本发明属于疫苗制备领域，具体涉及一种鸡包涵体肝炎灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
：鸡包涵体肝炎特征为病鸡死亡突然增多，严重贫血、黄疸，肝肿大，有出血和坏死灶，心包积液。本病多发于4-10周龄的鸡，5周龄鸡最易感，产蛋鸡则很少发病，肉鸡多发。该病的致病原属于禽腺病毒I群，有12个血清型，1951年美国首次报道该病，随着我国鸡养殖业的快速发展，近年来该病在我国肉鸡养殖区呈局部流行趋势，通过对万方和维普数据库搜索，近2年该病以血清4型流行为主。该病目前无疫苗预防，肉鸡临床发生包涵体肝炎时常见的抗病毒和抗菌治疗效果不佳，治愈率低于40％，耐过鸡发育受阻，与正常肉鸡比较，料肉比高7-13％，出栏时间延长7-12天，发育不整齐，严重影响经济效益。技术实现要素：为解决现有鸡包涵体肝炎无法用疫苗预防的问题，本发明提出一种鸡包涵体肝炎病毒，该病毒与转移因子制备成疫苗能够有效防控该病毒引起的疾病。本发明的技术方案是这样实现的：一种鸡包涵体肝炎病毒，所述病毒为禽腺病毒I群血清4型病毒，命名为SDJ15-8，其保藏号为CCTCCNO:V201636，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，由本公司于2014年3月从山东济南市章丘市辛寨镇大高村肉鸡养殖场发鸡包涵体肝炎的27日龄AA肉鸡肝脏中分离鉴定，命名为SDJ15-8，基因序列在Genbank注册号为KU589231。鸡包涵体肝炎病毒株第7代含毒SPF鸡胚尿囊液(E7)，能被鸡包涵体肝炎病毒血清4型抗体中和。鸡包涵体肝炎病毒在制备鸡包涵体肝炎灭活疫苗中的应用。本发明的另一个目的是提供一种鸡包涵体肝炎灭活疫苗，包括抗原和转移因子佐剂，所述抗原为灭活的权利要求1所述的鸡包涵体肝炎病毒。进一步，所述鸡包涵体肝炎病毒是被甲醛灭活的。本发明的在一个目的是提供一种鸡包涵体肝炎灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)接种：将权利要求1所述的鸡包涵体肝炎病毒用灭菌生理盐水稀释后经卵黄囊接种于SPF鸡胚，37℃进行静置孵化，收集48～120小时内死亡的鸡胚，收获尿囊液和胚体，其中胚体捣碎用生理盐水稀释得到胚体液；2)灭活：将检验合格的尿囊液与胚体液均按体积2:1混匀得到混合鸡胚液，用灭活剂进行灭活处理，并对灭活后的进行检验；3)疫苗制备：将步骤2)检验合格的灭活混合鸡胚液与转移因子进行混合，再加入灭菌生理盐水即可。进一步，步骤2)中所述灭活剂为甲醛，向混合鸡胚液加入甲醛至其甲醛总浓度为0.2wt％,密闭后置37℃灭活24小时,离心，弃去沉淀物，收集上清液。进一步，还包括分装：定量分装，加盖密封，2～8℃保存。种毒免疫原性检验1、鸡包涵体肝炎灭活疫苗制备E7含毒尿囊液96.0ml，加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃灭活24小时，期间振摇4～6次。2、鸡包涵体肝炎灭活疫苗无菌检验按现行《中华人民共和国兽药典》检验，应无菌生长。3、鸡包涵体肝炎灭活疫苗安全检验疫苗皮下或肌肉注射4～5周龄SPF鸡10只，2.0ml/每只。饲养观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。4、免疫接种5日龄白羽肉鸡雏20只，分为2组，每组10只。第一组颈背部皮下注射鸡包涵体肝炎灭活疫苗0.3ml；第二组为对照组，不做任何处理，两组鸡雏隔离饲养。在第一组免疫后15日，上述2组鸡雏用100LD50的鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株攻毒，观察10日，统计各组鸡雏发病死亡情况(鸡发病标准参照《兽医传染病学》，第五版中369页的【临诊症状及病理变化】)。6、结果第一组鸡雏在攻毒后6天有2只表现出临床发病症状，其余8只健活，整组鸡雏无死亡；第二组鸡雏在攻毒后2-3天表现出临床发病症状，死亡7只。结果说明鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株免疫原性良好。本发明制备的鸡包涵体肝炎病毒灭活疫苗在使用时对肉鸡雏和肉种鸡基本无应激导致的采食下降和精神萎靡等副反应，与蜂胶、油佐剂疫苗比较具有更好的安全性。用于预防血清4型的鸡包涵体肝炎病毒有效率90％以上，预防保护期长达3个月。无母源抗体的商品肉鸡在5-8日龄时颈部皮下注射免疫0.3-0.5ml，可从16-18日龄开始保护至出栏上市；肉种鸡在5-8日龄进行基础免疫，在开产前15日进行加强免疫0.8-1.0ml，所产种蛋孵化的鸡雏具有鸡包涵体肝炎病毒血清4型母源抗体，保护期至少15日，结合肉鸡在5-8日龄时免疫，可使商品肉鸡在整个生长周期内(45天左右)获得对鸡包涵体肝炎病毒血清4型的坚强保护。疫苗中作为免疫佐剂的转移因子有非特异性增强机体免疫功能，使肉鸡发育整齐、抗病力强，大肠杆菌等细菌性疾病感染率明显下降，提高养殖收益和减少抗生素用量，是生产绿色食品的好帮手。具体实施方式实施例11、抗原制备1.1接种将种毒用灭菌生理盐水作15000倍稀释，经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，用蜡封孔，于37℃静置孵化。1.2孵育和观察弃去48小时前死亡的鸡胚，以后每隔6小时照蛋1次，收集48～120小时内死亡的鸡胚，于2～8℃冷藏12～24小时。1.3收获鸡胚用碘酊消毒蛋壳表面气室部，无菌操作除去气室部蛋壳，收获尿囊液和胚体。其中，尿囊液置于灭菌的500ml玻璃瓶内，装量为450ml/瓶，标记为鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株E8，置-20℃及以下温度保存；胚体用组织捣碎机捣碎，按质量体积比用生理盐水1:1稀释，于4℃和-20℃反复冻融2次，于4℃条件下12000rpm离心30分钟，收集上清，过滤除菌，分装，标记为鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株胚毒。将鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株E8和鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株胚毒以瓶为单位，按现行《中华人民共和国兽药典》附录检验，应无细菌生长。将无菌检验合格的鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株E8和胚毒按体积2:1混合、摇匀，即为抗原。抗原取样检测鸡包涵体肝炎病毒含量为10-6.75ELD50/0.1ml。2抗原灭活将抗原加入终浓度为0.2wt％甲醛溶液(含36～40wt％甲醛)，密闭后置37℃灭活24小时(其间4～6小时振摇1次，每次3分钟)后，经4000转/分钟离心20分钟，弃去沉淀物，收集上清液，4℃保存。3抗原灭活检验3.1无菌检验无菌操作取3.2中上清液，按现行《中华人民共和国兽药典》检验，应无细菌生长。3.2灭活检验无菌操作取3.2中无菌检验合格上清液，经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，用蜡封孔，37℃静置孵化，观察至168小时，SPF鸡胚应全部健活，胚体无鸡包涵体肝炎感染导致的典型病变。4疫苗的制备4.1疫苗1取灭活检验合格的抗原200ml，加入转移因子(多肽含量16.4mg/ml)并补充注射用水，使多肽终浓度为1mg/ml、抗原含量为10-5.0ELD50/0.1ml，分装，-4℃保存。4.2疫苗2取灭活检验合格的抗原200ml，加入转移因子(多肽含量16.4mg/ml)并补充注射用水，使多肽终浓度为2mg/ml、抗原含量为10-5.0ELD50/0.1ml，分装，-4℃保存。4.3疫苗3取灭活检验合格的抗原200ml，加入转移因子(多肽含量16.4mg/ml)并补充注射用水，使多肽终浓度为1mg/ml、抗原含量为10-6.0ELD50/0.1ml，分装，-4℃保存。4.4疫苗4取灭活检验合格的抗原200ml，加入转移因子(多肽含量16.4mg/ml)并补充注射用水，使多肽终浓度为2mg/ml、抗原含量为10-6.0ELD50/0.1ml，分装，-4℃保存。4.5疫苗5取灭活检验合格的抗原200ml，加入转移因子(多肽含量16.4mg/ml)，使多肽终浓度为1mg/ml，分装，-4℃保存。4.6疫苗6取灭活检验合格的抗原200ml，加入转移因子(多肽含量16.4mg/ml)，使多肽终浓度为2mg/ml，分装，-4℃保存。5疫苗检验5.1无菌检验取4中的疫苗1-6，按按现行《中华人民共和国兽药典》检验，均无细菌生长。5.2安全性检验取4中的疫苗1-6，分别皮下或肌肉注射4～5周龄SPF鸡10只，2.0ml/只。隔离饲养，观察14日，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。实施例21、5日龄雏鸡试验1.1方法5日龄AA肉鸡雏140只，分为7组，每组20只，1-6组分别经肌肉注射鸡包涵体肝炎转移因子佐剂灭活疫苗1-6，0.3ml/只，7组为对照组，不做任何处理。在免疫后15天，对1-7组所有鸡雏肌肉注射接种鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只，接种病毒后观察10天，统计各组鸡雏发病及死亡情况。1.2结果当疫苗灭活前抗原的病毒含量≥10-6.0ELD50/0.1ml、多肽含量2mg/ml时，可100％保护鸡雏，具体结果见表1。表1各组鸡雏发病率与保护率分组1234567发病率％1555000100死亡率％00000080保护率％859595100100100028日龄雏鸡试验2.1方法8日龄AA肉鸡雏140只，分为7组，每组20只，1-6组分别经肌肉注射鸡包涵体肝炎转移因子佐剂灭活疫苗1-6，0.5ml/只，7组为对照组，不做任何处理。在免疫后15天，对1-7组所有鸡雏肌肉注射接种鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只，接种病毒后观察10天，统计各组鸡雏发病及死亡情况。2.2结果当疫苗灭活前抗原的病毒含量≥10-5.0ELD50/0.1ml、多肽含量2mg/ml时，可100％保护鸡雏，结果见表2。表2各组鸡雏发病率与保护率分组1234567发病率％1000000100死亡率％00000070保护率％9010010010010010003讨论对5日龄和8日龄鸡雏的预防保护试验表明：鸡包涵体肝炎病毒转移因子佐剂灭活疫苗的预防保护率与免疫接种剂量、抗原灭活前的病毒含量和转移因子含量有关。在抗原灭活前的病毒含量相同条件下，转移因子含量增加对提高疫苗保护率有明显作用。疫苗以抗原含量≥10-6.0ELD50/0.1ml、多肽含量2mg/ml(疫苗4)为佳，可100％保护强毒攻击。鸡包涵体肝炎病毒灭活疫苗分装按4.4制备疫苗，即为鸡包涵体肝炎病毒灭活疫苗，分装，装量250ml/瓶，于2-8℃保存。无菌检验和安全性检验合格。实施例3鸡包涵体肝炎病毒灭活疫苗免疫不同日龄鸡雏后产生保护性抗体最早时间试验15日龄雏鸡试验1.1方法5日龄AA肉鸡雏120只，分为12组，每组10只，1-6组分别经肌肉注射免疫鸡包涵体肝炎病毒血清4型转移因子佐剂灭活疫苗0.3ml/只，7-12组为对照组，不做任何处理。在免疫后8、9、10、11、12、13天时，分别对1和7组、2和8组、3和9组、4和10组、5和11组、6和12组的所有鸡雏肌肉注射接种鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只。上述各组接种病毒后观察10天，统计各组鸡雏发病及死亡情况。1.2结果各攻毒对照组发病率100％、死亡率＞70％，免疫疫苗组100％保护是在免疫后11天，说明5日龄鸡雏免疫疫苗0.3ml/只，完全产生保护性抗体的最早时间是在免疫后11天，具体结果见表3。表3各组鸡雏发病率与保护率28日龄雏鸡试验2.1方法8日龄AA肉鸡雏120只，分为12组，每组10只，1-6组分别经肌肉注射免疫鸡包涵体肝炎病毒血清4型转移因子佐剂灭活疫苗0.5ml/只，7-12组为对照组，不做任何处理。在免疫后8、9、10、11、12、13天时，分别对1和7组、2和8组、3和9组、4和10组、5和11组、6和12组的所有鸡雏肌肉注射接种鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只。上述各组接种病毒后观察10天，统计各组鸡雏发病及死亡情况。2.2结果各攻毒对照组发病率100％、死亡率＞60％，免疫疫苗组100％保护是在免疫后10天，说明8日龄鸡雏免疫疫苗0.5ml/只，完全产生保护性抗体的最早时间是在免疫后10天，结果见表4。表4各组鸡雏发病率与保护率3讨论5日龄和8日龄鸡雏分别免疫疫苗0.3ml/只和0.5ml/只，完全产生保护性抗体的最早时间分别是在免疫后11天和10天，最早保护时间的差异可能与疫苗接种剂量有关。实施例4鸡包涵体肝炎病毒灭活疫苗免疫持续期试验1方法5日龄AA肉鸡雏80只，分为8组，每组10只，1-4组分别经肌肉注射免疫鸡包涵体肝炎血清4型转移因子佐剂灭活疫苗0.3ml/只，5-8组为对照组，不做任何处理。在免疫后1、2、3、4个月时，分别对1和5组、2和6组、3和7组、4和8组的所有鸡雏肌肉注射接种鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只。上述各组接种病毒后观察10天，统计各组鸡雏发病及死亡情况。2结果攻毒对照组鸡雏发病率100％、死亡率＞60％，疫苗免疫组100％保护的持续期为3个月，具体结果见表5。表5各组鸡雏发病率与保护率实施例5鸡包涵体肝炎病毒灭活疫苗保存期试验1方法取于2-8℃保存的鸡包涵体肝炎病毒血清4型转移因子佐剂灭活疫苗，于保存6、8、10、12和15个月时分别接种10只5日龄AA肉鸡雏0.3ml/只，同时设10只对照，在接种疫苗后15日分别对免疫组和对照组鸡雏肌肉注射接种鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只，接种病毒后观察10天，统计各组鸡雏发病及死亡情况。2结果对照组鸡雏发病率均为100％，死亡率＞60％，保存6、8、10、12个月疫苗接种组雏鸡100％保护，保存15个月的疫苗接种组有3只鸡雏发病，但未死亡。所以确定疫苗保存期为：2-8℃保存，有效期12个月。实施例6鸡包涵体肝炎病毒灭活疫苗接种肉种鸡后母源抗体对子代的保护期肉种鸡在5-8日龄时首次免疫鸡包涵体肝炎病毒血清4型转移因子佐剂灭活疫苗0.3-0.5ml/只，在开产前15日再次免疫0.8-1.0ml/只，用该种鸡所产种蛋孵化鸡雏80只，分为4组，每组20只，对1-4组鸡雏在10、15、20和30日龄时分别肌肉注射接种鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株100LD50/只，接种病毒后观察10天，统计各组鸡雏发病及死亡情况。结果显示：1和2组鸡雏全部健活，未出现鸡包涵体肝炎临床发病症状；第3组有1只发病，其余健活，发病鸡雏未死亡；第4组有8只发病，其余健活，发病鸡雏死亡5只。说明母源抗体可100％保护至少15日。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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