一种改进的SD大鼠克罗恩病造模方法与流程

本发明属于动物疾病模型
技术领域：
，具体地，涉及一种改进的SD大鼠克罗恩病造模方法，该方法可更好地用于初筛治疗克罗恩病的药物。
背景技术：
：克罗恩病（Crohn’sdisease,CD）是一种主要由免疫反应失调引起的胃肠道慢性肉芽肿性炎症性疾病。目前在我国，其发病率呈逐年升高趋势，肠道的慢性炎症及损伤可导致肠纤维化乃至肠梗阻等严重并发症的发生。目前，CD治疗尙缺乏特异有效的药物，因此，探讨CD的发病机制，以寻求新型治疗靶点的研究成为热门方向。三硝基苯磺酸（TNBS）与乙醇合用进行动物克罗恩病（Crohn’sDisease,CD）造模是目前研究CD的常用模型。该模型的机制是乙醇破坏肠黏膜屏障，TNBS作为一种有机酸半抗原渗入结肠组织，与组织蛋白等高分子物质结合，形成全抗原，使T淋巴细胞致敏，溶解与半抗原结合的动物自身细胞，引起肠壁一系列免疫应答和炎症反应，随着组织的逐渐修复，可出现一系列肠壁的增生性改变。该法的优点是炎症症状与人类CD相似，而且可以维持较长时间，方法简便，重复性也较好。但缺点是无急性期表现，动物的死亡率较高。因此，如何在现有克罗恩病研究模型上加以改进，提供更安全更有效的动物疾病模型就显得尤为重要。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中克罗恩病模型的缺陷和不足，提供一种改进的SD大鼠克罗恩病造模方法，使该模型符合临床人类疾病特征，且造模成功率高，动物死亡率低；该改进模型可用于研究克罗恩病的发病机制以及筛选该病的治疗药物。本发明的目的是提供一种改进的SD大鼠克罗恩病造模方法。本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的。本发明前期研究结果表明，影响造模成功率和动物死亡率的因素主要是手术操作和造模药TNBS剂量及造模溶液配比的选择。因此，本发明通过对造模液配比的选择来寻求更安全有效的动物模型。一种改进的SD大鼠克罗恩病造模方法，所述方法具体包括如下步骤：将SD大鼠禁食，麻醉后，将造模药物灌肠，在导入造模药物后采取头低尾高的体位，防止灌注液体外溢，并倒提大鼠1～2min；所述造模药物为5%的TNBS水溶液与无水乙醇按1:1体积比混合；所述造模药物的剂量为50mg/kg。优选地，所述SD大鼠的禁食时间为24小时。优选地，所述麻醉为用8～10%水合氯醛按0.3ml/l00g腹腔注射。优选地，所述灌肠为用灌胃针自肛门插入距肛门6～8cm处，灌入造模药物。优选地，在灌肠之前用PBS缓冲液清洗肠道。另外，上述造模方法在研究克罗恩病中的应用亦在本发明保护范围内。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明所述模型符合临床人类克罗恩病特征：腹泻、血便、肠梗阻及体重减轻，结肠溃疡并且肠管与肠管、肠管与脏器或组织之间发生粘连和脓肿；（2）本发明所述方法造模成功率高；（3）本发明所述造模方法动物死亡率低；（4）本发明所述造模方法简便，重复性较好。附图说明图1为实施例1建立的造模组与对照组大鼠体质量变化图。图2为实施例1建立的造模组与对照组大鼠DAI评分。图3为实施例1建立的对照组大鼠结肠组织病理图。图4为实施例1建立的造模组大鼠结肠组织病理图。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1改进的SD大鼠克罗恩病造模方法1.造模药配制取一定体积5%TNBS水溶液与等体积无水乙醇混匀，置于4℃保存待用。2.造模方法（1）SD大鼠体重160g～220g，造模前禁食24h。（2）造模前称重并记录体重，腹腔内注射0.3ml/l00g10%水合氯醛麻醉后，注入PBS清洗肠道。（3）将灌胃针自肛门插入距肛门8cm处，灌入造模药物50mg/kg（5%TNBS与无水乙醇按1:1体积比混合，0.2ml/100g体质量）。在导入造模药液后采取头低尾高的体位，防止灌注液体外溢，并倒提大鼠1～2min。对照组SD大鼠以同体积生理盐水灌肠。（4）造模后大鼠平躺，自然清醒，常规饲养。（5）考察造模成功率，观察指标如下：一般情况观察和记录每天记录大鼠进食、毛色、活动情况、称量和记录大鼠体质量、记录评价大便性状：正常大便，成形大便；腹泻，松散大便或是稀便，不粘附于肛门的糊状、半成形大便或是可粘附于肛门的稀水样便。肉眼观察大便隐血情况。体重变化如图1所示。按照Murthy等制定的标准进行DAI评分，评分标准见表1，评分结果如图2所示。结肠标本大体观察与评分取出距肛门10cm的结肠组织，沿肠系膜纵行切开，用冰生理盐水冲洗，将黏膜向上展开，观察豁膜损伤，并按照Walloce和Keenan1990年的评分标准进行结肠黏膜的大体损伤评分，见表2。组织切片观察与记录观察大鼠肠道粘膜改变（光镜下，HE染色），与空白对照组比较，记录组织学评分：将石蜡标本经4m连续切片后常规HE染色，观察形态学改变。对照组和造模组组织病理切片图如图3、4所示。根据Cooper等的研究观察组织学改变并评分，见表3，平均观察3个100倍视野，取平均值。表1TNBS诱导大鼠IBD的DAI评分标准体重下降（%）粪便性状便血评分0正常无便血01-5%稀便无便血15-10%稀便少量210-15%腹泻少量3>15%腹泻大量4DAI=（体重下降分数+粪便性状分数+便血分数）/3正常粪便：成形的颗粒状粪便稀便：不会粘在肛门上的糊状便腹泻：粘在肛门上的水样便表2大体标本形态评分标准大体标本形态表现评分无炎症和溃疡0局部充血但无溃疡1溃疡但无充血21处溃疡及炎症32处或2处以上溃疡及炎症4溃疡延伸超过2cm5表3组织学评分标准组织学光镜下表现评分正常结肠黏膜0为隐窝腺体丢失1/31为隐窝腺体丢失2/32为隐窝腺体全部丢失，黏膜上皮完整,伴有轻度炎性细胞浸润3黏膜上皮糜烂、破坏，伴有明显炎性细胞浸润43.结果对照组SD大鼠精神佳，进食饮水量正常，排黄色成形软便。试验组SD大鼠灌肠24h后精神状态一般，食欲下降，出现腹泻、血便、肠梗阻及体重减轻，结肠溃疡并且肠管与肠管、肠管与脏器或组织之间发生粘连和脓肿，与临床人类克罗恩病特征接近，且生存率高。实施例2改进的SD大鼠克罗恩病造模方法1.造模药配制取一定体积1%TNBS水溶液与等体积无水乙醇混匀，置于4℃保存待用。2.造模方法（1）SD大鼠体重160g～220g，造模前禁食24h。（2）造模前称重并记录体重，腹腔内注射0.3ml/l00g10%水合氯醛麻醉后，注入PBS清洗肠道。（3）将灌胃针自肛门插入距肛门8cm处，灌入造模药物50mg/kg（1%TNBS与无水乙醇按1:1体积比混合，0.2ml/100g体质量）。在导入造模药液后采取头低尾高的体位，防止灌注液体外溢，并倒提大鼠1～2min；对照组SD大鼠以同体积生理盐水灌肠。（4）造模后大鼠平躺，自然清醒，常规饲养。（5）考察造模成功率，观察指标和实施例1一致。3.结果对照组SD大鼠精神佳，进食饮水量正常，排黄色成形软便。试验组SD大鼠灌肠24h后精神状态一般，食欲下降，但肠道和粘膜形态及组织结构均正常，未表现出克罗恩病症状。实施例3改进的SD大鼠克罗恩病造模方法1.造模药配制取一定体积10%TNBS水溶液与等体积无水乙醇混匀，置于4℃保存待用。2.造模方法（1）SD大鼠体重160g～220g，造模前禁食24h。（2）造模前称重并记录体重，腹腔内注射0.3ml/l00g10%水合氯醛麻醉后，注入PBS清洗肠道。（3）将灌胃针自肛门插入距肛门8cm处，灌入造模药物50mg/kg（5%TNBS与无水乙醇按1:1体积比混合，0.1ml/100g体质量）。在导入造模药液后采取头低尾高的体位，防止灌注液体外溢，并倒提大鼠1～2min；对照组SD大鼠以同体积生理盐水灌肠。（4）造模后大鼠平躺，自然清醒，常规饲养。（5）考察造模成功率，观察指标和实施例1一致。3.结果对照组SD大鼠精神佳，进食饮水量正常，排黄色成形软便。试验组SD大鼠灌肠24h后精神状态较差、厌食、懒动、消瘦，部分大鼠排粘液脓血便，结肠溃疡并且肠管与肠管、肠管与脏器或组织之间发生粘连和脓肿，伴有明显炎性细胞浸润，生存率低。当前第1页1 2 3