本发明涉及构建NO催化型纳米涂层的方法，尤其涉及一种在钛合金表面构建NO催化型纳米涂层的方法。
背景技术：
钛合金材料具有良好的机械性能和优异的耐腐蚀性能，在生物医用材料领域如骨材料、牙种植体、心血管植入材料等有着广泛的应用。但对于一些特殊应用的领域，如作为血管支架材料用于冠心病的治疗，其安全性和生物相容性还远未达到临床要求。其中，由于材料自体生物相容性不足引发的血栓及血管内再狭窄是制约其应用的主要问题。
技术实现要素：
为了解决现有技术中的问题，本发明提供了一种在钛合金表面构建NO催化型纳米涂层的方法, 通过该方法对钛合金材料表面进行生物化改性，可实现材料表面催化NO释放，进而提高材料的血液相容性，抑制内膜增生并刺激内皮再生。
本发明提供了一种在钛合金表面构建NO催化型纳米涂层的方法，包括以下步骤：
A、钛合金样品的制备与活化；
B、钛合金样品表面组装亲和素；
C、NO催化型纳米粒子的制备；
D、NO催化型纳米涂层的构建。
作为本发明的进一步改进，步骤A包括：钛合金样品表面经抛光处理后，浸入NaOH溶液中，活化反应，钛合金样品取出清洗后浸入双蒸水中，70 - 90℃条件下反应6 - 24小时，双蒸水超声清洗后，烘干待用。
作为本发明的进一步改进，步骤A包括：钛合金样品表面经抛光处理后，浸入浓度为1 - 3 mol/L的NaOH溶液中，70 - 90℃条件下活化反应6 - 24小时，钛合金样品取出清洗后浸入双蒸水中，70 - 90℃条件下反应6 - 24小时，双蒸水超声清洗后，37℃烘干待用。
作为本发明的进一步改进，步骤B包括：将A步骤中活化处理的钛合金样品浸入亲和素溶液中，静置反应，然后用磷酸盐缓冲液清洗钛合金样品，保存待用。
作为本发明的进一步改进，步骤B包括：将A步骤中活化处理的钛合金样品浸入0.1 - 0.5 mg/ml的亲和素溶液中，静置反应6 - 24小时，然后用磷酸盐缓冲液清洗钛合金样品，保存待用。
作为本发明的进一步改进，步骤C包括：配置硒代胱胺和多聚赖氨酸的溶液，与生物素化肝素溶液等体积混合，超声处理，即得NO催化型纳米粒子。
作为本发明的进一步改进，步骤C包括：配置含0.01 - 0.05 wt%硒代胱胺和0.03 - 0.1 wt%多聚赖氨酸的溶液，与浓度为10 - 20 mg/ml的生物素化肝素溶液等体积混合，超声处理5分钟，即得NO催化型纳米粒子。
作为本发明的进一步改进，所述含0.01 - 0.05 wt%硒代胱胺和0.03 - 0.1 wt%多聚赖氨酸的溶液的分子量为150 - 300 KDa。
作为本发明的进一步改进，步骤D包括：将B步骤中获得的钛合金样品浸泡于C步骤获得的NO催化型纳米粒子中，振荡反应6 - 24小时，双蒸水漂洗后即得。
作为本发明的进一步改进，所述B、C、D步骤中的反应温度均为37℃。
本发明的有益效果是：
一、利用不同生物分子之间的特异性作用，创造性的制备出一种具有NO催化活性的PLL/硒代胱胺/Hep纳米粒子，并用于钛合金表面生物化改性。
二、通过静电交互作用制备的纳米粒子，其内部生物分子活性得到较好的保持。同时，生物素-亲和素的结合体系稳定，纳米粒子特殊的三维结构也有利于控制生物分子的释放，从而能够实现长期调控血管内生物学应答。
三、纳米粒子涂层的构建工艺及固定方法均简单易操作，无需昂贵复杂的设备，工艺成本较低，可控制性强，效果显著。
四、钛合金表面亲和素的组装及纳米粒子的固定均采用浸泡方式进行，可保证材料各个部分能均匀的固定上生物分子，有利于实现各种结构复杂的器械表面的生物功能化修饰，适用范围广。
附图说明
图1为钛合金表面NO催化型纳米涂层的构建，（A）钛合金的表面活化及亲和素的组装；（B）NO催化型纳米粒子的制备及固定。
图2为纳米粒子粒径分布检测结果。
图3为不同样品表面傅立叶红外光谱结果。其中，A为钛合金；B为碱热活化的钛合金；C为纳米粒子改性的钛合金表面。
图4 为NO催化效率检测结果。其中，A为钛合金，B为纳米粒子改性的钛合金表面。
图5为NO供体加入前后，样品表面血小板粘附2小时后的荧光染色结果。
图6为NO供体存在条件下，血管内皮细胞和平滑肌细胞在样品表面培养3天后的荧光染色结果。
具体实施方式
下面结合附图说明及具体实施方式对本发明作进一步说明。
如图1所示：
实施例一
参见图1，本发明的第一种具体实施方式是，一种在钛合金表面构建NO催化型纳米涂层的方法，其步骤为：
A、钛合金样品的制备与活化：钛合金表面经抛光处理后，浸入浓度为1 mol/L的NaOH溶液中， 90℃条件下活化反应24小时，样品取出清洗后浸入双蒸水中，90℃条件下反应24小时，双蒸水超声清洗后，37℃烘干待用；
B、钛合金表面组装亲和素：将A步骤中活化处理的钛合金样品浸入0.1 mg/ml的亲和素溶液中，静置反应24小时，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗样品，保存待用；
C、NO催化型纳米粒子的制备：配置含0.01 wt%硒代胱胺和0.03 wt%多聚赖氨酸(PLL，分子量150 - 300 KDa)的溶液，与浓度为10 mg/ml的生物素化肝素溶液等体积混合，超声处理5分钟，即得NO催化型纳米粒子；
D、NO催化型纳米涂层的构建：将B步骤中获得的钛合金样品浸泡于C步骤获得的纳米粒子悬液中，振荡反应6小时，双蒸水漂洗后即得。
实施例二
一种在钛合金表面构建NO催化型纳米涂层的方法，其步骤为：
A、钛合金样品的制备与活化：钛合金表面经抛光处理后，浸入浓度为3 mol/L的NaOH溶液中， 70℃条件下活化反应6小时，样品取出清洗后浸入双蒸水中，70℃条件下反应6小时，双蒸水超声清洗后，37℃烘干待用；
B、钛合金表面组装亲和素：将A步骤中活化处理的钛合金样品浸入0.5 mg/ml的亲和素溶液中，静置反应6小时，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗样品，保存待用；
C、NO催化型纳米粒子的制备：配置含0.05 wt%硒代胱胺和0.1 wt%多聚赖氨酸(PLL，分子量150 - 300 KDa)的溶液，与浓度为20 mg/ml的生物素化肝素溶液等体积混合，超声处理5分钟，即得NO催化型纳米粒子；
D、NO催化型纳米涂层的构建：将B步骤中获得的钛合金样品浸泡于C步骤获得的纳米粒子悬液中，振荡反应24小时，双蒸水漂洗后即得。
实施例三
一种在钛合金表面构建NO催化型纳米涂层的方法，其步骤为：
A、钛合金样品的制备与活化：钛合金表面经抛光处理后，浸入浓度为2 mol/L的NaOH溶液中， 80℃条件下活化反应12小时，样品取出清洗后浸入双蒸水中，80℃条件下反应12小时，双蒸水超声清洗后，37℃烘干待用；
B、钛合金表面组装亲和素：将A步骤中活化处理的钛合金样品浸入0.3 mg/ml的亲和素溶液中，静置反应12小时，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗样品，保存待用；
C、NO催化型纳米粒子的制备：配置含0.03 wt%硒代胱胺和0.05 wt%多聚赖氨酸(PLL，分子量150 - 300 KDa)的溶液，与浓度为15 mg/ml的生物素化肝素溶液等体积混合，超声处理5分钟，即得NO催化型纳米粒子；
D、NO催化型纳米涂层的构建：将B步骤中获得的钛合金样品浸泡于C步骤获得的纳米粒子悬液中，振荡反应12小时，双蒸水漂洗后即得。
参见说明书附图1，本发明的反应过程与机理分为两个部分，第一部分为钛合金表面组装亲和素分子。该过程中，首先利用碱热活化作用在钛合金材料表面产生大量羟基，使表面呈强电负性，然后利用亲和素在中性条件下呈正电性的特征，通过静电组装将亲和素组装在钛合金表面。第二部分为NO催化型纳米粒子的制备与固定。首先利用PLL、Hep和硒代胱胺在中性条件下能通过静电作用自发组装形成纳米粒子的特性，形成具有NO催化活性的PLL/硒代胱胺/Hep纳米粒子。由于肝素为生物素化修饰，所以得到的纳米粒子表面会有一定量的生物素暴露，这些生物素能钛合金表面的亲和素特异性识别并相互结合，从而实现纳米粒子在材料表面的固定。
本发明提供的一种在钛合金表面构建NO催化型纳米涂层的方法。首先利用PLL、硒代胱胺和生物素化肝素之间能通过静电交互作用形成纳米粒子的特性，制备出具有NO催化性能的纳米粒子；再对钛合金表面碱热活化形成富含羟基的电负性表面，利用静电作用在表面组装正电性的亲和素分子；最后利用纳米粒子表面的生物素基团能特异性识别材料表面的亲和素分子并与之结合的特性，可将纳米粒子固定在材料表面。本发明在钛合金材料表面构建具有NO催化特性的纳米粒子涂层，显著改善了材料的抗凝及抗增生性能，同时能提高表面内皮损伤修复能力。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。