养方法同实施例1。96孔细胞培养板每孔中含细胞悬液及相应浓度刺激物各100μl，各刺激物浓度均设3个复孔，置37℃、5％CO2培养箱培养72h，ELISA测定培养上清中IFN-γ的浓度。其中，各组的给药浓度如下：(1)阴性对照：培养液；(2)rHBsAg(0.5μg/ml)；(3)母牛分枝杆菌(0.225μg/ml)(4)rhIL-12(1ng/ml)；(5)rHBsAg(0.5μg/ml)联合rhIL-12(1ng/ml)；(6)母牛分枝杆菌(0.225μg/ml)联合rhIL-12(1ng/ml)；(7)rHBsAg(0.5μg/ml)、母牛分枝杆菌(0.225μg/ml)联合rhIL-12(1ng/ml)；(8)阳性对照：0.2μg/ml抗人CD3单抗。结果见下表6。3.数据处理：数据用表示，采用SPSS13.0统计软件进行重复测量方差分析。满足方差齐性条件，用ONE-WAYANOVA；不满足参数条件，采用Kruskal-Wallis检验，显著性检验标准为P＜0.05。4.试验结果表6rhIL-12联合抗原治疗对健康人和CHB患者PBMCs诱生IFN-γ和IL-4的影响组别健康人CHB患者阴性对照(培养液)7.94±6.19117.40±108.52rHBsAg38.83±26.88105.00±97.35母牛分枝杆菌53.64±46.82107.48±106.71rhIL-12153.92±117.84*693.35±610.48*rHBsAg+rhIL-12414.66±158.66##△△■■2382.93±1089.27##△△■■母牛分枝杆菌+rhIL-12293.66±173.10##△△■■1441.45±1034.16##△△■■rHBsAg+母牛分枝杆菌+rhIL-12761.72±546.53☆☆3934.27±2434.75☆☆抗人CD3单抗13246.45±11092.8214605.66±12465.30注：与阴性对照组比较，*P＜0.05；与rHBsAg组比较，##P＜0.01；与母牛分枝杆菌组比较，△△P＜0.01；与rhIL-12组比较，■■P＜0.01；与rHBsAg+rhIL-12组比较，P＜0.01；与母牛分枝杆菌+rhIL-12组比较，☆☆P＜0.01。结果显示，用0.5μg/mlrHBsAg、0.225μg/ml母牛分枝杆菌单独刺激CHB患者或健康人的PBMCs时，发现仅有少量IFN-γ产生。单独应用rhIL-12(1ng/ml)刺激，产生的IFN-γ与阴性对照组比较有统计学差异(P＜0.05)，但IFN-γ处于较低水平。用rHBsAg(0.5μg/ml)或母牛分枝杆菌(0.225μg/ml)联合rhIL-12(1ng/ml)刺激CHB患者和健康人PBMCs，发现联合组与单独组比较，IFN-γ水平都有明显上升，差异有统计学意义(P＜0.01)。用rHBsAg(0.5μg/ml)和母牛分枝杆菌(0.225μg/ml)联合rhIL-12(1ng/ml)刺激CHB患者和健康人PBMCs，发现三种刺激物联合组与HBsAg(0.5μg/ml)或母牛分枝杆菌(0.225μg/ml)联合rhIL-12(1ng/ml)两种刺激物联合组比较，IFN-γ水平都有明显上升，差异有统计学意义(P＜0.01)。以上结果表明，rhIL-12、rHBsAg、母牛分枝杆菌疫苗三者联合应用具有协同作用，可显著增强CHB患者PBMCs的细胞免疫功能。实施例4rhIL-12与特异性抗原联合应用对健康人诱生IFN-γ来源的主要细胞亚群及PD-1、TLR的表达研究1.试验资料：本实施例中的rhIL-12购自广州市恺泰生物科技有限公司；RPMI1640基础培养液、FBS购自GIBCO公司(USA)；Ficoll淋巴细胞分离液购自上海华精生物科技公司；CD3PE、CD8FITC、CD4PreCP、CD1aPE、CD14PE、IFN-γAPC、PD-1APC、TLR3Alexaflour647、TLR7Alexaflour488均购自美国BD公司。招募健康志愿者8例，均曾接种过乙肝疫苗，HBV血清学指标如下：HBsAg(-)、抗HBs(+)、HBeAg(-)、抗Be(-)、抗HBc(-)。无菌采静脉血10ml。2.试验方法：(1)健康人PBMCs的分离及培养方法同实施例1。(2)将浓度为2×106/ml的细胞分别加入2管15ml细胞离心管中，每管1ml，分两个组，其中一组加入rHBsAg(0.5μg/ml)、母牛分枝杆菌(0.225μg/ml)联合rhIL-12(1ng/ml)，另一组做阴性对照，混匀，37℃，5％CO2温育6h。(3)温育至最后2h加蛋白转运抑制剂(BFA)10μl/ml，混匀。(4)细胞用PBS洗2次(1000r/min、5min)，用纸吸干后加固定液，每管各加4％PFA(多聚甲醛)2ml，混匀，室温8分钟。(5)用PBS洗2次(2000r/min、10min)，用纸吸干，各加破膜剂(buffer3)400μl，4℃过夜。(6)染色：每管四个组合，每组100μl细胞。第一组加入PE标记的CD3抗体、PreCP标记的CD4抗体、FITC标记的CD8抗体、APC标记的IFN-γ抗体；第二组加入PE标记的CD3抗体、PreCP标记的CD4抗体、FITC标记的CD8抗体、APC标记的PD-1抗体；第三组加入Alexaflour488标记的TLR7抗体、PE标记的CD1a抗体、Alexaflour647标记的TLR3抗体；第四组加入Alexaflour488标记的TLR7抗体、PE标记的CD14抗体、Alexaflour647标记的TLR3抗体。每种抗体加入量均为5μl。4℃，避光30分钟。(7)用破膜剂(buffer3)洗2次。(8)每管各加含0.1％BSA的PBS300μl，重悬细胞，上机分析。以淋巴细胞设门分析T细胞亚群IFN-γ和PD-1的表达，分别以单核细胞和树突状细胞(DC细胞)设门分析TLR的表达。结果见表7-8。3.数据处理：数据用表示，采用SPSS13.0统计软件进行重复测量方差分析。满足方差齐性条件，用ONE-WAYANOVA；不满足参数条件，采用Kruskal-Wallis检验，显著性检验标准为P＜0.05。4.试验结果表7健康人PBMCs经抗原联合rhIL-12孵育6h后T细胞亚群IFN-γ及PD-1的表达(％)注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。表8健康人PBMCs经抗原联合rhIL-12孵育6h后单核细胞和树突细胞TLR的表达(％)注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。结果显示，健康志愿者PBMCs经抗原联合rhIL-12孵育后，CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞内分泌IFN-γ的细胞百分数与阴性对照组比较有显著差异(P＜0.05)；CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞PD-1的表达与阴性对照组比较有显著差异(P＜0.01)；CD14+细胞TLR3、TLR7的表达与阴性对照组比较有显著差异(P＜0.01)；CD1a+细胞TLR3、TLR7的表达与阴性对照组比较有显著差异(P＜0.01)。以上结果表明，本发明所述的治疗非活动性乙肝的药物组合物可活化T淋巴细胞亚群，改善获得性免疫功能；还可活化单核细胞和树突状细胞(DC细胞)，改善先天免疫功能；所述的药物组合物可打破HBV免疫耐受，重建细胞免疫功能，更好地治愈HBV感染，并促使HBsAg血清阴转。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3