专利名称：用于加工包涵体的方法
用于加工包涵体的方法发明背景发明领域本申请涉及用于纯化包括抗体和抗体片段的重组蛋白的方法。适当地，这些方法使用深层过滤来从一种溶解的混合物中澄清所希望的蛋白质，并且提供了重折叠方法以及重折叠缓冲液从而允许将这些重组蛋白重折叠为有功能并且有活性的蛋白质。
背景技术：
重组蛋白，并且特别是抗体和抗体片段的纯化可以是一种经常涉及的、劳动力密集的并且费时的过程。重组蛋白从细菌细胞培养物的生产产生了与来自该细胞的包涵体相关联的所希望的蛋白质。通常，使用澄清将所希望的蛋白质从包涵体分离，该澄清利用离心和深层过滤、深层过滤和切向流过滤的组合，或单独的切向流过滤。典型地使用这些用于澄清的组合方法，从而使得能够充分地澄 清并且预防在进一步的下游的纯化柱的沾污。分离之后，这些蛋白质可以进而被重折叠为一种有活性的并且有功能的形式。对于复合蛋白质(例如包含可变重(Vh)链和可变轻(')链的抗体片段)的澄清，使纯化步骤的数目最小化通常导致增加的产品收率和纯度、以及减少的生产时间和成本。美国专利号7，355，012 (下文中“‘012专利”)，它的披露通过引用以其全文结合于此，披露了用于结合至CD22-表达细胞(尤其是在它们的外表面上表达CD22的癌细胞)的抗体。‘012专利描述了具有\链(具有抗体RFB4的序列)以及Vh链(具有抗体RFB4的序列)的抗-CD22抗体，其中Vh链的CDR3的残基100、100A以及100B (如Kabat与Wu编号系统所编号)具有选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成:THW、YNW、TTW、以及STY。‘012专利描述了通过经重组方法而产生整个的、全长的抗体片段，随后通过纯化和重折叠来生产抗-CD22抗体。但是，对于其中各部分(例如抗体或抗体片段的Vh和\部分)在不同的细胞培养物中(或甚至在相同的细胞培养物中)分开生产的重组蛋白制备而言，需要纯化方法来提供有效的、高纯度并且高收率的蛋白质生产。优选实施例概述以上所识别的需要由提供重组蛋白的纯化方法的本申请来满足。在实施例中，提供了用于将一种重组蛋白从一种包括该重组蛋白和包涵体的混合物中纯化的方法。这些方法适当地包括用一种溶解缓冲液来溶解包含该重组蛋白连同相关包涵体的混合物，用一个或多个深层过滤器将该重组蛋白从该溶解的混合物中进行澄清，并且回收澄清的重组蛋白。适当地，这些方法不包括在该澄清之前将重组蛋白与包涵体的溶解的混合物进行离心。在示例性实施例中，该重组蛋白包括一种抗体或一种抗体片段，该抗体或抗体片段含有一种重链(Vh)抗体片段或一种轻链(')抗体片段，如例如抗-CD22抗体片段。示例性的溶解缓冲液包括乙醇胺、精氨酸、EDTA、尿素以及DTE，例如大约20mM至大约70mM乙醇胺，大约200mM至大约2M精氨酸，大约ImM至大约3mM EDTA,大约5M至大约IOM尿素以及大约5mM至大约20mM DTE，其pH为大约10至大约11。
在实施例中，该重组蛋白是用两个或更多个深层过滤器澄清，这些深层过滤器适当地呈系列，例如一个包含纤维素纤维和硅藻土的、并且具有大约0.1 μ m至大约I μ m的标
称的微米额定值的第一深层过滤器(例如COHC深层过滤器(:MlLIJPOREii ))，以及一个包含纤维素纤维和硅藻土的、并且具有小于大约0.1 μ m的标称的微米额定值的适合的第二深层过滤器(例如，XOHC深层过滤器(M1LL1PORE*))。这些方法适当地进一步包括:将浓缩的、澄清的重组蛋白在蛋白质重折叠缓冲液中进行稀释，该缓冲液包括大约20mM至大约70mM乙醇胺，大约0.5M至大约2M精氨酸，大约0.5mM至大约3mM EDTA,以及大约0.5mM至大约1.5mM GSSG ;将稀释的澄清的重组蛋白在大约9至大约10的pH并且在大约2。C至大约15° C的温度孵育大约48小时至大约96小时；并且回收重组蛋白。还提供了一种生产包含Vh抗体片段和\抗体片段的重组抗体片段的方法。这些方法适当地包括:在一个第一细菌细胞中表达一种对Vh抗体片段进行编码的多核苷酸，并且在一个第二细菌细胞中表达一种对\抗体片段进行编码的多核苷酸。将该Vh抗体片段和该\抗体片段进行混合，从而产生一种混合物，其中该混合物进一步包括包涵体。将包括该Vh抗体片段、该\抗体片段连同相关包涵体的混合物用一种溶解缓冲液来溶解。用一个或多个深层过滤器将该Vh抗体片段和该'抗体片段从该溶解的混合物中澄清，并且回收澄清的Vh抗体片段和澄清的'抗体片段。适当地，该方法不包括在使用深层过滤的澄清之前将Vh抗体片段、Vl抗体片段以及包涵体的溶解混合物进行离心。将澄清的Vh抗体片段和澄清的'抗体片段进行浓缩，并且然后用一种重折叠缓冲液进行稀释，该缓冲液包括:大约20mM至大约70mM乙醇胺；大约0.5M至大约2M精氨酸；大约0.5mM至大约3mM EDTA ;以及大约500mM至大约1.5mM GSSG。将稀释的澄清的Vh抗体片段与稀释的澄清的八抗体片段在大约9至大约10的pH以及在大约10° C至大约15° C的温度孵育大约48小时至大约96小时。然后回收重组抗体片段。如在此所述的，适当地，该Vh抗体片`段是一种抗-⑶22Vh抗体片段，并且该\抗体片段是一种抗-⑶22'片段，并且该重组抗体片段是一种抗-⑶22抗体片段。示例性的溶解和重折叠缓冲液在此描述，用于深层过滤的方法亦如此。下文参考附图详细描述了另外的实施例，这些实施例的特征、优点以及不同实施例的结构和操作。附图简要说明
图1A显示了抗-⑶22抗体在第一组重折叠条件下重折叠之后的反相高效液相色谱质谱(RP-HPLC-MS )分析的结果。图1B显示了抗-⑶22抗体在第二组重折叠条件下重折叠之后的RP-HPLC-MS分析的结果。图1C显示了抗-⑶22抗体在第三组重折叠条件下重折叠之后的RP-HPLC-MS分析的结果。图1D显示了抗-⑶22抗体在第四组重折叠条件下重折叠之后的RP-HPLC-MS分析的结果。图2A显示了抗-⑶22抗体在重折叠的时间=0处的RP-HPLC-MS分析的结果。
图2B显示了抗-⑶22抗体在重折叠的时间=20小时处的RP_HPLC_MS分析的结果。图2C显示了抗-⑶22抗体在重折叠的时间=90小时处的RP_HPLC_MS分析的结果。图3A显示了在进一步纯化之后指示抗-⑶22抗体片段的存在的RP_HPLC_MS结
果O图3B显示了在进一步纯化之后指示抗-⑶22抗体片段的存在的RP_HPLC_MS结
果O图4A显示了在时间=0处的5kg重折叠反应的RP-HPLC-MS分析。图4B显示了在时间=15小时处的5kg重折叠反应的RP_HPLC_MS分析。图4C显示了在时间=24小时处的5kg重折叠反应的RP_HPLC_MS分析。图4D显示了在时间=39小时处的5kg重折叠反应的RP_HPLC_MS分析。图5A显示了在时间=0处的IOOkg重折叠反应的RP-HPLC-MS分析。图5B显示了在时间=24小时处的IOOkg重折叠反应的RP_HPLC_MS分析。图5C显示了在时间=48小时处的IOOkg重折叠反应的RP_HPLC_MS分析。
图显示了在时间=70小时处的IOOkg重折叠反应的RP-HPLC-MS分析。图6显示了证实重折叠的抗-⑶22抗体片段的存在的蛋白质印迹。优选实施例的详细说明应理解的是在此所显示的并且描述的具体的实现方式是实例并且不是旨在另外地以任何方式限制本申请的范围。在此引用的公开的专利、专利申请、网站、公司名称、以及科学文献都通过引用以其全文结合在此，其程度等同于如各自被特定地并且个别地指出以通过引用被结合。在此引用的任何参考资料与本说明书的传授内容之间的任何冲突应以支持后者的方式解决。同样，一个词或短语的领域理解的定义与如在本说明书中确切所传授的该词或短语的定义之间的冲突应以支持后者的方式解决。如在本说明书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”确切地还包括它们所涉及的术语的复数形式，除非该内容清楚地另外指明。如在此所使用，术语“大约”是指近似地、在区域中、粗略地、或在周围。当术语“大约”与数值范围连在一起使用时，它通过将边界延伸到所提出的数值以上和以下来修饰那个范围。大体上，术语“大约”在此用来按一个数值的设定值以上或以下20%的变化而对该数值进行修饰。除非另外定义，在此使用的技术和科学术语具有本领域的普通技术人员通常所理解的、本申请涉及的意义。在此引用了本领域普通技术人员已知的各种方法学和材料。提出重组DNA技术总则的标准的参考作品包括萨姆布鲁克(Sambrook)等人，《分子克隆:实验室手册》(“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”)第二版,冷泉港实验室出版社，纽约(1989);考夫曼(Kaufman)等人编写，《医学生物学分子和细胞方法手册》(“Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine”)，CRC 出版社，波卡拉顿(1995);以及麦克弗森(McPherson)编写，《定向诱变:实用方法》(“DirectedMutagenesis:A Practical Approach”)，IRL出版社，牛津(1991),这些作品各自的披露通过引用以其全文结合在此。在实施例中，提供了用于纯化包括抗体和抗体片段的重组蛋白的方法。在一个实施例中，提供了用于将一种重组蛋白从一种包括该重组蛋白和包涵体的混合物中纯化的方法。这些方法适当地包括用一种溶解缓冲液来溶解包含该重组蛋白连同相关包涵体的混合物，用一个或多个深层过滤器将该重组蛋白从该溶解的混合物中进行澄清，并且回收澄清的重组蛋白。在实施例中，该方法不包括在澄清重组蛋白之前将重组蛋白与内涵体的溶解混合物进行离心。如在此使用的术语“纯化”用来意指一个过程，通过该过程所希望的重组蛋白或多种重组蛋白从其他的蛋白质或不希望的产物或结构中去除，使得希望的蛋白质或多种蛋白质是至少大约75%地不含有其他产物，至少大约80%地不含有其他产物，至少大约90%地不含有其他产物，更适合地至少大约95%地不含有其他产物，并且最适合地至少大约98%地不含有其他产物。如在此使用的，“重组蛋白”是指使用任何适合的表达系统(包括原核和真核表达系统)或使用噬菌体展示方法(参见例如道尔(Dower)等人，W091/17271以及麦考夫迪(McCafferty)等人，W092/01047 ;以及美国专利号5，969，108，通过引用以它们的全文结合于此)生产的肽、多肽或蛋白质。应理解的是术语“蛋白”(“protein”)以及“蛋白质”(“proteins”)在全文被可互换地使用。如在此使用的术语“肽”或“多肽”是指一种优选地从α -氨基酸、D-氨基酸、L-氨基酸、及其组合的限定顺序连接而形成的聚合物。在一个氨基酸残基与下一下之间的连接称为一个酰胺键或一个肽键。蛋白质是具有多个多肽亚基的多肽分子。区别在于肽通常是短的而多肽/蛋白质通常是较长的氨基酸链。术语“蛋白质”旨在还包括衍生的分子，例如糖蛋白以及脂蛋白连同低分子量的多肽。“氨基酸序列”以及类似的术语，例如“多肽”或“蛋白质”，不是意为将所指示的氨基酸序列限制为与列举的蛋白质分子相关联的完整的、天然的氨基酸序列。使用各种宿主细胞(例如细菌、植物、酵母、昆虫以及哺乳动物细胞)生产重组蛋白的方法是熟知的。例如，对于蛋白质的表达而言使用以下项的众多表达系统是可获得的 大肠杆菌(E.coli)、其他的细菌宿主、酵母、以及各种高等真核细胞(如例如，COS、CH0、海拉细胞(HeLa)以及骨髓瘤细胞系)。
简言之，对所希望的蛋白质进行编码的天然的或合成的核酸的表达通常是通过可操作地将DNA或cDNA连接到一个启动子(组成型或诱导型启动子)上、之后合并入一个表达盒中来完成。该表达盒可以适用于在原核或真核细胞系中的复制和整合。典型的表达盒包含转录和翻译终止子、起始序列、以及对编码该蛋白质的DNA的表达的调节有用的启动子。为了获得克隆基因的高水平表达，希望的是构建最少包含一个指导转录的强启动子、一个用于翻译起始的核糖体结合位点、以及一个转录/翻译终止子的表达盒。对于大肠杆菌(E.coli),这包括一个例如T7、色氨酸(trp)、乳糖(lac)、或λ启动子的启动子,一个核糖体结合位点以及一个转录终止信号。对于真核细胞，这些控制序列可以包括一个启动子以及衍生自免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒的一个增强子，以及一个聚腺苷酸化序列，并且可以包括剪接供体和受体序列。可以通过熟知的方法(例如对于大肠杆菌(E.coli)而言是氯化钙转化或电穿孔，而对于哺乳动物细胞而言是磷酸钙处理、或电穿孔或脂质体转染)将这些盒转移到所选择的宿主细胞中。经这些盒转化的细胞可以通过由包含在这些盒中的基因(例如amp、gpt、neo以及hyg基因)赋予的对抗生素的抗性而被选择。在宿主细胞中表达之后，这些重组蛋白通常与包涵体相关联，这些重组蛋白必须在进行重折叠之前从包涵体中被提取出来。在本方法中，将包括所希望的重组蛋白或多种重组蛋白与包涵体的混合物用一种溶解缓冲液来溶解。溶解缓冲液的实例包括本领域中已知的那些。例如,适合的溶解缓冲液包括还原剂以分离二硫键。示例性缓冲液可以包括Tris、胍、EDTA以及DTE。在实施例中，该溶解缓冲液包括乙醇胺、精氨酸、EDTA、尿素以及DTE。例如，该溶解缓冲液可以包括大约20mM至大约70mM乙醇胺，大约200mM至大约2M精氨酸，大约ImM至大约3mM EDTA,大约5M至大约IOM尿素以及大约5mM至大约20mM DTE，并且可以具有大约10至大约11的pH。适当地，该溶解缓冲液包括大约30mM至大约60mM乙醇胺，大约200mM至大约IM精氨酸，大约ImM至大约3mM EDTA,大约6M至大约9M尿素以及大约8mM至大约15mM DTE。更适当地，该溶解缓冲液包括大约40mM至大约60mM乙醇胺,大约400mM至大约600mM精氨酸,大约ImM至大约3mM EDTA,大约7M至大约9M尿素以及大约8mM至大约12mM DTE。最适当地，该溶解缓冲液包括大约50mM乙醇胺，大约500mM精氨酸，大约2mM EDTA,大约8M尿素以及大约IOmMDTE,并且具有大约10.5的pH。在包含所希望的重组蛋白或多种重组蛋白与包涵体的混合物的溶解之后，将重组蛋白或多种重组蛋白用一个或多个深层过滤器(适当地，两个或更多个深层过滤器)从溶解的混合物中进行澄清。如在此使用的，术语“澄清”(“clarify”)或“澄清”(“clarifying”)是指将所希望的重组蛋白质从溶解的混合物中进行分离，该分离是通过将所希望的蛋白质从不想要的蛋白质和其他材料中去除来进行，其中该不想要的材料保留在澄清介质(例如，过滤器)上。如在背景部分所讨论的，澄清典型地涉及将重组蛋白与包涵体的溶解混合物进行离心，随后进行深层过滤，或者深层过滤之后进行切向流过滤，或者仅进行切向流过滤。已经出人意料地发现，重组蛋白的澄清可以通过将溶解的混合物通过一个或多个深层过滤器来进行。因而，有利的是这些方法不包括在澄清之前将重组蛋白与包涵体的溶解混合物进行离心。此夕卜，这些方法适当地不包括在 深层过滤之后切向流过滤的使用。 在实施例中，这些方法特别地排除了在澄清之前将重组蛋白与包涵体的溶解混合物进行离心。已经确定的是排除离心步骤实质地影响本披露方法的基本的和新颖的特征。这些基本和新颖的特征包括但不局限于以下任何内容:典型地与离心相关联的时间的省略；典型地与离心相关联的能源成本的省略；典型地与离心相关联的设备成本的省略；以及典型地与离心相关联的过程无效率的省略。此外，去除了离心步骤允许在离心机不可获得的情况中(例如在小的优质生产规范(GMP)纯化场所中)的放大试验。因而，在适合的实施例中，提供了用于将一种重组蛋白从包含该重组蛋白与包涵体的混合物中纯化的方法，该方法基本上由以下内容组成:将包含该重组蛋白连同相关包涵体的混合物用溶解缓冲液进行溶解，将该重组蛋白用一个或多个深层过滤器从溶解的混合物中进行澄清，并且回收澄清的重组蛋白。在澄清步骤之前的离心步骤的添加被认为是对这种方法的实质性变更，并且因此被排除在这种基本上由所列举的步骤组成的方法之外。在再另外的实施例中，提供了用于将一种重组蛋白从包含该重组蛋白与包涵体的混合物中纯化的方法，该方法由以下内容组成:将包含该重组蛋白连同相关包涵体的混合物用溶解缓冲液进行溶解，将该重组蛋白质用一个或多个深层过滤器从溶解的混合物中进行澄清，并且回收澄清的重组蛋白。在此类实施例中，除了所列举的步骤之外不容许另外的步骤。将离心从在此所述的方法的澄清过程的省略提供了未期望的并且意料之外的结果，因为所希望的重组蛋白以与使用离心的方法至少一样高的量和纯度得以回收，同时提供了以上所鉴定的、基本的并且新颖的特征。没有意料到的是离心的省略会允许仅使用深层过滤的充分澄清。如在此使用的，“深层过滤”是指使用过滤器的过滤，这些过滤器包括多孔过滤介质，该介质允许颗粒遍及介质的截留，而不是仅仅在该介质的表面上。示例性的深层过滤介质和过滤方法在此描述或以其他方式在本领域中已知。在深层过滤之后，回收澄清的重组蛋白。
在示例性的实施例中，这些方法被用来纯化是一种抗体或抗体片段的重组蛋白。如在此使用的，术语“抗体”(“antibody”)或“抗体”(“antibodies”)是指所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD、以及IgE，包括其结合片段(S卩，能够特异性结合至一种抗体的靶分子的该抗体的片段，例如Fab、以及F(ab’)2片段)，连同重组的、人化的、多克隆的、以及单克隆的抗体和/或其结合片段。术语抗体还包括基因工程改造的形式，例如嵌合抗体(例如人化的鼠抗体)、复共轭抗体(heteroconjugate antibodies)(例如双特异性抗体)、重组的单链Fv片段(scFv)、以及二硫化物稳定的(dSFV)FV片段。典型地，抗体具有重链和轻链。每一重链和轻链包含一个恒定区和可变区(这些区域还称为“结构域”)。轻链和重链可变区包含由三个超变区中断的“框架”区，超变区又称为“互补决定区”或“⑶R”。已经定义了框架区和⑶R的范围。不同轻链或重链的框架区的序列在一个物种内是相对保守的。一个抗体的框架区，即组成物轻链和重链的组合的框架区，用于三维空间中⑶R的定位和对齐。⑶R主要负责结合至抗原的表位。每个链的⑶R典型地称为⑶R1XDR2、以及⑶R3(顺序地从N-末端开始编号)，并且还典型地通过特定⑶R位于其中的链而被鉴别。因而，Vh CDR3是位于它被发现于其中的抗体的重链可变区，而' CDRl是位于它被发现于其中的抗体的轻链可变区。对“VH”或“VH”的引用是指免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFV、dsFV或Fab。对“八”或“VL”的引用是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab。术语“单链Fv”或“scFv”是指其中传统的两链抗体的重链和轻链的可变区已经被连接形成一条链的抗体。典型地，一种连接肽被插入在这两条链之间从而允许适当的折叠以及活性结合部位的创造。术语“连接肽”包括提及一种在抗体结合片段(例如Fv片段)内的肽，该肽用于间接地使重链可变区结合至轻链可变区。适当地，溶解的并且澄清的混合物包括抗体片段(例如重链(Vh)抗体片段或轻链(')抗体片段)以及包涵体。在另外的实施例中，该混合物可以包括与包涵体相关联的Vh抗体片段和\抗体片段两者。当Vh抗体片段和\抗体片段两者存在于该混合物中时，Vh抗体片段与'抗体片段的比率被适当地调整以使得最终抗体片段的形成最大化。适当地，Vh抗体片段和 ' 抗体片段以大约1:1至大约1:20 (Vh比')、或大约20:1至大约1: 1、更适当地大约1:1至大约1:10、或大约10:1至大约1: 1、或最适当地大约1:1的初始摩尔比存在。
在示例性的实施例中，该Vh抗体片段是一种抗_CD22VH抗体片段，并且该'抗体片段是一种抗-⑶22'抗体片段。适当地，这些抗体片段是如在‘012专利中所披露的抗-⑶22片段。在‘012专利中披露的抗-CD22抗体具有可变轻链(具有抗体RFB4的序列)以及可变重链(具有抗体RFB4的序列)的，但是其中Vh链的⑶R3的残基100、100A以及100B (如Kabat与Wu编号系统所编号)具有选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成:THW、YNW、TTW、以及STY。如在此所述的，抗-⑶22抗体的Vh和\部分在混合物中的溶解和澄清允许随后重折叠成有功能的并且有活性的抗-CD22抗体片段。 如在‘012专利中所提出的，这些抗-⑶22抗体片段可以被共轭至不同的治疗剂(包括细胞毒性剂)，用于递送至由抗-⑶22抗体片段所靶向的特异性细胞。术语“治疗剂”包括当前已知的或后面开发的以充当抗-肿瘤药、抗-炎症药、细胞因子、抗感染药、酶激活剂或抑制剂、变构调节剂、抗生素或在患者中施用来引发所希望的治疗效果的其他药剂的任何数目的化合物。治疗剂还可以是一种毒素或一种放射性同位素，这是在预期的治疗效果例如为杀死癌细胞的情况下。示例性的毒素包括蓖麻毒素、相思子毒素、白喉毒素以及其亚基，连同肉毒杆菌毒素A至F。这些示例性的毒素中的一些从商业来源是可获得的(例如，西格马(Sigma)化学公司，圣路易斯，密苏里州)。在不例性的实施例中，该毒素是假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin) (PE)。如在此使用的术语“假单胞菌外毒素”是指全长天然的(天然发生的)PE或已经被修饰的PE。此类修饰可以包括但不局限于结构域Ia的消去，在结构域Ib、II以及III中不同氨基酸删除，单个氨基酸替换以及在羧基末端一个或多个序列的添加。如在此所述的，适当地这些方法使用一个或多个深层过滤器以用于重组蛋白的澄清。在示例性的实施例中，重组蛋白是用两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个等深层过滤器来澄清。用两个或更多个深层过滤器的澄清适当地包括:将溶解的混合物通过一个第一深层过滤器，随后通过将来自该第一深层过滤器的渗透物(包含重组蛋白)穿过一个第二深层过滤器(以及希望时另外的深层过滤器)来进一步澄清。在实施例中，该澄清包括将溶解的混合物通过一个包含纤维素纤维和硅藻土的第一深层过滤器。还可以使用用于深层过滤器的另外的过滤器介质。适当地，该第一深层过滤器具有大约0.1 μ m至大约I μ m的标称的微米额定值。然后该澄清进一步包括用一个第二深层过滤器进行澄清。那就是将来自该第一深层过滤器的渗透物穿过一个第二深层过滤器。适当地，该第二深层过滤器包括纤维素纤维和硅藻土。还可以使用用于深层过滤器的另外的过滤器介质。适当地，该第二深层过滤器具有小于大约0.1ym的标称的微米额定值。还可以使用另外的深层过滤器，其中将来自该第二深层过滤器的渗透物通过一个第三深层过滤器，以此类推。示例性的深层过滤器易于获得并且可以购自例如，MILLIP0RE ,比尔里卡，马萨诸塞州(MILLISTAK+ );颇尔公司(Pall Corporation)，华盛顿港市，纽约州(STAX ) ;3M 纯化公司(3M Purification Inc.) (CUNCf),梅里登(Meriden)，康涅狄格州(ZETA PLUS )；以及 BEGER0W，朗根隆斯海姆(Langenlonsheim)，德国。示例性的CUN0 过滤器包括 ZETA PLUS 过滤器 10SP05A、30SP10A、60SP30A 以及90SP60A。可以使用这样的过滤器，具有大约0.lL/min/ft2至大约0.5L/min/ft2的流速(例如大约0.2L/min/ft2)，具有大约15-40磅/in2 (PSI)的压力(例如大约25PSI)以及大约2-10L/ft2的输出量(例如大约5L/ft2)。在适合的实施例中，这些方法使用两个深层过滤器，例如，一个第一深层过滤器(是MILLIP0RE C0HC深层过滤器)以及一个第二深层过滤器(是MILLIP0RE X0HC深层过滤器)。这些深层过滤器被适当地用作MILLISTAK+ Pod—次性深层过滤器系统的部分，以提供可扩缩的过滤。适当地，COHC深层过滤器将具有一个大约7-8m2的表面积(例如7.70m2)，并且XOHC深层过滤器将具有一个大约5-6m2的表面积(例如5.50m2)。通过深层过滤器的流速和流体通量可以由本领域中的普通技术人员来确定并修改。大体上，用于澄清的通过这些深层过滤器的流速将是大约5至大约20L/min,更适当地大约6至大约16L/min。通过这些深层过滤器的通量大体上的范围将是:对于COHC过滤器而言为从大约40至大约150L/m2/小时(LMH)，并且对于XOHC过滤器而言为从大约60至大约200LMH，尽管还可以使用其他的流速和通量。这些方法适当地提供了大于大约50%、适当地大于大约60%、大于大约70%、大于大约80%、大于大约85%、大于大约90%、大于大约95%或大于大约98%的澄清的重组蛋白的收率。蛋白质收率是通过测量与澄清之前存在的重组蛋白相比，从澄清中回收的重组蛋白的
量来计算。这些澄清方法适当地包括澄清Vh和\抗体片段(包括抗-⑶22Vh和\抗体片段)的混合物。在其他实施例中，这些Vh和\片段可以分开澄清(例如在分开溶解之后)并且然后在重折叠之前进行合并，如在此讨论的。适当地，在整个纯化过程中这些Vh和\抗体片段可以保持分开，直到重折叠，由此允许最终的、折叠的抗体片段的一个更大的收率。在实施例中，这些方法进一步包括将该澄清的重组蛋白进行浓缩并且使该澄清的重组蛋白在一种蛋白质重折叠缓冲液中进行重折叠。适当地，该浓缩包括使用切向流过滤浓缩至一个大约lmg/mL至大约10mg/mL总蛋白(适当地大约5mg/mL总蛋白)的浓度。在示例性的实施例中，澄清的重组蛋白的重折叠包括将浓缩的、澄清的重组蛋白在一种蛋白质重折叠缓冲液中进行稀释。可以使用的适合的蛋白质重折叠缓冲液在本领域中是已知的，并且适当地包括Tris、L-精氨酸、氧化的谷胱甘肽(GSSG)以及EDTA。例如，适合的重折叠缓冲液可以包括在PH8的大约50mM至大约200mM Tris (例如大约IOOmM),大约IOOmM至大约IM L-精氨酸(例如大约500mM)，大约5mM至大约IOmM GSSG (例如大约8mM)以及大约0.5mM至大约4mM EDTA (例如大约2mM)。另外适合的蛋白质重折叠缓冲液包括大约20mM至大约70mM乙醇胺；大约0.5M至大约2M精氨酸，大约0.5mM至大约3mM EDTA,以及大约0.5mM至大约1.5mM GSSG，并且具有大约9至10的pH。在用蛋白质重折叠缓冲液稀释之后，将稀释的、澄清的重组蛋白在大约9至大约10的pH以及在大约2° C至大约15° C的温度孵育持续大约48小时至大约96小时。然后回收折叠的重组蛋白。已经确定的是与具有大约8或更小的pH的缓冲液相比，具有大约9至大约10的pH的重折叠缓冲液生产了更多的重折叠的最终蛋白质。在包含分开的Vh和\部分的抗体片段的情况下，将包含这些Vh和\部分两者一起的混合物稀释于适合的蛋白质重折叠缓冲液中，这允许这些Vh和'部分重折叠成包含Vh和\部分两者的功能性抗体片段。例如，可以将抗CD-22抗体片段的Vh和\部分混合在一起，进行澄清并且然后进行重折叠以形成全功能的抗-CD22抗体片段。可替代地，这些VH和VL片段可以在混合以及重折叠成功能性抗体片段之前分开地澄清，从而允许抗体片段的进一步修饰和纯化。例如，抗-⑶22抗体可以进一步共轭至一种治疗剂，包括细胞毒性剂，如在此以及在‘012专利中所述的，它的披露通过引用结合于此。如在此所述的，这些方法适当地包括重折叠重组蛋白。因而，在另外的实施例中，提供了一种蛋白质重折叠缓冲液用于将溶解的重组蛋白(包含抗体片段，例如抗-CD22抗体片段)进行重折叠。该蛋白质重折叠缓冲液适当地包括大约20mM至大约70mM乙醇胺；大约500mM至大约2M精氨酸；大约0.5mM至大约3mM EDTA ；以及大约0.5mM至大约1.5mMGSSG。适当地，该重折叠缓冲液具有大约9至大约10的pH。在示例性的实施例中，该蛋白质重折叠缓冲液包括大约30mM至大约60mM乙醇胺；大约800mM至大约1.5M精氨酸；大约ImM至大约3mM EDTA ;以及大约0.7mM至大约1.2mM GSSG。在另外的实施例中，该蛋白质重折叠缓冲液包括大约50mM乙醇胺；大约IM精氨酸；大约2mM EDTA ；以及大约0.9mMGSSG。适当地，该重折叠缓冲液具有一个大约9.5的pH。已经出人意料地发现，这些重折叠缓冲液的使用减少或消除了这些重组蛋白的谷胱甘肽加合物的存在，特别是抗体片段(例如抗-CD22抗体片段)的谷胱甘肽加合物。适当地，这些重折叠缓冲液减少了重组蛋白(例如一种抗体片段)的谷胱甘肽加合物的存在，使得最终重折叠的抗体片段包括小于大约40%的该抗体片段的谷胱甘肽加合物。更适当地，这些重折叠缓冲液将谷胱甘肽加合物减少至回收重组蛋白(例如抗体片段)的小于大约30%、小于大约20%、小于大约15%、小于大约10%、小于大约5%、小于大约2%、小于大约1%、或小于大约0.1%。在再另外的实施例中，提供了一种重折叠缓冲液，其基本上是由大约20mM至大约70mM乙醇胺、大约50 0mM至大约2M精氨酸、大约0.5mM至大约3mM EDTA、以及大约0.5mM至大约1.5mM GSSG组成。此类缓冲液排除实质性影响这些缓冲液的基本的和新颖的特征(特别是缓冲液使重组蛋白的谷胱甘肽加合物减少至小于大约30%的能力)的另外的组分。在再另外的实施例中，提供了重折叠缓冲液，其是由大约20mM至大约70mM乙醇胺、大约500mM至大约2M精氨酸、大约0.5mM至大约3mM EDTA、以及大约0.5mM至大约1.5mM GSSG组成，并且因而排除其他组分(但是可以包括水用于在必要时稀释)。在另外的实施例中，提供了将溶解的重组蛋白进行重折叠的方法。此类方法适当地包括将溶解的重组蛋白进行浓缩，并且将浓缩的重组蛋白在一种重折叠缓冲液中进行稀释。如在此所述，适当地该重折叠缓冲液包括大约20mM至大约70mM乙醇胺；大约500mM至大约2M精氨酸；大约0.5mM至大约3mM EDTA ；以及大约0.5mM至大约1.5mM GSSG。将稀释的重组蛋白在一个大约9至大约10的pH以及在一个大约2° C至大约15° C的温度孵育大约48小时至大约96小时。然后回收重折叠的重组蛋白。如在此所述，适当地该溶解的重组蛋白包括重组抗体或重组抗体片段。在示例性的实施例中，这些重组抗体片段包括重组Vh抗体片段以及重组\抗体片段，例如重组的抗-⑶22Vh抗体片段和重组的抗⑶22'抗体片段。适当地，将这些Vh和\片段在重折叠之前进行混合。在此所述的重折叠缓冲液的使用适当地减少了回收蛋白的谷胱甘肽加合物，使得回收的重折叠重组蛋白的小于大约30%是该重组蛋白的谷胱甘肽加合物。更适当地，回收的重折叠重组蛋白的小于大约20%、小于大约10%、小于大约5%、小于大约2%、小于大约1%或小于大约0.1%是该重组蛋白的谷胱甘肽加合物。在另外的实施例中，提供了一种生产包含Vh抗体片段和'抗体片段的重组抗体片段的方法。这些方法适当地包括:在一个第一细菌细胞中表达一种对Vh抗体片段进行编码的多核苷酸，并且在一个第二细菌细胞中表达一种对 '抗体片段进行编码的多核苷酸。在另外的实施例中，该Vh和\片段可以在相同的细菌细胞中生产。可替代地，这些Vh和\片段可以在不同类型的细胞(例如哺乳动物的或细菌的)中生产，或者可以在细菌细胞之外的细胞中一起生产。如在此所述的，生产重组蛋白的方法在本领域中是熟知的，并且适当地包括在一种宿主细胞中表达对不同蛋白质进行编码的多核苷酸。如在此使用的，细菌细胞包括任何可以在重组蛋白生产中使用的细菌细胞，包括大肠杆菌(E.coli)。将该Vh抗体片段和该\抗体片段进行混合,从而产生一种混合物,其中该混合物进一步包括内涵体。在V1^P'生产于相同的细胞中的实施例中，不需要将它们混合在一起。如在此所述的，使用细菌细胞的重组蛋白的生产产生了与包涵体相关联的所希望的蛋白质。将所希望的蛋白质在进一步折叠和纯化之前适当地从这些包涵体中澄清。将包括该￥11抗体片段、该'抗体片段连同相关包涵体的混合物用一种溶解缓冲液来溶解。用于在这些方法中使用的示例性溶解缓冲液在此描述并且适当地包括乙醇胺、精氨酸、EDTA、尿素以及DTE，例如大约20mM至大约70mM乙醇胺，大约200mM至大约2M精氨酸，大约ImM至大约3mM EDTA,大约5M至大约IOM尿素以及大约5mM至大约20mM DTE。该溶解缓冲液适当地具有大约10至大约11的pH，例如大约ρΗΙΟ.5。用一个或多个深层过滤器将该Vh抗体片段和该\抗体片段从该溶解的混合物中澄清。如在此所述的，这些方法不包括将Vh抗体片段、Vl抗体片段以及包涵体的溶解混合物进行离心。离心步骤的排除实质性影响了这些方法的新颖的和基本的特征，如在此所述。将澄清的Vh抗体片段和澄清的\抗体片段进行回收并且然后进行浓缩。将浓缩的澄清的Vh抗体片段和浓缩的澄清的\抗体`片段用一种重折叠缓冲液进行稀释。如在此所述，在适合的实施例中，该重折叠缓冲液包括大约20mM至大约70mM乙醇胺；大约500mM至大约2M精氨酸；大约0.5mM至大约3mM EDTA ；以及大约0.5mM至大约1.5mM GSSG,并且具有大约9-10的pH (适当地大约9.5)。将稀释的澄清的Vh抗体片段与稀释的澄清的\抗体片段在大约9至大约10的pH以及在大约2。C至大约15° C的温度孵育大约48小时至大约96小时。这允许该Vh抗体片段和该'抗体片段重折叠成有全部功能的并且有活性的抗体片段。然后回收该抗体片段(例如通过领域中已知的方法)从而回收和存储该抗体片段(如果希望的话)。如在此所述的，适当地，该Vh抗体片段是一种抗-⑶22Vh抗体片段，并且该\抗体片段是一种抗-CD22'片段，并且该重组抗体片段是一种抗-CD22抗体片段，例如在‘012专利中披露的那些。如在此所述，这些抗体片段可以进一步共轭至一种治疗的或有毒的药剂。
用两个或更多个深层过滤器将该Vh抗体片段和该\抗体片段适当地澄清，并且在示例性的实施例中是用两个深层过滤器。如在此所述，在使用深层过滤的澄清之前不使用离心。在实施例中，在澄清中使用的一个第一深层过滤器包括纤维素纤维和硅藻土，并且具有大约0.1 μ m至大约I μ m的标称的微米额定值(例如COHC深层过滤器)。这些方法适当地进一步包括将该￥11抗体片段以及该'抗体片段用一个第二深层过滤器进行澄清，该第二深层过滤器包括纤维素纤维以及硅藻土，并且其中该第二深层过滤器具有一个小于大约0.1 μ m的标称的微米额定值(例如XOHC深层过滤器)。如在此所述，已经确定的是排除离心步骤实质性地影响披露的方法的基本的和新颖的特征。因而，在实施例中，提供了方法，这些方法基本上由这些所叙述的步骤组成，或者在另外的实施例中，由这些所叙述的步骤组成，特别地将用深层过滤的澄清之前的离心步骤排除在外。在此所述的方法可以易于扩大至大的制造能力。例如，可以易于将这些方法扩大规模以使用大约100L至大约20，000L、适当地大约100L至大约10，000L、大约100L至大约5，000L、大约500L至大约1，000L，例如大约500L、大约600L、大约700L、大约800L、大约900L或大约1，000L的近似体积。对于相关领域的普通技术人员而言将容易清楚的是:可以对在此所述的方法和申请作出其他适合的修饰和改适，而不偏离任何这些实施例的范围。以下实例仅用于说明目的而被包含于此，并且不是旨在限制。实例实例1:抗-⑶22抗体片段纯化溶解抗-⑶22抗体片段的Vh和\部分是在大肠杆菌(E.coli)中通过重组克隆方法来生产。一旦确定了所希望的 重折叠质量，就将包涵体进行混合，使得对于每kg的重折叠质量，有0.56g的Vh和0.128g的Vl会发生反应。对于每Ig的\添加4.375g的Vh等效于1:1摩尔比。例如，IOkg重折叠需要5.6g的V1^P 1.28g的Vl。因为这些包涵体是65%的纯度并且每克包含0.16582g的蛋白质，所以5.6g的Vh的添加是通过添加181.60g的Vh溶液来完成。相似地，1.28g的\的添加是通过添加125.44g的\溶液来完成。然后将Vh和Vl (分别为26.91%和20%固体)的混合物用TE缓冲液(50mMTris，20mM EDTA，pH7.5)进行稀释从而创造一种含15%固体的混合物。将这些含15%包涵体的混合物各自用5体积的溶解缓冲液(50mM乙醇胺，0.5M精氨酸，2mM EDTA，8M尿素，以及IOmM DTE)来进行溶解。每个溶解反应产生了范围为从40.5至49.17μ g/mL的重折叠值。针对多重批次以及不同规模，各包涵体混合物已经在相似的条件下得以溶解。下表I展现了使用的溶解条件的总结。表I
权利要求
1.一种用于将重组蛋白从包括该重组蛋白和包涵体的混合物中纯化的方法，该方法包括: a)将包括该重组蛋白连同相关包涵体的该混合物用一种溶解缓冲液进行溶解； b)用一个或多个深层过滤器将该重组蛋白从该溶解的混合物中澄清；并且 c)回收该澄清的重组蛋白， 其中该方法不包括在该澄清之前将该重组蛋白与包涵体的溶解的混合物进行离心。
2.如权利要求1所述的方法，其中该重组蛋白包括一种抗体或一种抗体片段。
3.如权利要求2所述的方法，其中该抗体片段是一种重链(Vh)抗体片段。
4.如权利要求2所述的方法，其中该抗体片段是一种轻链(')抗体片段。
5.如权利要求2所述的方法，其中该重组蛋白包括一种Vh抗体片段和一种\抗体片段。
6.如权利要求3所述的方法，其中该Vh抗体片段是一种抗_CD22Vh抗体片段。
7.如权利要求4所述的方法，其中该\抗体片段是一种抗-CD22'抗体片段。
8.如权利要求5所述的方法，其中该Vh抗体片段与该\抗体片段以一个大约1:1的初始摩尔比存在。
9.如权利要求1所述的方法，其中该溶解缓冲液包括乙醇胺、精氨酸、EDTA、尿素以及DTE。
10.如权利要求9所述的方法，其中该溶解缓冲液包括大约20mM至大约70mM乙醇胺，大约200mM至大约2M精氨酸，大约ImM至大约3mM EDTA，大约5M至大约IOM尿素以及大约5mM至大约20mM DTE，并且其中该溶解缓冲液具有一个大约10至大约11的pH。
11.如权利要求1所述的方法，其中该重组蛋白是用两个或更多个深层过滤器进行澄清。
12.如权利要求11所述的方法，其中一个第一深层过滤器包括纤维素纤维以及硅藻土，并且其中该第一深层过滤器具有一个大约0.1 μ m至大约I μ m的标称的微米额定值。
13.如权利要求12所述的方法，进一步包括用一个第二深层过滤器进行澄清，其中该第二深层过滤器包括纤维素纤维以及硅藻土，并且其中该第二深层过滤器具有一个小于大约0.1 μ m的标称的微米额定值。
14.如权利要求13所述的方法，其中该第一深层过滤器是一个COHC深层过滤器并且该第二深层过滤器是一个XOHC深层过滤器。
15.如权利要求1所述的方法，其中该澄清的重组蛋白收率是大于大约70%。
16.如权利要求1所述的方法，进一步包括:d)将该澄清的重组蛋白进行浓缩并且使该澄清的重组蛋白在一种蛋白质重折叠缓冲液中进行重折叠。
17.如权利要求16所述的方法，其中该重折叠包括: a)在该蛋白质重折叠缓冲液中将该浓缩的澄清的重组蛋白进行稀释，该缓冲液包含大约20mM至大约70mM乙醇胺；大约0.5M至大约2M精氨酸；大约0.5mM至大约3mM EDTA ；以及大约0.5mM至大约1.5mMGSSG ； b)将该稀释的澄清的重组蛋白在一个大约9至大约10的pH以及在一个大约2°C至大约15° C的温度孵育大约48小时至大约96小时；并且 c)回收该重组蛋白。
18.一种用于使溶解的重组蛋白重折叠的蛋白质重折叠缓冲液，包括: 大约20mM至大约70mM乙醇胺；大约500mM至大约2M精氛酸；大约0.5mM至大约3mMEDTA ；以及大约0.5mM至大约1.5mMGSSG, 其中该重折叠缓冲液具有一个大约9至大约10的pH。
19.如权利要求18所述的蛋白质重折叠缓冲液，包括: 大约50mM乙醇胺；大约IM精氨酸；大约2mM EDTA ;以及大约0.9mM GSSG， 其中该重折叠缓冲液具有一个大约9.5的pH。
20.一种使溶解的重组蛋白重折叠的方法，包括: a)将该溶解的重组蛋白进行浓缩； b)将该浓缩的重组蛋白在一种重折叠缓冲液中进行稀释，该缓冲液包含: 大约20mM至大约70mM乙醇胺；大约500mM至大约2M精氛酸；大约0.5mM至大约3mMEDTA ；以及大约0.5mM至大约1.5mMGSSG ； c)将该稀释的重组蛋白在一个大约9至大约10的pH以及在一个大约2°C至大约15° C的温度孵育大约48小时至大约96小时；并且 d)回收该重折叠的重组蛋白。
21.如权利要求20所述的方法，其中该溶解的重组蛋白包括重组抗体或重组抗体片段。
22.如权利要求21所述的方法，其中重组抗体片段包括重组Vh抗体片段和重组\抗体片段。
23.如权利要求22所述的方法，其中这些重组Vh抗体片段包括重组的抗-⑶22Vh抗体片段，并且这些重组\抗体片段包括重组的抗-CD22'抗体片段。
24.如权利要求20所述的方法，其中少于10%的该回收的重折叠重组蛋白是重组蛋白的一种谷胱甘肽加合物。
25.—种生产包含Vh抗体片段和\抗体片段的重组抗体片段的方法，该方法包括: a)在一个第一细菌细胞内表达一种对Vh抗体片段进行编码的多核苷酸； b)在一个第二细菌细胞内表达一种对'抗体片段进行编码的多核苷酸； c)混合该Vh抗体片段和该\抗体片段，从而产生一种混合物，其中该混合物进一步包括包涵体； d)将包括该Vh抗体片段、该\抗体片段以及相关包涵体的该混合物用一种溶解缓冲液进行溶解； e)用一个或多个深层过滤器将该Vh抗体片段和该\抗体片段从该溶解的混合物中澄清； f)回收该澄清的Vh抗体片段和该澄清的'抗体片段， 其中该方法不包括将Vh抗体片段、Vl抗体片段以及包涵体的该溶解的混合物进行离心； g)将该澄清的Vh抗体片段和该澄清的\抗体片段进行浓缩； h)将该浓缩的澄清的Vh抗体片段和该浓缩的澄清的\抗体片段用一种重折叠缓冲液进行稀释，该缓冲液包括:大约20mM至大约70mM乙醇胺；大约0.5M至大约2M精氨酸；大约0.5mM至大约3mM EDTA ；以及大约0.5mM至大约1.5mM GSSG ；i)将该稀释的澄清的Vh抗体片段与该稀释的澄清的\抗体片段在一个大约9至大约10的pH以及在一个大约2° C至大约15° C的温度孵育大约48小时至大约96小时；并且 j)回收该重组抗体片段。
26.如权利要求25所述的方法，其中该Vh抗体片段是一种抗_CD22Vh抗体片段，并且该\抗体片段是一种抗-⑶22'片段，并且该重组抗体片段是一种抗-⑶22抗体片段。
27.如权利要求25所述的方法，其中该溶解缓冲液包括乙醇胺、精氨酸、EDTA、尿素以及 DTE。
28.如权利要求27所述的方法，其中该溶解缓冲液包括大约20mM至大约70mM乙醇胺，大约200mM至大约2M精氨酸，大约ImM至大约3mM EDTA，大约5M至大约IOM尿素以及大约5mM至大约20mM DTE,并且其中该溶解缓冲液具有一个大约10至大约11的pH。
29.如权利要求25所述的方法，其中该Vh抗体片段以及该\抗体片段是用两个或更多个深层过滤器澄清。
30.如权利要求29所述的方法，其中一个第一深层过滤器包括纤维素纤维以及硅藻土，并且其中该第一深层过滤器具有一个大约0.1 μ m至大约I μ m的标称的微米额定值。
31.如权利要求30所述的方法，进一步包括将该Vh抗体片段以及该\抗体片段用一个第二深层过滤器进行澄清，该第二深层过滤器包括纤维素纤维以及硅藻土，并且其中该第二深层过滤器具有一个小于大约0.1 μ m的标称的微米额定值。
32.如权利要求31所述的方法，其中该第一深层过滤器是一个COHC深层过滤器并且其中该第二深层过滤器是一个XOHC深层过滤器。
全文摘要
本申请涉及用于纯化包括抗体和抗体片段的重组蛋白的方法。适当地，这些方法使用深层过滤来从一种溶解的混合物中澄清所希望的蛋白质，并且提供了重折叠方法以及重折叠缓冲液从而允许将这些重组蛋白重折叠为有功能并且有活性的蛋白质。示例性抗体片段包括抗-CD22抗体片段，这些抗-CD22抗体片段包含重折叠为有功能并且有活性的片段的VH和VL链。
文档编号C07K1/00GK103168046SQ201180050519
公开日2013年6月19日 申请日期2011年10月20日 优先权日2010年10月20日
发明者E·T·奥康纳 申请人:米迪缪尼有限公司