桉树脑在制备抗产ESBLs大肠杆菌药物中的应用的制作方法

本发明属于医药领域，具体涉及牛至挥发油单体之一桉树脑在制备抗产ESBLs大肠杆菌药物中的应用。

背景技术：

细菌的多重耐药现象已成为严重的公共卫生威胁和世界关注的临床难题，造成了病死率的增高，医疗资源的浪费。在实际的临床治疗中，产ESBLs大肠杆菌的感染率较高，由于产生了超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectrum β-lactamases，ESBLs)，其耐药范围较广，意味着现有的抗感染药物的选择范围是有限的。我们除了选择现有的抗感染药物，并没有其他的办法来从根本上阻断或解决耐药问题。这就需要人们不断地去发展新型抗生素，但研发新型抗生素的速度远远赶不上细菌产生耐药的速度。

中药在感染性疾病防治中发挥着重要的作用，一直被用作寻求抗生素替代药物的重要资源库。如“对产ESBLs大肠杆菌有抑制作用的中草药初步筛选”，刘芬等（福建中医学院学报，2009年，第19卷第2期）研究了大青叶、五倍子、黄连等36种中药对产ESBLs大肠杆菌的抑菌作用，实验结果表明，部分中药对产ESBLs大肠杆菌具有不同程度的抑菌作用，其中以五倍子的抑菌效果最为明显，MIC（琼脂稀释法）为3.125mg/mL。

牛至在国内外广泛的用于抗感染以及预防治疗中，作为药食两用的中药材，具有可观的药用价值和使用价值。“牛至油和小檗碱联用对产ESBLs鸡大肠埃希菌的体外抗菌试验”（汤法银等，中国兽医杂志，2012年，第48卷第6期）的研究表明，牛至油对产ESBLs鸡大肠杆菌具有较强的抗菌活性，但未深入研究何种牛至油单体导致其产生上述抗菌活性。

技术实现要素：

本发明针对现有产ESBLs大肠杆菌药物的研究现状，深入研究发现在牛至挥发油中具有抑制产ESBLs大肠杆菌的活性单体为桉树脑，牛至挥发油单体之一桉树脑能够影响产ESBLs大肠杆菌耐药靶点--生物被膜的形成，这为缓解或解决产ESBLs大肠杆菌的感染，提高临床治疗有效率，降低病死率，节约医疗资源奠定了有意义的研究基础，为耐药菌的防治提出了新的研究思路，具有重要的研究意义。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1 是安徽产地的牛至挥发油的GC-MS色谱图；

图2 是硫酸庆大霉素对产ESBLs大肠杆菌生物被膜形成的抑制率；

图3 是桉树脑对产ESBLs大肠杆菌生物被膜形成的抑制率。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

利用索氏提取器，按《中国药典》2005版(一部)附录XD：水蒸气蒸馏法提取牛至全株(花、茎、叶)的挥发油，每次提取药材100 g，提取时间6 h，重复5次。收集挥发油，用无水硫酸钠干燥，冷藏24 h，使水、油两相分层，再用分液滤斗进行分离，滤得牛至的挥发油提取物：颜色-淡黄色透明，气味-具有浓郁芳香气味，置于长颈玻璃瓶中，4℃保存。试验选择安徽产地的牛至药材，经新疆维吾尔自治区中医院李永和主任药师鉴定，为唇形科植物牛至Origanum vulgare L.的干燥地上部分。

牛至挥发油化学成分的测定

通过GC-FID (gas chromatography equipped with a flame ionization detector, 气相色谱分析-火焰离子化检测器)和GC-MS联用技术，与标准谱库匹配，结合保留指数法并用峰面积归一化法测定各含量的相对百分含量，鉴定牛至挥发油提取物的化合物结构。

GC-MS联用技术检测条件：

(1)气相色谱条件：进样口温度250 ℃, 柱温40 ℃; 以5 ℃/min升到250 ℃保持10 min；流速：恒压模式1.0 ml/min，载气：氦气，分流比为100:1；接口温度：250 ℃；

(2)质谱条件：EI源，电子能量70 eV，离子源温度：200 ℃；溶剂切除时间：4min；检测器电压：1.08 KV;

(3)检索谱库：NIST 05、NIST 05s；

(4)进样量：0.2 μl。

安徽产地的牛至挥发油GC-MS色谱图如图1所示，与标准谱库匹配分析，化学成分分析结果见表1。

为保证成分的纯度，以购买的桉树脑标准品进行的耐药抑制研究。

表 1 安徽产地的牛至挥发油的化学成分

1、牛至挥发油对产ESBLs大肠杆菌的耐药抑制作用

采用肉汤稀释法：即用无菌肉汤将纯培养的菌液(产ESBLs大肠杆菌)稀释校正至0.5浓度的麦氏比浊管，按照1:100 (v/v)的比例加入到不同浓度梯度的药液、对照品溶液中，轻轻混匀，置37 ℃恒温培养箱，孵育24 h后，从每个试管中取出10 ml均匀的涂布到MH琼脂培养基上，置37 ℃恒温培养箱，孵育24 h后，计数。以上实验平行三次，应用平板菌落计数法，计算菌落数的平均值，分析牛至挥发油对产ESBLs大肠杆菌的抑制作用，测定MIC值与MBC值。与对照品比较，发现牛至挥发油提取物能明显的抑制耐药大肠杆菌的生长，结果表2。

表2 牛至挥发油对产ESBLs大肠杆菌的抑制作用

a 抑菌活性单位: mg/ml；

表2中，牛至挥发油对产ESBLs大肠杆菌具有一定的抑制作用。

2、桉树脑的耐药抑制作用

基于牛至挥发油对产ESBLs大肠杆菌的抑制作用，利用GC-MS联用技术，检测桉树脑为牛至挥发油的单体成分之一（见图1及表1）。因此，采用标准品桉树脑进行耐药性抑制作用的研究，实验操作同上。

桉树脑单体对产ESBLs大肠杆菌的抑制作用：

MIC: 206 μg/ml

MBC: 412 μg/ml

桉树脑对产ESBLs大肠杆菌的抑制作用较好。

3、桉树脑产ESBLs大肠杆菌生物被膜形成的影响

利用96微孔板技术筛选法，通过酶标仪检测桉树脑对产ESBLs大肠杆菌的OD值，计算不同浓度药液对产ESBLs大肠杆菌的抑制率，实验重复3次，结果取平均值，以抑制率为指标，分析桉树脑单品成分对产ESBLs大肠杆菌生物被膜形成的影响。

（1）对无菌操作台进行紫外灯照射灭菌；

（2）在96微孔板上, 除最边缘微孔，分别加90 µl稀释的菌液于每一微孔中；

（3）加90 µl的药液和10 µl的新鲜稀释的菌液在第一排微孔中；

（4）用移液枪进行梯度稀释，共稀释三个浓度，见表3。胡薄荷酮、桉树脑、香茅醇的浓度设置参考对产ESBLs大肠杆菌抑菌作用的浓度而设置的梯度。在37 ℃，5 % CO₂条件下培养24 h；

（5）阳性对照孔加入含10 µl菌液的营养肉汤，阴性对照孔加100 µl不含药物的营养肉汤，试验中将硫酸庆大霉素作为药液的对照组。

（6）在600 nm下测定吸收度 (OD₆₀₀值)；

（7） 倒去培养液。用蒸馏水冲洗3-10次微孔板，用吸水纸轻轻除去微孔板中的残余水分；将0.1 %结晶紫溶液加于每个微孔中，室温下保持15 min；

（8）用蒸馏水冲洗微孔板5次，加2 %去氧胆酸钠(SD)100 µl溶液到每个微孔；

（9）在λ max=600 nm下，测定吸收度 (OD值)。

对生物被膜形成的影响，以抑制率为指标，分析不同浓度桉树脑药液对产ESBLs大肠杆菌生物被膜形成的抑制率，桉树脑的药液浓度见表3，结果见表4，图2-图3。

抑制率(%)=(B-S)/(G-S)

B (Biofilm): 生物被膜检测OD值；

S (Standard):阴性对照的OD值；

G (Grow):细菌生长的OD值。

表 3 桉树脑的药液浓度

表 4 桉树脑对产ESBLs大肠杆菌生物膜形成的抑制率

通过多重比较(LSD法)，得硫酸庆大霉素的C₁和C₃的抑制率的差异具有显著性意义，P=0.026；桉树脑C₁和C₃的抑制率的差异具有显著性意义，P=0.043。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。