抗CD40L抗体和用于治疗CD40L相关疾病或病症的方法与流程

相关申请的交叉引用

本pct申请要求于2015年2月3日提交的美国临时申请no.62,111,261的权益，该美国临时申请的公开内容由此全文以引用方式并入。

本发明涉及抗cd40l抗体、包含该抗体的组合物，以及使用其治疗cd40l相关疾病或病症的方法。

序列表

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背景技术：

cd40与其配体cd40l的相互作用在调节免疫应答方面起着关键作用。cd40l与cd40的结合触发cd40通路的激活，cd40通路的激活会上调共刺激分子如cd80和cd86。已显示通过单克隆抗体阻断cd40和cd40l之间的相互作用在各种临床前模型中引起保护免受自身免疫和移植排斥。最近，在肌萎缩性侧索硬化的小鼠模型中，显示针对cd40l的抗体延迟疾病发作并延长疾病发作的存活期。(美国专利no.8,435,514，其由此以引用方式并入)。在早期临床研究中，人源化抗cd40l抗体hu5c8在狼疮患者和免疫性血小板减少性紫癜患者中显示出功效。然而，用hu5c8治疗的患者血栓栓塞事发停止了进一步的试验。进一步的体外和临床前动物研究确立，fc与fc受体fcγriia的相互作用引起血小板活化和聚集，血小板活化和聚集会导致血栓栓塞事件。已经采取了各种方法来减少或消除免疫球蛋白fc区与fcγriia的相互作用，包括在fc区引入点突变以制备缺乏fc效应功能的无糖基化抗ic40ligg1。其他方法使用缺乏fc区的抗体片段或在fc区中含有多个氨基酸取代的抗体。尽管抗cd40l抗体hu5c8在人患者中显示出功效，但市场上没有抗cd40l抗体。因此，需要用于施用于人的改善的抗cd40l抗体，该抗cd40l抗体不引起血小板活化或聚集，但是稳定并结合至cd40l。

技术实现要素：

本发明提供了适用于人和非人灵长类动物的抗cd40l抗体，其具有经工程改造以减少或消除血小板聚集和伴随的血栓栓塞风险的fc结构域。在本发明的一个方面，本发明提供了作为小鼠抗人cd40l抗体5c8的人源化形式的抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体包含人igg1共有骨架，其中可变轻链和可变重链包含5c8的cdr序列。

本发明的一个方面是分离的抗体，其与cd40l结合并且包含轻链和重链，其中(i)轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含与seqidno:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(ii)重链包含重链可变区和fc区，其中a)重链可变区包含与seqidno:2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；并且b)fc区包含与seqidno:3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，其中fc区包含选自由c11s、c14s和p23s组成的组的一个取代或多个取代的组合。任选地，fc区包含另一氨基酸取代c5s。

本发明的另一方面是一种用于治疗患有cd40l相关疾病或病症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据本发明的抗体。本发明的一个实施方案是一种用于治疗患有神经退行性或神经肌肉疾病或病症；炎性或免疫疾病或病症；或自身免疫疾病的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据本发明的抗体。另一实施方案是一种用于治疗患有cd40l相关疾病或病症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据本发明的抗体，所述抗体与阻断cd28和cd86之间或cd28和cd80之间的相互作用的化合物组合施用。

附图说明

图1a、图1b和图1c示出了hu5c8(图1a)、jb5(图1b)和jb5-k74r(图1c)的重链氨基酸序列。以粗体形式示出的氨基酸表示5c8的重链序列与jb5和jb5-k74r的重链序列之间不同的氨基酸。

图2a-2d示出了jb5的轻链氨基酸序列(图2a)、jb5-r28k的轻链氨基酸序列(图2b)、hu5c8的fc区氨基酸序列(图2c)，以及jb5的fc区氨基酸序列(图2d)。以粗体形式示出的氨基酸表示5c8与jb5-r28k的轻链序列之间以及hu5c8与jb5的fc区之间不同的氨基酸。

图3是示出jb5抗体(圆形，虚线)、hu5c8抗体(正方形-实线)和对照ctla4-igg1(三角形)与人cd40l的相对结合的曲线图。

图4是示出hu5c8抗体与人fcγ受体蛋白的fcgr1a(圆形，实线)、fcgr2a(圆形，虚线)、fcr3a和fcr3b同种型的结合的曲线图。

图5是示出jb5抗体不结合人fcγ受体蛋白的fcgr1a、fcgr2a、fcr3a或fcr3b同种型的曲线图。

图6示出了从尺寸排阻柱在30℃运行的jb5抗体的分析性色谱洗脱曲线。

图7示出了从尺寸排阻柱在30℃运行的hu5c8抗体的分析性色谱洗脱曲线。

图8是示出通过荧光激活细胞分选(facs)评估的血小板活化标志物pac1抗体与未处理的血小板样品(阴性对照)的结合的图。

图9是示出通过facs评估的抗pac1抗体的结合的图。

图10是示出在血小板与cd40l温育后，通过facs评估的抗pac1抗体与血小板的结合的图。

图11是示出在血小板与cd40l和hu5c8抗体的免疫复合物温育后，通过facs评估的抗pac1抗体与血小板的结合的图。

图12是示出在血小板与cd40l和jb5抗体的免疫复合物温育后，通过facs评估的抗pac1抗体与血小板的结合的图。

图13是示出在血小板与cd40l和hu5c8f(ab')2的免疫复合物温育后，通过facs评估的抗pac1抗体与血小板的结合的图。

图14是示出在三种人血小板与20μmadp、5μg/mlcd40l，cd40l与hu5c8的免疫复合物、cd40l与jb5抗体的免疫复合物或cd40l与hu5c8f(ab')2的免疫复合物温育后，从该三种血小板获得的facs结果的散点图。

图15提供了抗cd40l抗体jb5和hu5c8的轻链可变区氨基酸序列(seqidno:1)、抗cd40l抗体jb5和hu5c8的重链可变区氨基酸序列(seqidno:2)、抗cd40l抗体hu5c8的fc区氨基酸序列(seqidno:3)、抗cd40l抗体jb5的fc区氨基酸序列(seqidno:4)、抗cd40l抗体jb5-r28k的轻链可变区氨基酸序列(seqidno:5)、抗cd40l抗体jb5-k74r的重链可变区氨基酸序列(seqidno:6)，以及抗cd40l抗体jb5的轻链氨基酸序列(seqidno:7)。

图16提供了编码抗cd40l抗体jb5的轻链合成核苷酸序列(seqidno:8)，大写字母表示外显子，小写字母表示合成基因的内含子序列，并且还提供了抗cd40l抗体jb5的重链氨基酸序列(seqidno:9)。

图17提供了编码抗cd40l抗体jb5的重链的合成核酸序列(seqidno:10)，大写字母表示外显子，小写字母表示合成基因的内含子序列。

图18提供了抗cd40l抗体jb5-r28k的氨基酸序列(seqidno:11)、编码抗cd40l抗体jb5-r28k的轻链的合成核酸序列(seqidno:12)，大写字母表示外显子，小写字母表示合成基因的内含子序列，并且还提供了抗cd40l抗体jb5-k74r(seqidno:13)的重链氨基酸序列。

图19提供了编码抗cd40l抗体jb5-k74r的重链的合成核酸序列(seqidno:14)，大写字母表示外显子，小写字母表示合成基因的内含子序列。

图20提供了抗cd40l抗体jb5的重链和轻链的cdr的氨基酸序列(分别为seqidno:15至seqidno:20)和hu5c8重链的氨基酸序列(seqidno:21)。

具体实施方式

定义

术语如“包括/包含(comprises/comprised/compmrising)”、“含有(contains/containing)”等具有美国专利法中规定的含义；这些术语是包含性的或开放式的，并且不排除其他未被叙述的元件或方法步骤。术语如“基本上由......组成(consistingessentiallyof/consistsessentiallyof)”具有在美国专利法中针对它们规定的含义；这些术语允许包括不会实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的其他成分或步骤。术语“由......组成(consistsof/consistingof)”具有在美国专利法中针对它们规定的含义；这些术语是封闭式的。

术语“治疗(treat/treatment)”等包括治疗性治疗和预防性治疗。治疗性治疗是对具有要治疗的疾病、病症或病状的病征或症状的受试者的治疗。预防性治疗是指对易患不显示出疾病、病症或病状的明显病征的疾病、病症或病状的受试者的治疗。因此，治疗可以引起停滞疾病、部分或完全缓解疾病或减少疾病的病征或症状，并且具体地包括但不限于延长存活期。

“约”表示所叙述的数值允许某种轻微的不精确(使用一些方法来实现值的精确性；近似或相当接近于该值；几乎)。如果由“约”提供的不精确性不能在本领域中用其普通含义理解，则如本文所用的“约”至少表示由于测量和使用这些参数的普通方法而可能产生的变化。此外，范围的公开包括公开所有值以及在整个范围内进一步细分的范围。

所使用的连接词“或”与“……中的至少一个”互换使用。例如：在组合物包含a或b的情况下，方法必须包括a和b中的至少一个，但也可以包括a和b两者。同样，包含“a、b、c或d”的组合物必须包含a、b、c和d构成的组中的至少一个，但也可以包含a、b、c和d的全部或任何组合。

氨基酸取代按照其中标识出原始氨基酸、该氨基酸在指定序列中的位置和替代氨基酸的惯例表示，例如c11s表示多肽序列的位置11处的半胱氨酸被丝氨酸替代。

“5c8”是指小鼠抗人抗体，该小鼠抗人抗体结合cd40l，并且由可得自atcc、登记号为hb10916的杂交瘤产生，并且描述于美国专利no.5,474,771中。“hu5c8”是指5c8的人源化形式，其序列在karpusas等人，structure，第9卷，第321-329页(2001)中公开。

在说明书中提及了多肽或氨基酸序列之间的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是由该等序列共享的相同位置的数量的函数，考虑到了空位数目和每个空位的长度，空位数目和每个空位的长度是最佳比对两个序列所需引入的。同一性可以被作为“局部同一性”或“全局同一性”测量。局部同一性是指多肽之间的序列相关性程度，如通过此类序列的串间匹配确定的。全局同一性是指多肽与参考多肽的全长相比的序列相关性程度。除非另有说明，如本文所用，同一性表示全局同一性。对于本公开的目的，使用needleman和wunsch((1970)j.mol.biol.48:444-453)算法计算全局同一性的百分比，该算法使用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的blossum62评分矩阵。存在合并needleman和wunsch算法的许多公开可得的软件程序，例如gcg软件包中的gap程序。

cd40l也被称为cd154、gp39、t-bam、5c8抗原或tnf相关活化蛋白(trap)。

实施方案

本发明提供了治疗性抗人cd40l抗体和使用本发明的抗体治疗患有cd40l相关疾病或病症的患者的方法。提供了本发明的各种示例性实施方案，然而，本发明受权利要求书而不是所公开的实施方案的限制。

在本发明的一个方面，本发明提供了作为抗cd40l抗体hu5c8的改进形式的抗体，该抗体包含人igg1共有骨架，该人igg1共有骨架具有hu5c8的可变轻链和可变重链cdr序列，以及经修饰以防止血小板活化的fc结构域。

表1提供了对本申请中提及的各seqidno的描述。

表1

一个实施方案(实施方案a)是一种分离的抗体，该分离的抗体与cd40l结合并且包含轻链和重链，其中该轻链包含轻链可变区，该轻链可变区包含与seqidno:1具有至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％的氨基酸序列，并且重链包括可变重链区和fc区，其中重链可变区包含与seqidno:2具有至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且fc区包含与seqidno:3具有至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列，其中该fc区包含选自由c11s、c14s和p23s组成的组中的一种取代或各种取代的组合。

另一个实施方案(实施方案b)是根据实施方案a的分离的抗体，其中该fc区还包含氨基酸取代c5s。

在实施方案a和b的变型中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区不包含取代t33w、s26d和q27e中的任一者。

在实施方案a和b的其他变型中，轻链可变区包含取代r28k。

在实施方案a和b的一些变型中，重链和轻链的cdr具有表2中列出的序列

表2

在实施方案a和b的另一变型中，轻链可变区包含氨基酸序列icrrasqrvssstysymh(seqidno:15)。在其他实施方案中，轻链可变区包含氨基酸序列icrrasqrvssstysymh(seqidno:15)，以及氨基酸序列yasnles(seqidno:16)和qhsweippt(seqidno:17)中的一者或两者。

在实施方案a和b的一些变型中，轻链可变区包含氨基酸序列seqidno:1。在其他实施方案中，轻链可变区由氨基酸seqidno:1组成。在一些实施方案中，轻链基本上由氨基酸序列seqidno:7组成。在其他实施方案中，轻链由氨基酸序列seqidno:7组成。在其他实施方案中，轻链包含氨基酸序列seqidno:11。在其他实施方案中，轻链基本上由氨基酸序列seqidno:11组成。在其他实施方案中，轻链由氨基酸序列seqidno:11组成。

在实施方案a和b的其他变型中，抗体包含重链可变区，所述重链可变区不包含取代t30h、y33w或s54n中的任一者。在实施方案a和b的抗体的一些实施方案中，轻链可变区不包含取代t33w、s26d和q27e中的任一者。在实施方案a和b的其他变型中，轻链可变区不包含取代t33w、s26d和q27e中的任一者，并且重链可变区不包含取代t30h、y33w或s54n中的任一者。

在实施方案a和b的其他变型中，重链可变区包含取代k74r。在一个实施方案中，重链可变区包含氨基酸序列syymy(seqidno:18)、einpsngdtnfnekfks(seqidno:19)和sdgrndmds(seqidno:20)中的一种或任何组合。

在另一个实施方案中，重链可变区包含氨基酸序列seqidno:2。在另一个实施方案中，重链可变区基本上由氨基酸序列seqidno:2组成。在另一个实施方案中，重链可变区由氨基酸序列seqidno:2组成。在一些实施方案中，重链可变区包含氨基酸序列seqidno:6。在其他实施方案中，重链可变区基本上由氨基酸序列seqidno:6组成。在其他实施方案中，重链可变区由氨基酸序列seqidno:6组成。

本发明的一个实施方案是一种分离的抗体，其中轻链包含氨基酸序列seqidno:1并且重链由氨基酸序列seqidno:9组成。

本发明的另一个实施方案是一种分离的抗体，其中轻链由氨基酸序列seqidno:7组成并且重链由氨基酸序列seqidno:9组成。

另一个实施方案是一种分离的抗体，其中轻链可变区包含氨基酸序列seqidno:5，并且重链由氨基酸序列seqidno:9组成。

另一个实施方案是一种分离的抗体，其中轻链由氨基酸序列seqidno:11组成，并且重链由氨基酸序列seqidno:9组成。

另一个实施方案是一种分离的抗体，其中轻链由氨基酸序列seqidno:7组成，并且重链由氨基酸序列seqidno:13组成。

另一个实施方案是一种分离的抗体，其中轻链由氨基酸序列seqidno:11组成，并且重链由氨基酸序列seqidno:13组成。

在优选的实施方案中，本发明的抗体在37℃下稳定达至少12小时的时段。

在另一方面，本公开提供了用于治疗患有cd40l相关疾病或病症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的抗体。设想出，本发明的抗体或它们的混合物可以作为单一疗法施用于受试者，这如本文所用意味着该抗体是用于治疗根本疾病或病症而被施用于患者的唯一治疗剂。使用本发明的抗体的单一疗法不排除施用其他药物，其他药物的非限制性示例是肌肉松弛剂、非甾体抗炎药、止痛药和抗抑郁药。因此，在本发明的各种实施方案中，本发明的一种抗体或多种抗体的混合物是用于治疗根本疾病或病症的唯一治疗剂。

还设想出，本发明的抗体或它们的混合物可以与其他治疗剂组合施用。“与……组合”包括但不限于在不同时间、以不同频率、同时或组合于单一剂型中施用多种治疗剂。

一个实施方案是一种用于治疗患有神经退行性或神经肌肉疾病或病症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的抗体。神经退行性或神经肌肉疾病和病症包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、多灶性运动神经病、原发性侧索硬化、脊肌萎缩症、肯尼迪氏病(kennedy'sdisease)和脊髓小脑性共济失调。

另一个实施方案是一种用于治疗患有肌萎缩性侧索硬化的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的抗体。

本发明的一个实施方案是一种用于治疗患有炎性或免疫疾病或病症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的抗体。炎性或免疫疾病和病症包括但不限于结肠炎、药物诱发的狼疮性肾炎、移植物抗宿主疾病、移植排斥和动脉粥样硬化。

另一个实施方案是一种用于治疗患有自身免疫疾病的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的抗体。自身免疫疾病包括但不限于系统性红斑狼疮、1型糖尿病、重症肌无力、炎性肠病、免疫性血小板减少性紫癜和类风湿性关节炎。

另一个实施方案是一种用于抑制受试者的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的抗体。在一个实施方案中，免疫应答是移植物抗宿主疾病。在另一个实施方案中，免疫应答是器官移植排斥。

在一些实施方案中，本发明的抗体作为单一疗法施用。在一个实施方案中，抗体为jb5，其作为单一疗法施用。在另一个实施方案中，抗体jb5-k74r作为单一疗法施用。在另一个实施方案中，抗体jb5-r28k作为单一疗法施用。在另一个实施方案中，抗体jb5-r28k-k74r作为单一疗法施用。

在根据本发明的方法的一些实施方案中，抗体与另一种治疗剂组合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗体与阻断cd28与cd86之间或cd28与cd80之间的相互作用的化合物组合施用。

在一些实施方案中，阻断cd28与cd86之间或cd28与cd80之间的相互作用的化合物是ctla4-ig融合蛋白。在一个实施方案中，阻断cd28与cd86之间或cd28与cd80之间的相互作用的化合物是阿巴西普(abatacept)或贝拉西普(belatacept)或加利昔单抗(galiximab)。

药物组合物和施用方法

为了治疗任何前述病状，根据本公开的方法使用的药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体以常规方式配制。药学上可接受的载体部分地由所施用的具体组合物以及由用于施用该组合物的具体方法决定。因此，存在可用于本公开的方法的化合物的各种合适的制剂(参见例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy，第20版，gennaro等人编辑，lippincottwilliamsandwilkins,2000)。

适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射溶液，所述注射溶液可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂，以及使制剂与预期受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，所述悬浮液可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。

根据本公开内容，化合物可以通过任何合适的手段施用，所述手段可以根据所治疗的病症的类型和化合物本身的性质而变化。例如，对于本发明的抗体，施用途径优选包括肠胃外施用，例如肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下。优选地，肠胃外给药通过注射进行，最优选是静脉内、肌内或皮下注射。要施用的量将取决于各种因素，诸如临床症状、个体体重，以及是否施用其他药物。应当理解，适当的剂型、剂量和施用途径的确定在制药和医学领域的普通技术人员水平之内。

实施例

以下实施例说明用于制备和测试本发明的抗体的方法。对通常在分子生物学和免疫学领域中遇到的所描述的条件和参数的适当修改和调适对于本领域的技术人员将是显而易见的。

实施例1：抗体制备

为了制备本发明的抗体，将编码所需抗体的重链和轻链的核酸序列设计成适用于在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(cho)细胞中表达。然后使用标准分子生物学技术人工合成核酸并连接至抗体表达载体bpjpuro中。bpjpuro是针对在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中选择性和稳定表达免疫球蛋白而优化的双基因哺乳动物表达载体。然后将载体转染到cho细胞中，并选择稳定的转染子。

制备jb5抗体

合成编码具有氨基酸序列seqidno:9的重链的核酸(seqidno:10)和编码具有氨基酸序列seqidno:7的轻链的核酸(seqidno:8)，并将其连接到抗体表达载体bpjpuro中。

使用脂质体介导的转染将编码该重链和该轻链的所得表达载体转染到cho系(chosa,cellectissa,paris,france)中。通过嘌呤霉素选择分离出稳定的转染子，然后亚克隆以提供克隆细胞系。使候选细胞系适应无血清悬浮培养，并筛选igg产生和稳健生长。选择细胞系中的一个并命名为jb5，将该细胞系在中试规模的生物反应器中培养，并通过连续浓缩、蛋白a/g亲和色谱法和尺寸排阻色谱法从条件培养基中纯化抗体jb5。

实施例2：cd40l结合测定

使用三部分夹心elisa测定来测定jb5抗体相对于亲本抗体hu5c8的结合动力学。所有洗涤均使用250μl的pbs洗涤3次来进行。将96孔聚苯乙烯板用100μl/孔的jb5或hu5c8抗体(2μg/ml)在4℃下涂布16小时。将板洗涤，然后用2％牛血清白蛋白/pbs在室温下封闭1小时。洗涤板，并将重组的人cd40l蛋白(santacruzbiotechnology,santacruz,california,usa)加入到该板中，用从2000ng/ml开始2倍稀释滴定。结合和洗涤后，使用100μl生物素化的山羊抗人cd40l多克隆抗体(200ng/ml)和100μl的100ng/ml的链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物检测结合的cd40l蛋白。用生色团tmb(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)进行比色检测，并进行对450nm处吸光度的分光光度分析。所得到的结合曲线(图3)显示，jb5(圆形)相对于亲本抗体hu5c8(正方形)具有高度相似的cd40l结合。具有与jb5相同的fc结构域的对照蛋白ctla4-igg1(三角形)显示为没有显著的结合。计算出的hu5c8和jb5的ec50分别为114nm和137nm。jb5-r28k和jb5-k74r显示出与jb5相似的结合。

实施例3：fcγ受体结合测定

hu5c8/人fcγ受体结合测定

进行固相elisa结合测定以确定四种人fcγ受体同种型与亲本hu5c8抗体的结合水平。将100μl/孔的hu5c8抗体(在磷酸盐缓冲盐水中，2μg/ml)加入到96孔聚苯乙烯板的各孔中，并在4℃下温育16小时。将板封闭，然后以5μg/ml的起始浓度2倍稀释滴定重组人fcγ受体(fcgr)蛋白(santacruzbiotechnology,santacruz,california)。分别测试了如下四种重组fcgr同种型：fcgr1a(cd64)、fcgr2a(cd32)、fcgr3a(cd16a)、fcgr3b(cd16b)。结合和洗涤后，使用适当的fcgr同种型特异性鼠单克隆抗体(1000ng/ml)和辣根过氧化物酶缀合山羊抗小鼠igg检测抗体检测fcgr。用生色团tmb(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)进行比色检测，并进行对450nm处吸光度的分光光度分析。所得到的结合曲线(图4)表明，亲本hu5c8抗体以高亲和力结合活化血小板上表达的高亲和力fcgr1a(圆形，实线)受体和fcgr2a受体(圆形，虚线)。hu5c8抗体显示为不结合fcr3a或fcr3b同种型。

jb5-人fcγ受体结合测定

使用固相结合测定来测试人fcγ受体同种型与突变jb5抗体的结合。将100μl/孔的jb5(在磷酸盐缓冲盐水中，2μg/ml)在96孔聚苯乙烯板上涂布16小时。封闭板，然后将重组人fcγ受体(fcgr)蛋白(santacruzbiotechnology,santacruz,california)以5μg/ml的起始浓度2倍稀释滴定到该板上。分别测试了如下四种重组fcgr同种型：fcgr1a(cd64)、fcgr2a(cd32)、fcgr3a(cd16a)、fcgr3b(cd16b)。结合和洗涤后，使用适当的fcgr同种型特异性鼠单克隆抗体(1000ng/ml)和辣根过氧化物酶缀合山羊抗小鼠igg检测抗体检测fcgr。用生色团tmb(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)进行比色检测，并进行对450nm处吸光度的分光光度分析。所得到的结合曲线(图5)表明，在本测定中jb5抗体既不结合在活化血小板上表达的高亲和力fcgr1a受体，也不结合在活化血小板上表达的fcgr2a受体。与亲本hu5c8抗体一样，也没有观测到fcgr3a或fcgr3b的结合。

实施例4：jb5在22℃和37℃时的稳定性

由于jb5缺乏野生型igg1抗体中的三个二硫键，因此使用尺寸排阻色谱法测定jb5，以确定抗体是否稳定，即作为四聚的完全完整抗体存在。使用具有三个二硫键的hu5c8作为对照。

进行两个实验，每个实验比较jb5与hu5c8。在第一个实验中，在色谱法前和色谱法期间抗体处于室温(22℃)下。为了模拟体内条件，在第二个实验中，将抗体在人血浆中于37℃温育30分钟，然后在30℃下进行色谱法。将pbs中的二十微克jb5或hu5c8注射到装备有柱前过滤器tskgelguardswxl(6.0mm×4.0cm，7μm珠柱)(tosohbioscience,kingofprussia,pa)的tsk凝胶g3000sw(7.8mm×30cm，5μm珠柱)中。流动相为pbs，洗脱速率为1.0ml/分钟，并在280nm处测量吸光度。在22℃和30℃两者处，观测到的jb5的分子量具为183kda(图6)，并且hu5c8(图7)的mw为164kda，该mw与四聚二价形式的抗体一致。观测到的在hu5c8抗体和jb5之间的19kda差异可能是由于jb5的fc结构域的糖基化增加。

实施例5：消除血小板活化

为了确定jb5对cd40l免疫复合物介导的血小板活化的影响，测定了抗体诱导血小板细胞表面标志物蛋白pac-1的能力。从三名健康志愿者抽取全血到3.2％柠檬酸钠管中，弃去前2ml。通过在120g下离心15分钟制备富血小板血浆，将血小板计数用磷酸盐缓冲盐水归一化至1×10⁵个细胞/ml。通过在室温下预温育15分钟，以3:1的cd40l:抗体摩尔比(0.6944纳摩尔cd40l:0.2315纳摩尔抗体)制备重组人cd40l(santacruzbiotechnology,santacruz,ca,usa)与测试抗体hu5c8、jb5和hu5c8f(ab’)2的免疫复合物。将免疫复合物混合物稀释至在归一化的pbs/血小板溶液中的最终浓度5μg/mlcd40l，然后在37℃下温育30分钟。阴性对照是单独的未处理血小板和cd40l。通过加入adp至在归一化的pbs-血小板溶液中的最终浓度20微摩尔，来制备血小板活化阳性对照。温育30分钟后，将抗人pac-1-fitc缀合的抗体加入所有样品中并温育15分钟。将样品1:1稀释到2％多聚甲醛:pbs缓冲液中，在冰上固定30分钟，以100g离心5分钟以沉淀细胞。将细胞重新悬浮于pbs中。在guavaeasycyte流式细胞仪(emdmillipore,inc.,billerica,ma,usa)上进行荧光活化细胞分选(facs)。采用flowjo软件(flowjo,llc,ashland,or,usa)进行采集后分析。

使用未处理的血小板对照样品来设定阴性和阳性pac-1活化门(图8)。用20微摩尔adp活化的血小板具有显著增加的pac-1细胞表面表达(图9)。与已公布的观测一致，参见例如mirabet,m.等人，molecularimmunology45，937-944(2008)，单独的cd40l能够以低水平激活血小板(图10)。当cd40l与hu5c8抗体一起作为免疫复合物存在时，该活化显著增加(图11)。相比之下，与cd40l复合的工程改造抗体jb5表现出极低水平的血小板活化(图12)。由于相对于hu5c8-igg1:cd40l免疫复合物(图11)，hu5c8f(ab')2:cd40l免疫复合物(图13)也没有激活血小板，所以cd40l:jb5免疫复合物的这种活化电位降低是由fcr相互作用的损失介导的。图14示出在三个人的血小板与20μmadp、5μg/mlcd40l，cd40l与hu5c8的免疫复合物、cd40l与jb5抗体的免疫复合物或cd40l与hu5c8f(ab')2的免疫复合物温育后，从该血小板获得的血小板活化结果。当与cd40l与hu5c8f(ab')2血小板的免疫复合物相比时，jb5免疫复合物显示为没有显著的血小板活化(p<0.34(非配对的t检验，2尾，t＝1.013，df＝4)。此外，当与hu5c8免疫复合物相比时，jb5免疫复合物显示为显著较少的血小板活化(p<0.005(非配对的t检验，2尾，t＝5.586，df＝4)。

虽然描述了本公开的多个实施方案，但是显而易见的是，本领域的技术人员可以改变基本实施例以提供使用或涵盖本发明的方法和处理的其他实施方案。该等实施方案和实施例仅用于说明性目的，而不应被解释为限制本公开，而是所附权利要求书限定本发明的范围。