本发明涉及包含氧基-氢氧化铜(copperoxo-hydroxide)纳米颗粒的抗菌组合物，特别是配体修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒及其作为能够递送可溶性杀生性铜的抗菌剂的用途。本发明还涉及配体修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒的医疗用途，特别是用于创伤愈合或微生物感染的治疗或预防。
背景技术：
：：自20世纪80年代以来，新型抗菌剂的发展已逐渐变慢，在面临新出现的多重耐药性病原体时留下了暗淡的局面。因此，所谓的“超级细菌”越来越被认为是对公共健康的全球性威胁，推动了包含无机剂品(诸如基于铜和银的无机剂品)的新型抗菌剂的研究。这些金属历史上使用过，并且大量地被假设是通过多种杀生机制起作用，上述机制潜在地增加临床寿命，因为上述机制下要求微生物经过多重突变才能获得抗性。在两种金属中，银已经表现出更强的抗微生物效力，但是成本、在体内的毒性和化学不稳定性可能限制银在诸如治愈被感染的创伤的临床应用上的实用性。铜虽然有效性较低，但是便宜，而且作为必需的微量营养素，人的耐受性更好，可以允许更大剂量的使用。然而，由于铜自身较低的杀生效力，发展最大限度增加游离铜生物利用率的递送系统是铜在临床环境使用的关键。gb1600449(穆尼化工有限公司(mooneychemicalsinc.))涉及树脂或类皂物质，其中结晶的金属氧化物颗粒以化学计量的方式被包围在有机分子的无定形基质中，以生成可溶解在非极性(类似油)溶剂中、主要用于催化剂作用的金属氧化物组合物。gb1600449通过x射线衍射证实了这些组合物保留了未修饰的微晶核，这显示有机分子覆盖在颗粒的表面，而不是包含于它们内部。wo2008/096130(医学研究委员会(medicalresearchcouncil))描述了配体修饰的聚氧基-羟基金属离子材料及公开了他们的用途，特别是用于营养、医疗、化妆和生物相关的应用，例如用于治疗诸如贫血的与材料组分相关的缺乏，或用于去除能够结合到材料的内源性物质。在wo2010/015827中描述了用于作为磷酸盐结合材料的这些类型的材料的例子。wo2012/101407涉及用于在气调条件下在包装外封内储存制品的产品包装中使用的氧传感器，其中氧传感器基于可选地修饰有一种或多种配体的金属氧基-氢氧化物。这些传感器可存在于水合的氧可渗透基质中，该基质例如由诸如明胶的某种材料形成。de20205014332涉及包含化学反应基团的有机金属纳米粉末及其在聚合物复合材料形成中的用途。发展用来有效地递送抗微生物金属离子(例如铜)的方法仍然是本领域的一个未解决的问题，特别是用于临床环境。技术实现要素：概括地，本发明涉及由氧基-氢氧化铜形成的纳米颗粒，该纳米颗粒可以递送杀生浓度的铜，该杀生浓度的铜一般是游离铜离子(cu2+)的形式。本发明中纳米颗粒组合物通过提供小颗粒达到这种结果，该小颗粒一般具有在1nm-100nm范围内的平均直径，更优选地是在1nm-10nm范围内，与相应的大块对应材料相比，该小颗粒具有比较高的表面积/体积比和提高的反应性，并且不像现有技术的铜纳米颗粒，上述小颗粒足够易分解以有效地释放游离铜，使他们能够用作药用组合物或抗菌组合物。在优选的实施例中，这通过氧基-氢氧化铜的配体修饰来实现，其中一种或多种配体非化学计量地取代氧基-氢氧化铜中的氧基或羟基。在此描述的实验证明了氧基-氢氧化铜纳米颗粒与抗菌剂一样有效，并且优于市售的氧化铜(cuo)纳米颗粒、硅酸根稳定的氢氧化铜纳米颗粒和具有诸如edta的强螯合剂的铜络合物。本发明中的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物优选地修饰有诸如酒石酸和己二酸的羧酸配体或其电离形式。因此，在第一方面，本发明提供一种包含配体修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒的抗菌组合物，其中，氧基-氢氧化铜纳米颗粒具有一种或多种配体非化学计量地取代氧基或羟基的结构，其中，一种或多种配体包括羧酸配体或其电离形式。由于氧基-氢氧化铜纳米颗粒具有聚合结构，在聚合结构中，配体分布在氧基-氢氧化铜的固相结构中，而不是简单的被覆盖或被物理吸附在氧基-氢氧化铜颗粒的表面，因此本发明的发明人认为，包含配体有助于调节纳米颗粒的溶出，以提供能够用于杀生用途的游离铜离子。优选地，氧基-氢氧化铜纳米颗粒具有一种或多种可再现的物理化学性质，例如溶出曲线、作为存在于纳米颗粒的全部铜的函数的可用可溶性铜的百分比、和/或纳米颗粒在细菌生长抑制实验中的杀生活性、和/或重新悬浮已经干燥的组合物时易分解性(lability)的保持。另一方面，本发明提供了本文所述的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物作为抗菌剂的用途。另一方面，本发明提供了本文所述的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物在治疗或预防微生物感染的方法中的用途，更优选地，其中微生物感染为细菌感染。本发明一些方面涉及氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物的医学用途，该组合物可用于治疗人类受试者或动物受试者。另一方面，本发明提供了包含本文所述的配体修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒以及药学上可接受的载体的药物组合物。另一方面，本发明提供了本文所述的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物在制备医用品(medicament)上的用途，该医用品治疗或预防细菌感染或用于治疗创伤。另一方面，本发明提供了治疗或预防细菌感染的方法，该方法包括向需要治疗的患者给药治疗有效剂量的如本文所述的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物。另一方面，本发明提供一种被本发明的抗菌组合物覆盖或处理的制品。在另一方面，本发明提供一种生产根据本发明的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物的方法，该方法包括：(a)将包含cu2+和羧酸配体的溶液，以及可选地一种或多种另外的配体或反应组分，在组分可溶解的第一ph(a)下在反应介质中混合；(b)将第一ph(a)改变为第二ph(b)，以引起氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物的固体沉淀或胶体的形成；(c)分离，以及可选地干燥和/或配制步骤(b)中生成的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物。另一方面，本发明提供包含配体修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒的组合物，其中，氧基-氢氧化铜纳米颗粒具有一种或多种配体非化学计量地取代氧基或者羟基的结构，其中，一种或多种配体包括羧酸配体或其电离形式，该氧基-氢氧化铜组合物通过上述方法是可获得的。另一方面，本发明提供一种制品，该制品具有被处理为包含本发明中配体修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒的表面，其中，纳米颗粒为制品的表面提供抗菌性质。下文中提供了在这种方式下可处理的制品的实施例，例如医疗设备、绷带和敷料。应当理解的是，本发明中被覆盖的底物可用于医学治疗的方法中，例如用于治疗和/或预防微生物感染或者用于治疗创伤。该底物还可用于治疗和/或预防皮肤病或者黏膜疾病。然后，另一方面，本发明提供了在制造用于治疗和/或预防微生物或细菌感染的医用品中配体修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物的用途。本发明还提供了在制造用于治疗和/或预防皮肤病或者黏膜疾病的医用品中配体修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物的用途。应当理解的是，该医用品可以是本发明的涂层或者被覆盖的底物，例如被覆盖的创伤敷料或被覆盖的医疗装置，例如可植入的医疗装置，例如支架。现将参照附图和实施例，通过举例而非限制的方式描述本发明的实施例。图1-6为了比较目的而提供。附图说明图1大肠杆菌暴露于0-50ppmcu的氯化铜中的生长曲线。通过测量随着时间的光密度(od)来观察细菌的生长(上图)。随实验时间在细菌生长培养基中氯化铜的溶解程度(下图)。误差棒表示标准差(n＝3)。图2(a)在水中在大约1270ppm下刚分散后(0h)和不搅拌静置一个小时后的cuo和cusi纳米颗粒(根据实验实例)，其展示了大的cuo团聚物(黑色沉淀物)的形成，不像在悬浮液中保持稳定的cusi纳米颗粒。(b)在水悬浮液中在大约1270ppmcu下的cuo纳米颗粒的ζ电势(zetapotential，电动电势)。cusi纳米颗粒的粒度分布(c)和ζ电势(d)，均在水中在大约1270ppmcu、ph12下分析。误差棒表示标准差(n＝3)。图3大肠杆菌暴露于在50ppmcu下的cuo纳米颗粒(a)和cusi纳米颗粒(b)后的生长曲线，以及相对于cucl2可溶性铜对照组它们各自的细菌生长抑制(c)。在50ppmcu下，在细菌培养基中，cuo纳米颗粒和cusi纳米颗粒的溶出(d)。误差棒表示标准差(n＝3)。图4在3个不同的铜浓度(12.5、25和50ppmcu)下，在cuo纳米颗粒(上图)和cusi纳米颗粒(下图)中繁殖4个小时后，在细菌培养基中在不同水平的纳米微粒和可溶性铜的情况下大肠杆菌生长的抑制。图5将cucl2稀释至10-500ppm浓度范围，ph7.4±0.2下，mops缓冲液中可分散的铜(n＝3)。图6(a)在大约1270ppmcu、ph7.5±0.2下，cu-edta储备(stock)在水中的溶解程度。误差棒表示两次重复分析的标准差。(b)在不同比例的cuedta络合物中繁殖后大肠杆菌生长的抑制。注意的是，负值代表与无铜培养相比初始生长的增加。(c)通过将cusi纳米颗粒稀释至10-500ppm浓度范围内，ph7.4±0.2下，mops缓冲液中可分散的铜。误差棒表示标准差(n＝3)。图7cutartad纳米颗粒(根据实验实例制备)的表征。a——制备的ph8、包含大约2500ppmcu的悬浮液的tem分析(悬浮液滴涂在tem的栅网(grid)上)。b——通过动态光散射分析的相同纳米粒子的流体力学粒度分布，显示平均尺寸为3.72±0.04nm。c在ph8、大约1000ppmcu下，cutartad纳米颗粒的ζ电势。d无定形cutartad纳米颗粒的xrd光谱。红色的峰对应岩盐(结晶的nacl)，该岩盐通过将酸性含氯溶液与氢氧化钠中和而形成。误差棒表示三次重复分析的标准差。图8a)在12.5、25和50ppmcu的状态下，细菌培养基中cutartad纳米颗粒的溶出曲线；误差棒表示标准差(n＝3)。b)通过将cutartad纳米颗粒稀释至10-500ppm浓度范围内，ph7.4±0.2下，mops缓冲液中可分散的铜。误差棒表示标准差(n＝3)。图9均以50ppmcu在可溶性cu和cutartad纳米颗粒中繁殖后的大肠杆菌(上图)和金黄色葡萄球菌(下图)的生长抑制。误差棒表示标准差(n＝2)。图10包含在250ppmcu下的cutartad纳米颗粒的hec基质(a)。从包含250ppmcu的hec基质中cu的释放。误差棒表示标准差(n＝3)。这个实验包括将具有特定表面积(7.1cm2)的含cu的hec暴露于ph7.0±0.2的碳酸氢盐缓冲溶液中，观察随时间的铜的浓度。图11为比较目的而合成的未修饰的铜的氢氧化物(实例4，n6)的xrd光谱也被获得(下图)。后者显示了类似于副氯铜矿的晶形，副氯铜矿是一种化学式为cu2(oh)3cl、其中氯原子包含在矿物结构中的铜的氢氧化物(下图)。图12通过暴露于cucl2、agno3和酒石酸根-己二酸根修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒(cutartad纳米颗粒)48小时，皮肤成纤维细胞(细胞系ccd-25sk)的细胞增殖。具体说明氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物配体修饰的聚氧基-羟基金属离子固体材料——特别是基于氧基-氢氧化铁的材料——的生产和表征在我们早先的申请wo2008/096130和wo2010/015827中进行了描述，两申请都通过参考的方式并入。在本申请中报道的工作中对相应的方法进行了改进，以提供本发明的配体修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物，该组合物在抗菌和抗微生物应用中具有用途，例如用来促进创伤愈合。通常，这种类别的材料可以用非化学计量的化学式(mxly(oh)n)表示，其中m表示一种或多种金属离子，l表示一种或多种配体，以及oh代表氧基或羟基，取决于在固体氧基-氢氧化物材料中该基团是桥接基团(氧基)还是表面基团。如本领域众所周知，非化学计量的化合物是具有不能用明确定义的自然数的比例表示的元素组成的化合物，即，上述化学式的下标x、y和n不需要都是自然数，即使该材料可以以可再现的方式制造，并具有一致可再现的性质。优选地，本发明的配体修饰的氧基-氢氧化铜具有聚合结构，其中配体大量地随机地取代氧基或羟基。这提供了具有一种或多种可再现的物理化学性质的氧基-氢氧化铜纳米颗粒，例如，组合物具有在大约1nm到大约10nm的范围内的平均粒度直径(例如由动态光散射测定，见1.2.1节)的一种或多种、可再现的溶出曲线，组合物中的纳米颗粒是大量无定形的(例如由使用x-射线衍射或透射电子显微镜测定，见1.2.3节和1.2.4节)和/或组合物中的纳米颗粒具有可证明(demonstrable)的金属-配体键合(例如使用红外线光谱测定)。附加地或者可替代地，氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物能够释放存在于组合物中的全部铜的某百分比的可溶性铜，该百分比优选至少25％，更优选至少30％，更优选至少40％，以及最优选至少50％。可溶性铜的释放可在游离铜释放实验中测定(例如在下面的实例所描述的)。氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物的杀生性质可使用细菌生长抑制实验测定，并且在标准条件下，优选达到至少50％的细菌生长抑制，更优选至少60％的细菌生长抑制，更优选至少70％的细菌生长抑制，以及最优选至少90％的细菌生长抑制。在一个优选实施例中，使用本发明的抗微生物组合物实现了大肠杆菌生长的完全(100％)抑制。例如，在一实验中大肠杆菌暴露于配体修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒中6小时，铜的浓度超过25mg/l，在这些特定条件下完全(100％)抑制了大肠杆菌的生长。在1.3.2节提供了另一适合的生长抑制实验的实例。通常，金属离子(例如cu2+)最初以盐的形式存在，该盐在材料的制备中可溶解，然后被诱导与配体(l)形成聚氧基-羟基共络合物。如下文所述，除了铜离子(cu2+)还可存在其他金属离子。虽然不希望被任何特定的理论限制，本发明的发明人认为，在这些材料中，在本发明的配体修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒中，用于修饰金属氧基-氢氧化物的配体中的一些通过m-l形式的键合被结合在固相中，即，不是所有的配体(l)均被简单地捕集在或吸附在大块材料内和/或吸附在或覆盖在金属氧基-氢氧化物材料的颗粒表面。材料中金属离子的键合可以采用诸如红外光谱的物理分析技术测定，在红外光谱中，光谱将具有金属离子与配体(l)之间的键的特征峰，以及材料中存在的其他键的特征峰，该其它键例如m-o、o-h和配体种类(l)中的键。可替代地或附加地，可以以降低固相材料中总体有序度的方式通过配体分子取代氧基或羟基将配体种类引入到固相结构中，因此，该材料与诸如相对应的未修饰的氢氧化铜的结构相比具有更加无定形的性质。更加无序或无定形的结构的存在，可以在本领域中由技术人员使用公知技术容易地测定。一示例性技术为透射电子显微镜(tem)。高分辨率透射电子显微镜允许可视化地评估材料的晶形。其可以指示原始粒径和结构(例如晶面间距(d-spacing))，给出无定形材料和结晶材料之间分布的一些信息。这可以使用高角度环形暗场像差校正扫描透射电子显微镜而尤其明显地看出，由于该仪器在保持分辨率的同时达到的高对比度，因此允许材料的原始颗粒的表面和原始颗粒的团块得以可视化。本文中公开的氧基-氢氧化铜纳米颗粒使用铜离子(cu2+)以提供能够递送生物有效浓度的杀生性铜的组合物，例如用作抗菌剂或抗微生物剂。鉴于通常对铜的生理耐受，本发明的组合物还可具有生物相容和无毒的优点。通过
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：，本领域众所周知氧化铜、氢氧化铜和氧基-氢氧化铜由cu2+连同o和/或oh组成，并且在本专利中统称为、在本领域已知为“氧基-氢氧化铜”。除了铜离子(cu2+)的存在之外，其他金属离子还可存在，例如选自ca2+、mg2+、ag+、al3+、fe3+和/或zn2+的金属阳离子。特别是，可有利的包括具有抗微生物性质的其他金属阳离子，例如ag+。另外优选的材料类型在cu2+之外还包括zn2+。本发明的氧基-氢氧化铜纳米颗粒立足于发展为可溶性铜的最佳递送而设计的组合物，例如，为了用于一些应用中，在这些应用中可溶性铜的抗菌活性是想要的。本文的对照实例显示，当以临床制剂所需的浓度分散时，普通的铜盐倾向于沉淀成大的且无杀生活性的氢氧化铜(如图5所示)。此外，虽然加入络合剂(如edta)可阻止这样的团聚物的形成，并可将铜保持在溶液中，但是由于被络合的铜离子受限的生物利用率这些配制剂显示了对细菌生长不太大的抑制。这些实验表明，尽管铜离子处于活性型是杀生活性的原因，但由于铜盐倾向转化为不溶的氢氧化铜，所以铜盐不是递送铜离子的好的方式。本发明的发明人意识到这两种方法都是不可取的，因为无论是存在于团聚物中或是被诸如edta的络合剂强力络合，铜离子都是生物不可用的。因此，本发明涉及用于递送游离铜离子的纳米微粒系统，通过以配体功能化氧基-氢氧化铜纳米颗粒来实现，上述配体例如是可食用的配体，比如羧酸或者氨基酸。在一优选方法中，氧基-氢氧化铜纳米颗粒的矿物相通过羧酸根配体的使用来修饰，例如酒石酸根、葡萄糖酸根、己二酸根和/或谷胱甘肽，羧酸根配体具有负的表面电荷，并在水相环境中稳定纳米颗粒。优选地，本发明的氧基-氢氧化铜纳米颗粒具有1-100mn、1-50nm、1-20nm、1-10nm范围内的平均直径。氧基-氢氧化铜纳米颗粒的颗粒尺寸可以采用诸如动态光散射的本领域众所周知的技术测定，如1.2.1节中的实例子所证明的。举例来说，这可以使用zetasizernanozs(纳米粒度电位仪)(马尔文仪器公司(malverninstruments))来进行。在一典型的实验中，0.5-1ml的氧基-氢氧化铜纳米颗粒的悬浮液可在室温(20±2℃)被转移到小的一次性的容器中并且使用以下设置进行测量：材料折射率0.192，吸光度(absorption)0.1，分散剂折射率1.330，黏度1.00331mpa.s.在没有修饰的情况下，本文所用材料的原始颗粒具有金属氧化物核和金属氢氧化物表面并且在不同学科内可以被称作金属氧化物或金属氢氧化物。术语“氧基-羟基”或“氧基-氢氧化物”的使用旨在不提及任何氧基或羟基的比例的情况下认识到这些事实。因此也可以使用羟基-氧化物。为避免疑义，氢氧化铜还包括各种掺杂氯的多晶型物，特别是，cu2(oh)3cl是氢氧化铜衍生物，其中氯离子被结合进晶型结构中，存在四种类型的矿物相：氯铜矿(atacamite)、羟氯铜矿(botallackite)、副氯铜矿(paratacamite)和斜氯铜矿(clinoatacamite)。本发明的发明人认为本发明的氧基-氢氧化铜颗粒组合物在金属氧基-氢氧化物的原始颗粒的水平上被改变，该改变通过至少一些配体l被引入进原始颗粒的结构中，即导致通过配体分子掺杂原始颗粒。这可以与金属氧基-氢氧化物和有机分子的纳米混合物的形成相对照，在纳米混合物中，原始颗粒没有如此地被改变，有机配体仅仅覆盖或吸附在颗粒表面，当金属氧基-氢氧化物颗粒预先形成于与配体接触之前时，发生这种情况。本文描述的配体修饰的聚氧基-羟基金属离子材料的原始颗粒可通过沉淀方便地生成。术语沉淀的使用通常是指通过沉降或离心从溶液分离的材料的聚集体的形成。在此，术语“沉淀”意指所有固相材料的形成，包括以上描述的聚集体和不聚集而是保持为悬浮液中不溶部分的固体材料，无论它们是否是微粒或纳米微粒(胶体或亚胶体)。这些后者的固体材料也可被称作水合微粒固体。在本发明中，可以参考具有聚合结构的修饰的金属氧基-氢氧化物，其一般不结晶并因此具有一般在临界沉淀ph以上形成的三维聚合或交联结构。如本文所使用的，这不应被看作是表明材料的结构是具有规则重复单体单元的严格意义上的聚合，因为，如已经陈述的，除了巧合，配体的结合是非化学计量的。配体种类通过取代氧基或羟基而被引入到固相结构中，导致固相有序度的改变。在一些情况下，例如本文所示例的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合的生成，可以以降低固相材料中总体有序度的方式通过配体分子取代氧基或羟基将配体种类l引入到固相结构中。虽然这仍产生大体上具有一种或多种可再现的物理化学性质的配体修饰的聚氧基-羟基金属离子固体材料，但是该材料与例如相对应的未修饰的金属氧基-氢氧化物的结构相比具有更加无定形的性质。更加无序或无定形的结构的存在可在本领域中由技术人员使用公知的技术容易地测定。一个示例性的技术是透射电子显微镜(tem)。高分辨率透射电子显微镜允许可视化地评估材料的晶形。其可以指示原粒径和结构(例如晶面间距)，给出无定形材料和结晶材料之间分布的一些信息。使用该技术，明显看出与没有结合配体的对应材料相比，以上描述的化学性质增加了我们所描述的材料的无定形相。这可以使用高角度环形暗场像差校正扫描透射电子显微镜而尤其明显地看出，由于该仪器在保持分辨率的同时达到的高对比度，因此允许材料的原始颗粒的表面和原始颗粒的团块得以可视化。上述的这些物理化学性质的结合促进铜离子的迅速释放，并且如实例所示，转化为对宽范围的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有高杀菌功效。重要地，不像铜盐(例如cucl2)或商用的铜纳米颗粒，修饰有羧酸根的氧基-氢氧化物当被加入诸如羟乙基纤维素凝胶(一个外用(topical)递送基质的例子)的递送基质中，可以释放杀生水平的铜，表明配体功能化可以用于发展外用杀生物剂或用于提供能够为制品提供抗菌涂层的组合物。使用本发明可以有效调控的性质的例子包括：溶出(速率，ph相关性和[cu]相关性)、解聚、吸附和吸收特性、反应性-惰性、熔点、耐温性、粒径、磁性、电性质、密度、光吸收/反射性质、硬度-软度、颜色和包封性质。在此上下文中，如果在标准差优选±10％，并且更优选±5％，并且甚至更优选地在±2％的限度以内，再现重复实验，则性质或特性是可以再现的。特别地，本发明的发明人发现，在二次悬浮已被干燥——例如用于储存——的组合物的情况下，仍然保留着氧基-氢氧化铜纳米颗粒的性质，例如易分解性。配体修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物的溶出曲线可以通过过程的不同阶段来表示，即解聚和溶出。术语溶出用来描述物质从固相到可溶相的转变(passage)。此外特别是，解聚旨在描述材料从固体聚集相到水合相的转变，水合相为可溶相与水合微粒相的总和(即溶液相加悬浮液相)。因此，和解聚相对，术语溶出进一步特别表示从任何固相(聚集的或水合的)到可溶相的转变。配体(l)由化学式(mxly(oh)n)表示的配体修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物中，l表示一种或多种可以结合到配体修饰的聚氧基-羟基金属离子固相材料中的配体或阴离子，例如初始为其质子化或碱金属化的形式。在本文中所描述的材料中，配体中的至少一种是羧酸配体或其电离形式(即羧酸根配体)，例如酒石酸根(或酒石酸)、葡萄糖酸根(或葡萄糖酸)、己二酸根(或己二酸)、谷胱甘肽和/或氨基酸和/或糖酸。优选地，该配体是单羧酸配体或二元羧酸配体，并且可以由化学式hoch2-r1-cooh或hooc-r1-cooh(或其电离形式)表示，其中r1是——可选地被取代的——c1-10烷基、c1-10烯基或c1-10炔基。通常，优选使用的配体是其中的r1是c1-10烷基，更优选c2-6烷基。r1基团的优先可选的取代基包括一种或多种羟基，例如像苹果酸中存在的那样。在优选的实施例中，r1基团是直链烷基。更优选的羧酸配体的组包括酒石酸(或酒石酸根)、葡萄糖酸根(或葡萄糖酸)、己二酸(或己二酸根)、戊二酸(或戊二酸根)、庚二酸(或庚二酸根)、琥珀酸(或琥珀酸根)、苹果酸(或苹果酸根)及其组合。羧酸配体是作为酸存在还是部分或完全电离并以羧酸根阴离子的形式存在，将取决于一系列因素，例如生产和/或回收材料的ph，生产后的处理或配制步骤的使用，以及配体是如何结合进聚氧基-羟基金属离子材料的。在一些实施例中，由于材料通常是在ph>4下被回收的，并且因为配体与带正电荷的离子之间的相互作用会因为带负电荷的羧酸根离子的存在而被大大增强，所以至少一部分配体将以羧酸根的形式存在。为了避免疑义，根据本发明的羧酸配体的使用涵盖所有这些可能性，即该配体以非电离形式作为羧酸存在、以部分电离形式(例如，如果配体是二元羧酸)或以完全电离形成作为羧酸根离子存在以及以它们的混合物存在。通常，配体被引入固相聚氧基-羟基金属离子材料以辅助修饰固体材料的物理化学性质——例如与不存在配体的聚氧基-羟基金属离子种类相比。在本发明中的一些实施例中，配体l还可具有一些缓冲能力。可以在本发明中采用的配体的实例包括但不限于：诸如酒石酸、葡萄糖酸、己二酸、戊二酸、苹果酸、琥珀酸、天冬氨酸、庚二酸、柠檬酸、乳酸或苯甲酸的羧酸，诸如麦芽醇、乙基麦芽醇或香草醛的食品添加剂，诸如色氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、缬氨酸或组氨酸的氨基酸，以及诸如叶酸、抗坏血酸根、吡多辛或烟酸或烟酰胺的营养物型配体，诸如葡萄糖酸的糖酸。通常，在这些材料的生产中使用对金属离子有不同亲和力的两种配体，但是在某些应用中一种、两种、三种、四种或多种配体可能是有用的。对于许多应用，配体需要在所使用的条件下为生物相容的，并且一般在反应的点具有一个或多个带孤对电子的原子。该配体包括阴离子、弱配体和强配体。配体在反应中可具有一些固有的缓冲能力。在不希望被束缚于特定解释的情况下，发明人认为配体具有两种相互作用的模式：(a)取代氧基或羟基，并因此以很大程度上的共价特征被结合到材料中，和(b)非特异性吸附(离子对形成)。这两种模式有可能涉及不同的金属-配体亲和力(即针对前者的强配体和针对后者的弱配体/阴离子)。我们目前的工作中存在一些证据证明两种类型的配体在调节材料的溶出特征中——以及可能因此在确定材料的其他特征中——起协同作用。在本案中，使用两种配体类型，并且至少一种(类型(a))可证明为显示了材料中的金属键合。配体效力，可能尤其针对类型(b)配体，可能会受体系中其它成分的影响，特别是电解质。金属离子与配体(l)的比例也是固相配体修饰的聚氧基-羟基金属离子材料的一个参数，其可根据本文公开的方法变化，以改变材料的性质。通常地，cu和l的有用比例在10:1、5:1、4:1、3:1、2:1和1:1以及1:2、1:3、1:4、1:5或1:10之间。优选地，cu和l的比例为1:1或更低。氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物的生产和处理通常地，本发明的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物可以通过以下方法生产，该方法包括：(a)将包括cu3+和羧酸配体的溶液，以及可选地任何另外的配体或其他组分在组分可溶解的第一ph(a)下在反应介质中混合；(b)将ph(a)改变至第二ph(b)，以引起形成氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物的固体沉淀或胶体；(c)分离，以及可选地干燥和/或配制步骤(b)中生产的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物。可以采用的条件的例子包括以下使用小于4.0的第一ph(a)，和在5.0至12.0之间、更优选地在6.0至8.0之间的第二ph(b)，在室温(20-25℃)下进行反应。通常，优选地在步骤(a)中，溶液包含20至100mm或1m的cu2+以及50至250mm的合适的羧酸配体，并且更优选约40mm的cu2+和约100mm的羧酸配体。分离候选材料后可以是对材料进行表征或测试的一个或多个步骤。举例来说，测试可以在体外或体内进行来测定上述材料的一种或多种性质，最显著的是其溶出曲线、可溶性铜的释放和/或抗菌性质。可替代地或附加地，该方法可以包括例如通过滴定方法化学地，或例如通过微粉化(micronizing)方法物理地改变氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物的最终粒度和/或使组合物经受一种或多种其他的处理步骤以产生最终组合物，例如用于向受试者给药。其他的步骤的例子包括但不限于：洗涤、离心、过滤、喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥、烘箱干燥、透析、研磨、制粒、封装、制片(tableting)、混合、压制(compressing)、纳米化和微粉化。在一些实施例中，额外的步骤可以在材料的初始生产与配制成医用品的任何后续步骤之间进行。这些额外的制造后修饰的步骤可包括洗涤材料的步骤来去除杂质或用另外的配体来替换所结合的配体。羟基或氧基本发明可以采用任何方法形成氢氧根离子，该氢氧根离子处于可在这些聚氧基-羟基材料的形成中提供羟基表面基团和氧桥的浓度下。例子包括但不限于将添加诸如氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸钠和碳酸氢钠的碱溶液以增加ml混合物中的[oh]，或者将添加诸如无机酸或有机酸的酸溶液以减少ml混合物中的[oh]。用于生产本发明的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物的条件可以调整以控制沉淀的物理化学性质，或者另外帮助其收集、回收或者与一种或多种赋形剂配制。这可能涉及有目的的团聚抑制，或者所使用的随后影响材料性质的干燥或研磨步骤。然而，这些是用于从溶液相提取固体的任何这种体系的通常变量。在分离经沉淀的材料后，可以在使用或进一步配制之前可选地干燥。然而，该干燥的产物可以保留一些水分，并且是以水合配体修饰的聚氧基-羟基金属离子固相材料形式的。对本领域技术人员将是明显的，在本文所描述的用于回收固相的任何阶段，均可以添加赋形剂，赋形剂与配体修饰的聚氧基-羟基金属离子材料混合但是不改变原粒径，并且赋形剂是为了优化为了材料的预期功能的配制而使用的。这些赋形剂的例子可以是但不限于，糖脂、磷脂(如磷脂酰胆碱)、糖和多糖、糖醇(如甘油)、聚合物(如聚乙二醇(peg))和牛磺胆酸。配制和使用本发明的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物可以配制为用作抗菌剂或抗微生物剂，例如用于细菌或微生物感染的治疗或预防。因此，除了一种或多种本发明的固相材料之外，本发明的组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其他材料。这样的材料应该是无毒的并且应该不显著干扰所考虑应用的固相材料的效力。本文中使用的术语“抗菌”包括治疗或预防由革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物或者真菌引起的感染。革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物包括诸如大肠杆菌的埃希氏杆菌属，诸如表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(“mrsa”)的葡萄球菌属，诸如枯草芽孢杆菌的芽孢杆菌属，诸如铜绿假单胞菌的假单胞菌属，诸如费氏弧菌的弧菌属，诸如化脓性链球菌和肺炎链球菌的链球菌属，克雷伯氏菌属，诸如藤黄微球菌的微球菌属，诸如艰难梭状芽孢杆菌的梭菌属，诸如鲍曼不动杆菌的不动杆菌属，诸如结核分枝杆菌的分枝杆菌属，以及沙门氏菌属；真菌包括诸如白假丝酵母菌的假丝酵母菌属。本文中使用的术语“抗微生物(antimicrobial)”应理解为适用于——包括抑制微生物附着到表面的那些的——物质、杀死微生物(microbe)和/或抑制微生物的繁殖。术语“微生物(microbe)”应理解为包括所有的微生物(microorganisms)，该所有的微生物包括上面陈述的细菌、诸如酵母菌的真菌、古生菌和原生生物。术语“微生物的(microbial)”和“抗微生物(antimicrobial)”应该相应地解释。本发明的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物的使用将非常取决于该组合物是旨在治疗或预防人类受试者或动物受试者的感染，还是向抵抗细菌或微生物定植(colonisation)的制品提供表面。后者应用的例子包括为医疗设备或敷料提供涂层。在组合物旨在用于向受试者给药的实施例中，例如治疗创伤或者皮肤感染，载体或其他组分的确切性质可能与组合物的给药方式或途径是相关的，通常是通过外用途径。这可包括在固体、半固体或胶体基质中，或者在诸如水、石油、动物油、植物油、矿物油或合成油的液体载体中的纳米颗粒组合物制剂。载体的例子包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖的溶液，或者可以包括二元醇，例如乙二醇、丙二醇、聚乙二醇。提供给个体的根据本发明使用的材料和组合物优选地以足以显示出对个体临床状态益处的“预防有效量”或“治疗有效量”(视情况而定，虽然预防可以看作是治疗)给药。给药的实际的量、给药的速度和时程将取决于所治疗的性质和严重程度。诸如剂量的决定等治疗处方，在从业者或其他医师的职责内，并且通常考虑到待治疗的疾病、个体患者的状况、递送的部位、给药的方法以及从业者已知的其他因素。以上提到的技术或方案的例子可以在remington'spharmaceuticalsciences(雷明登氏药学全书),20thedition,2000,lippincott,williams&wilkins中找到。组合物可以单独给药或与其他治疗结合，结合时可以同时或依次进行，取决于待治疗的状况。在一个实施例中，本发明的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物在基质中配制，例如诸如羟乙基纤维素(hec)、羟甲基纤维素(hmc)的羟烷基纤维素基质或诸如peg的聚二醇基质。这些基质中的一些是在保健品和化妆品中被广泛使用的纤维素衍生物，并且具有在基质制备过程中不需要进一步处理(例如加热或干燥)纳米颗粒的优点，因此对纳米颗粒组合物的抗菌和抗微生物性质具有最低限度的影响。在另一实施例中，本发明中的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物配制为外用给药，例如以固体或半固体软膏的形式用于创伤、溃疡的治疗或细菌感染的治疗或预防。在这种应用中，聚二醇很适合材料的外用递送，因为它们形成乳膏或软膏，并且在不同的分子质量范围内是可获得的，从而允许调整到最终软膏中期望的黏度和其它物理参数。本发明在外用产品的应用具有创伤愈合的治疗用途和在抗感染组合物中的治疗用途。组合物配制为向受试者给药的本发明所有方面中，优选将组合物或含有组合物的制剂的ph调整至生理ph，优选地调整至ph5.0-9.0之间，更优选地调整至ph6.0-8.5之间。实例显示本发明的组合物可形成在这些条件下生物可利用的游离铜。方便地，这可以通过加入碱来完成，例如氢氧化钠和碳酸钠。这样做的目的是从而向受试者给药将不会导致非预期的临床结果，例如疼痛或炎症。本文中的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物的有效量可以按照外部应用配制，例如向皮肤、牙齿、指甲或者头发。这些组合物可以是以乳膏、洗剂、凝胶、悬浮液、分散质、微乳液、纳米分散体、微滴、水凝胶、乳剂(水包油和油包水以及复合乳剂)和多层凝胶等形式(见，例如，thechemistryandmanufactureofcosmetics(化妆品的化学和制造)，schlossman等，1988)，并可配制为水性组合物或硅胶组合物，或者配制为一种或多种油相在水连续相(或水相在油相中)中的乳剂。本发明中使用的载体类型取决于外用组合物的性质。载体可以是固体、半固体或液体。合适的载体是液体或半固体，例如乳膏、洗剂、凝胶、黏性物(stick)、软膏、糊剂、喷剂和摩丝。尤其是，载体是以乳膏、软膏、乳剂或凝胶的形式，更尤其是，具有足够的厚度或屈服点(yieldpoint)以防止颗粒沉积。载体本身是惰性的或可以具有自身的益处。载体也应与抗菌组合物或配制在载体中的其他配料物理相容和化学相容。载体的例子包括水、羟乙基纤维素、丙二醇、丁二醇、聚乙二醇或其组合物。除了配体修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物的治疗用途，它们还可以作为制品的抗微生物或抗菌涂层应用，例如底物的涂层，底物包含织物、无纺布、塑料、玻璃和/或金属。涂层的抗微生物性质使它们特别适合应用于医疗或个人护理应用中的底物。特别是，这些涂层对与身体——例如与皮肤或者黏膜——接触的底物，在一般用途——例如敷料、绷带和膏药——中特别有用。例如，微生物的生长是当皮肤或者黏膜被诸如创伤敷料、尿布或内衣覆盖时的一个特别的问题。当皮肤或者黏膜一被覆盖，微生物的生长环境就改善了。存在于被覆盖的皮肤或黏膜上的微生物可以以提高的速率繁殖，特别是当环境潮湿和/或没有暴露到空气中时。这些微生物的分泌物包括可以改变皮肤ph的酸性或碱性排泄物、毒素分泌物和包括蛋白酶分泌物的酶分泌物。这些分泌物和排泄物可以引起皮肤或黏膜刺激，并且在更严重的情况下导致皮肤或黏膜的破坏，例如皮炎。在皮肤或黏膜被覆盖之后可能发生的特殊情况包括念珠菌阴道炎(thrush)。念珠菌阴道炎是真菌感染，通过酵母菌中的假丝酵母菌属，特别是白假丝酵母菌感染。症状包括痒、发热和疼痛，以及感染区域的炎症。卫生巾、失禁垫、尿布和/或紧身内衣的穿着可以提供有利于假丝酵母菌生长的条件，这可以导致念珠菌阴道炎。本发明的涂层可有效地抵抗真菌，例如酵母菌，因此，应当理解，将本发明的涂层供应至上面提及的物品可以治疗和/或预防念珠菌阴道炎。类似地，接触性皮炎(通常被称为尿布疹)可以因穿着失禁垫或尿布引起。潮湿或湿润的皮肤丧失它的结构，高ph可促进细菌生长并且细菌可分泌破坏皮肤组织的酶。这种环境还可促进或加剧压力性溃疡(通常被称为褥疮)，压力性溃疡当被感染后特别地棘手。已发现本发明的涂层可有效地抵抗细菌，因此应当理解的是，将本发明的涂层提供至止血栓、卫生巾、失禁垫或尿布可以治疗和/或预防接触性皮炎和/或压力性溃疡。出于类似的原因，接触性皮炎和酵母菌感染可能发生在医用敷料的下面，例如创伤和烧伤用的敷料。关于医用敷料的额外考虑是需要防止创伤或烧伤的细菌感染。当皮肤被烧伤时，大量的组织被破坏，这可以降低或破坏皮肤的自然屏障特性，破坏皮肤的创伤也影响皮肤的屏障特性。这会导致延迟治愈的机会性感染的和败血性休克。此外，微生物感染，特别是细菌感染，可以成为外科手术后的问题。使用被本发明的抗微生物涂层覆盖的医疗或外科手术装置(例如植入性的医疗装置)可以帮助预防或治疗术后感染。因此，应当理解的是，向用于创伤和/或烧伤的敷料上提供本发明的涂层可以治疗和/或预防接触性皮炎和/或微生物感染。本发明的氧基-氢氧化铜纳米颗粒组合物然后可以用于医用品的制造，该医用品用于微生物感染和/或诸如炎症、皮炎的皮肤、黏膜疾病的治疗和/或预防。特别是，该抗菌或抗微生物涂层可对创伤感染、烧伤的感染、压力性溃疡的感染、术后感染、念珠菌阴道炎、接触性皮炎和压力性溃疡的治疗和/或预防有用。该微生物感染可以通过任何微生物，特别是细菌和/或酵母菌，例如诸如金黄色葡萄球菌的葡萄球菌属、诸如铜绿假单胞菌的假单胞菌属、诸如藤黄微球菌的微球菌属、诸如酿酒酵母的酵母属、诸如白假丝酵母菌的假丝酵母菌属、诸如表皮葡萄球菌的葡萄球菌属、诸如化脓性链球菌的链球菌属、克雷伯氏菌属、诸如大肠杆菌的埃希氏杆菌属和衣原体属。组合物还可以有效抵抗病毒和寄生虫。该医用品可以是通过本发明的涂层方法覆盖的底物。例如，该医用品可以是被覆盖的底物，比如被覆盖的医疗装置，该医疗装置例如植入性医疗装置。例子包括外科种子(surgicalseed)，导管(例如导尿管、血管通路导管、硬膜外导管)、血管通路端口、血管内传感器、气管切开插管、经皮内镜胃造口术管、气管内导管、诸如支架和相关短期留置或生物接触装置的植入假体装置。该医用品可以是被覆盖的底物，例如被覆盖的尿布、卫生巾、止血栓、失禁垫、诸如创伤敷料或烧伤敷料的敷料、绷带、或内衣。这些底物中的许多(特别是尿布、卫生巾、失禁垫以及诸如创伤敷料或烧伤敷料的敷料)包括在一般用途中可以与皮肤或黏膜接触的无纺布成分。本发明的发明人已证明本发明的涂层和涂层方法特别适合无纺布底物。本文中使用的术语“无纺布”包括由纤维网形成的织物或纺织品。在无纺布中，纤维不是梭织的或针织的。无纺布通常通过以片或网的形式将小纤维放在一起，然后将其机械粘合。无纺布的例子包括聚丙烯无纺布。应当理解的是医用品的制造方法可包括向底物上提供抗微生物涂层。因此，医用品的制造可包括本文中所描述的用于提供抗微生物涂层的方法中的任何步骤。本发明还提供通过本发明的方法覆盖的底物。被覆盖的底物可用于医学治疗方法中，并包括上述被覆盖的底物作为可能的医用品。应当理解的是，本发明还提供一种医疗方法，该方法用于治疗和/或预防微生物感染和/或皮肤或黏膜疾病，并提供了本发明的被覆盖的底物在这种方法中的用途。本发明的涂层方法可应用于覆盖本文提及的底物，作为医用品或其他。除了上面描述的应用外，抗微生物涂层还可提供在用于医疗应用的其他设备上，例如在医院。在医院，对细菌感染的控制有着显著的兴趣，特别是诸如mrsa和艰难梭状芽胞杆菌的细菌感染。如上所讨论的，表面的微生物定植是一个特别的问题。然而，已发现本发明的涂层可有效抵抗许多种类的微生物，因此应当理解的是，向医院设备的表面提供本发明的抗微生物涂层是有益的。因此，根据本发明可被覆盖的底物包括在一般用途中和身体或体液接触的医疗设备和装置。例如适合的底物包括试管(tubes)、点滴包(fluidbags)、导管、注射器和诸如手术刀和手术钳等的外科手术设备。因此，诸如在医院中使用的其他设备(例如医疗保健设备)可根据本发明被覆盖，例如袍(例如手术袍)，手术口罩，防护手套(例如手术手套和检查手套)，帘，制服，以及诸如枕头套、防水床垫套(例如用在婴儿床和重症监护病床)和床单的床上用品。可供选择的医疗保健设备包括手术帷帘，手术袜，诸如桌子(包括床头桌)、床和座椅表面的家具，以及包括储存容器、过滤器和服务托盘的其他设备。此外，本发明的涂层在覆盖期望保持无微生物的设备上是有用的，例如用于处理食物的设备(诸如厨房设备和表面)、用于制造或处理食物的工厂设备。例如根据本发明可以被覆盖的底物包括容器(例如食物储存容器)、输送机、刀片、搅拌器、碾子和厨房用具(例如切削和上菜工具)。另外的底物包括食物准备表面、柔性和刚性包装以及门把手。此外，工人穿着的诸如外套、手套、口罩和帽子的防护服可被覆盖。其他可被覆盖的衣服包括内衣、袜子、运动服、手术服、医疗保健服、鞋子和靴子。其他适合被覆盖的底物包括过滤器，例如医用过滤器(包括呼吸器过滤介质和液体过滤介质)，以及包括hvac过滤介质、水过滤介质和液体过滤介质的其他过滤器。其他适合的底物包括货币、借记卡/信用卡、工业废物和水处理设备、石化和原油产品、分发和储存设备以及基础设施。此外适合的底物包括个人防护设备和军事器具，例如面罩、呼吸器、净化服和手套。实验实例除非另有声明，所有实验都使用超高纯(uhp)水(蒸馏的去离子水，18.2ωμ/cm)，在室温(20±2℃)下进行。1.1铜材料的合成和制备1.1.1氯化铜储备溶液cucl2·2h2o溶解于uhp水中得到后续实验中使用的40mm(2542ppmcu)的浓缩储备溶液。1.1.2cuo纳米颗粒商用的cuo纳米颗粒从西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)(544868)获得，并按来样使用，且用于与本发明的抗菌组合物对照。储备悬浮液通过将纳米粉末以20mm(1270ppmcu)分散在uhp水中来制备。1.1.3硅酸根-稳定的氢氧化铜纳米颗粒(cusinp)cusi纳米颗粒为对照目的而制备，通过将大约ph12的400mm硅酸钠溶液和氯化铜溶液(40mmcu)以1:1的体积比混合来制备。产生的悬浮液包含20mmcu和200mmsi，其ph用5mnaoh调整至12±0.2，并维持搅拌24小时。经过这段时间，形成了浅蓝色透明溶液。1.1.4cu-edta络合物cu-edta络合物是通过在uhp水中溶解cucl2·2h2o和乙二胺四乙酸(edta)钠二水合物而现(freshly)制备的。ph用1mnaoh调节至7.5±0.2。通过保持铜浓度在20mm(大约1270ppm)，同时改变edta的浓度得到了多种cu:edta的比例，其中，edta的浓度分别为20、100和200mm，得到的cu:edta的比例分别为1:1、1:5和1:10。铜的溶解度使用元素相分布(elementalphasedistribution)通过icp-oes确认(见2.4.1)。1.1.5酒石酸根己二酸根修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒(cutartadnp)制备包含40mm氯化铜、20mm己二酸和20mm酒石酸的酸性溶液。该初始为酸性的酸溶液的ph通过逐滴加入5mnaoh提升至ph8.2±0.2。最终的悬浮液包含大约40mm(2500ppm)cu。按照实例1.1.5合成的纳米颗粒用铜相分布表征。在合成过程中，随着ph的升高，可溶性的铜转化为氧基-氢氧化铜微粒。在ph5以上，该微粒相主要由纳米颗粒组成(分数大于总微粒的80％)。1.2纳米颗粒表征1.2.1流体力学粒度分布纳米颗粒的流体力学粒度分布通过动态光散射(dls)在zetasizernanozs(马尔文仪器公司)上测定。在一典型的实验中，在室温(20±2℃)下，将0.5-1ml的纳米微粒悬浮液(如2.1中制备的)转移至小的一次性容器中，并使用以下设置进行3次测量：1.2.2ζ电势在zetasizernanozs(马尔文仪器公司)上，通过激光多普勒微电泳，使用78.5的介电常数、0.89cp的黏度分析ζ电势。大约1270ppmcu的纳米颗粒悬浮液被转移进干净的一次性ζ样品池(zetacells)以进行测量。1.2.3透射电子显微镜(tem)通过tem分析包含2500ppmcu的cutartad纳米颗粒悬浮液。通过将纳米微粒悬浮液分散在甲醇中并滴涂在多孔碳膜tem栅网(琼脂科技(agarscientific))上来准备tem栅网。图像从配有牛津仪器(oxfordinstruments)x-max80mm2sd检测器和aztec分析软件的cm200(s)tem上获得。1.2.4x-射线衍射(xrd)分析在常规x-射线衍射(xrd)分析之前，cutartad纳米颗粒在45℃下干燥24小时并手动研磨。1.3细菌研究1.3.1重金属mops(hmm)培养基，ph7.2±0.2hmm是为测试重金属而研制的无铜的确定成分培养基，并在此辅以葡萄糖和酪蛋白氨基酸(酸水解酪蛋白)以提供细菌生长所需要的所有基本营养素。hmm从每个试剂的浓缩储备溶液中制备，并调整ph至7.2±0.2(表1)。现制备的培养基立即在121℃下用高压蒸汽处理15分钟，使冷却并在4±2℃下储存。高压处理的培养基自制备一个月内使用。表1hmm培养基的组成试剂在hmm培养基中的浓度3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)40mmkcl50mmnh4cl10mmmgso40.5mmfecl3·6h2o1μm2-磷酸甘油1mm葡萄糖0.4％(w/v)酪蛋白酸水解产物0.1％(w/v)1.3.2细菌生长抑制实验抗微生物活性通过含铜化合物存在下测定细菌生长抑制来评估。使用比浊法以观察随时间的细菌的浓度，在液体培养基中这与光密度(od以595nm)成比例，从而允许简单筛查随时间的细菌生长。大肠杆菌nctc11100和金黄色葡萄球菌rn4220是本实验中被测试的微生物。储备菌落保持培养在琼脂板中，并且在实验的前一天将一个菌落转移至10ml的hmm液体培养基中，并在30℃、恒定震荡(80rpm)下，在恒温箱中生长过夜。在实验当天，细菌悬浮液的od在595nm下在酶标仪(multiskanrc351,雷勃(labsystems))上测量，并在hmm中稀释以获得0.05-0.1(cfu)之间的od，确保了全部实验中细菌的初始浓度保持恒定。铜储备溶液(参考2.1节)次序地稀释在hmm中以达到在0.1ml的体积中0.8-100ppmcu之间的典型浓度。接着，添加0.1ml的细菌培养物并在30℃、恒定摇动(80rpm)下与铜一起培养。最终实验中铜的浓度范围在0.4-50ppm之间，在7-8个小时的典型期间每小时测量od以观察细菌生长。测定od背景——即不是由细菌引起的od吸收率，以去除铜和培养液的读出(readout)干扰。生长抑制的计算如下：od对照：减去培养基(无细菌)的od后的无铜时hmm中培养的细菌的odod铜：减去培养基加上匹配浓度的铜(无细菌)的od后的存在铜时hmm中培养的细菌的od。1.3.3铜-细菌结合通过初始使细菌培养物在ph7.2±0.2下(参考2.3.2中描述的)在hmm中生长过夜来研究铜和大肠杆菌nctc11100培养物的结合，生长过夜是为达到稳定期，使得在整个实验中细菌的浓度保持恒定。这个浓度通过琼脂板计数测定为9×108cfu/ml。然后，氯化铜储备溶液在细菌培养物中稀释至3和12.5ppmcu，并在30℃下培养。在0、2、4、8小时收集样品。在每一个时间点上，使用每个样品的一份试样来测定总的铜浓度，并将第二份在台式biofugepico(离心机)(贺利氏(heraeus))上以16000g离心5分钟以沉淀细菌和结合的铜。上清液中的游离铜通过电感耦合等离子体发射光谱分析(根据2.4.1)。最后，结合到细菌的铜如下测定：结合到细菌的[cu]＝总的[cu]-上清液[cu]1.4化学测定1.4.1元素铜分析电感耦合等离子体发射光谱(icp-oes)用于测定元素铜浓度。在分析之前所有的样品稀释在5％的hno3(v/v)中至少24小时以溶解铜材料。校正标准是与基质匹配，以5％的hno3，0.1-100ppm的范围。用于铜检测的谱线为324.754nm。1.4.2铜相分布测定：可溶性的、纳米微粒和微米微粒的分数通过分离可溶性的铜(<1.4nm)、纳米微粒的铜(<100nm)和亚微细粒/微米微粒的铜(>100nm)测定相分布。收集三个样品，1)总的，铜浓度整分析；2)上清液，在16000g下离心5分钟，接着是上清液分析；和3)可溶性的，通过3kda过滤器过滤。相分布如下计算：纳米微粒的铜％＝cu可溶(％)-cu微米微粒(％)铜基纳米颗粒溶出在细菌生长培养基(hmm)中研究了铜纳米颗粒的溶出。铜材料从储备溶液(见2.1节)稀释至12.5、25、50ppm铜，并在0、2、4、8小时收集试样。可溶性铜的分数通过2.4.2节描述的相分布分析测定。1.4.4铜分散性储备铜材料稀释在ph7.4±0.2的50mm3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)缓冲液中。最终铜浓度变为10-500ppm之间。微米微粒的铜通过16000g下离心5分钟被移除。总的铜和上清液(即分散的部分)通过2.4.1节描述的电感耦合等离子体发射光谱(icp-oes)分析。1.4.5铜从胶体基质释放——胶体释放实验通过在uhp水中将包含大约2500ppm的原始储备溶液稀释降至250ppm，然后溶解羧乙基纤维素(hec)以达到2％(w/v)的浓度，从而将在ph7-8之间的cucl2和cutartad纳米颗粒结合到羟乙基纤维素(hec)基质中。混合物在旋转振荡器中保持在恒定搅拌下直至形成均匀的胶体。将10g的胶体注入50ml的离心管中并使其沉淀过夜。10ml在ph7±0.2下的50mmnahco3溶液被小心转移至胶体的表面。在24小时期间收集样品，并且顶部溶液中铜的浓度通过icp-oes测定(见2.4.1节)。2.铜基纳米颗粒作为杀生性铜离子的递送剂使用比浊法以测试纳米微粒材料的抗微生物活性，其中，在液体培养基中通过光密度测量观察大肠杆菌的浓度，从而可以原位表征铜相分布。在广泛的铜浓度范围存在下培养细菌，并使用氯化铜作为参照杀生材料以提供可溶性铜，见图1。这项工作的下个阶段需要选择合适的纳米微粒材料。最初，研究了标示尺寸大约为50nm的商用cuo纳米颗粒，然而，当分散在水中时，这些纳米颗粒形成了大的微米级团聚物(图2a)。它们意想不到的可分散性的缺乏通过弱表面排斥来解释，正如被只有-7.1±0.5mv的ζ电势峰所证明的。因此，使用了替代的铜基纳米颗粒作为真正的纳米微粒剂，即，在实验中适合递送的浓度下的稳定胶质。考虑到其缺乏抗微生物活性，硅酸根被选作稳定剂，因此颗粒的毒性仅仅受铜影响。该产生的参照硅酸根-稳定氢氧化铜纳米颗粒(cusi纳米颗粒)因此通过共沉淀合成，其中，氯化铜溶液与碱性硅酸钠溶液在大约ph12下混合。最初，cu2+离子沉淀为cu(oh)2，形成微米级团聚物，但是这些团聚物随着时间分散形成具有8.5±0.3nm的流体力学直径峰的小的纳米颗粒(图2d)。预期这个分散过程是被带负电荷的硅酸根离子吸附至氢氧化铜团聚物驱动的。此外，硅酸根-铜的高比例(10:1)确保了有效的负电荷排斥，正如被ζ电势测量所证实的，ζ电势测量显示该纳米颗粒带有充足的负电荷(-31±9mv)来抵抗团聚(图2b)。然后，这两种截然不同类型的纳米颗粒——cuo和cusi——的抗微生物活性与可溶性铜对照组(cucl2)进行对照，该对照是以跨一定范围的铜浓度(0.8-50ppmcu)来抵抗大肠杆菌。发现纳米颗粒不如可溶性铜有效，这尤其很好地示出在50ppmcu的暴露水平下(图3)。此处，暴露于cusi纳米颗粒的生长抑制在后面的时间点更明显，意味着cusi纳米颗粒对细菌具有逐渐的和延迟的效果。意外地，尽管观察到团聚，在6小时时，cuo纳米颗粒显示了与cusi纳米颗粒相当的生长抑制。但是，随时间的抑制的增加没有像cusi纳米颗粒一样明显。纳米颗粒类似的杀生动力学(即都显示了逐渐的和延迟的生长抑制)可能意味着截然不同于可溶性铜作用模式的共同的纳米微粒作用模式，例如粘附至细菌膜上。然而，考虑到纳米颗粒之间在物理化学上的差异(例如尺寸、电荷和组成)，这种机理看起来不太可能。例如，具有不同表面电荷的纳米颗粒被预期对细菌膜显示不同的亲和力，并且因此显示不同的抗微生物活性，这一点在此并没有观察到。更合理地，基于从纳米颗粒中释放铜离子的溶出介导机理可解释相对于氯化铜延迟的毒性，并且被两种材料各自的溶出曲线所支持。铜离子的释放与生长抑制一致，其中cuo纳米颗粒较快的溶出产生了在较早的时间点(2-4小时)较强的抗微生物效力。4小时之后，从两种纳米颗粒的任一种中释放的可溶性铜的百分数是相当的(大约是总的铜的40％)，其转化为类似的细菌生长抑制(大约80％)。两种类型的纳米颗粒的溶出曲线的相似性令人惊讶，因为预期更小的cusi纳米颗粒溶解更快，这是由于它具有更高的表面积/体积比，但是纳米颗粒结构中的不溶性硅酸盐的存在可能减慢了溶出。重要的是，溶出和细菌生长抑制之间的关联意味着对两种类型的纳米颗粒来说杀生活性受可溶性铜影响。为了进一步阐明“溶出”理论，比较了细菌培养基中的可溶性的铜(<1.1nm)和纳米颗粒的铜(1-100nm)部分的大肠杆菌的生长抑制。观察了cuo材料的剂量应答，其中提高铜的水平(12.5、25、50ppm)导致了生长抑制的提高(图4)。然而，团聚导致了非常低的纳米微粒铜的浓度(<3ppm)，因此生长抑制的提高不能归功于纳米微粒铜部分，而是归功于可溶性铜的提高。cusi纳米颗粒与商用的cuo纳米颗粒表现出截然不同的方式：这里，更大量的材料产生了提高的纳米微粒铜的浓度(3、10和38ppm)，但是相对不变的可溶性铜的水平(10-15ppm)。然而，纳米微粒铜的如此的提高没有产生增加的杀生活性作用，并且反而，生长抑制与相对稳定的可溶性铜的水平一致。杀生活性对可溶性铜的依赖性，建议了最佳的抗菌效力应由铜盐达到，铜盐易于在用于生长抑制实验的培养基中递送可溶性铜离子(图4)。然而，在诸如创伤愈合(包括治疗切伤和擦伤)的临床应用中，铜作为抗微生物剂的使用，要求以远高于抗微生物实验中所测试的那些浓度(<50ppm)来配制，以使铜的递送量可以有效地杀死细菌。除此之外，这些制剂需要在生理ph(ph6-8)下递送，以避免极端ph对由于创伤而已经易受伤害的皮肤的进一步不利影响。因此，通过量化铜盐的分散性(即，非沉淀，在ph7.4±0.2的mops缓冲剂中)作为生物利用度的指征来研究用于创伤愈合的制剂中铜盐的适宜性。大部分铜以大的可离心的团聚物沉淀，尽管以高达500ppm的浓度添加铜，但是可分散的部分降低至最大约为10ppmcu。因此，铜盐有限的用于制剂中，因为铜盐不稳定，趋于沉淀，沉淀限制了生物可利用的铜。通过形成大的(可离心的)氢氧化铜团聚物，铜盐在生理ph下出现了不期望的沉淀，这可以通过使用络合剂(例如edta)来避免。例如，在生长抑制实验中，由于培养基中存在的可能是氨基酸的络合剂，铜在该细菌培养基中被维持为是可溶的。以多种cu:edta比例，采用了这种策略的可行性，并且在细菌实验中测试了得到的溶液(图6a)。尽管将铜保持在溶液中，cu-edta络合物显示了不太高的生长抑制(<40％，图6b)。有趣地是，edta本身具有抗菌效果，这可能是该络合物的抗菌效果的大部分原因。这种观察结果显示尽管铜离子的释放对于抗菌目的是必不可少的，但是可溶性铜的形式也是重要的，并且当存在诸如edta的强络合剂时候，游离铜离子的可用率是降低的，因为如此强的螯合物与细菌竞争铜，导致了毒性的降低。尽管与铜盐相比铜基纳米颗粒观察到了延迟的生长抑制(图3)，但是纳米颗粒显示出了比铜络合物更强的抗微生物活性，意味着其有更强递送游离铜离子的能力。因此，它们对临床制剂的适宜性也在与上述用于氯化铜的条件相同的条件下，进行了测试。总的来说，这最初的工作的主体证明了铜基纳米颗粒对细菌几乎没有或没有直接效果，且他们的杀生活性是通过铜的主要杀生形式——铜离子的释放引起的。不像不适合释放游离铜离子的铜盐和铜络合物，纳米颗粒作为针对那样的物种的递送系统具有巨大的潜力，并且可以维持分散在适当的浓度下以用于临床应用中的制剂。然而，在这项工作中测试的cuo和cusi纳米颗粒不是最佳的，因为发现铜离子释放的速率低。3.用于递送铜离子的新颖有效的铜基纳米颗粒3.1简介因为铜基纳米颗粒最大化的抗微生物效力可以通过铜离子的快速释放达到，我们尝试了通过促进易分解矿物相形成的合成方法来修饰其矿物结构以生产这种不稳定的材料。3.2配体修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒通过氯化铜溶液的ph-驱动沉淀来制备氧基-氢氧化铜矿物，实现该ph-驱动沉淀是通过向氯化铜溶液中逐滴加入氢氧化钠，这促使铜离子向氧基-氢氧化铜的转变。这是在羧酸根配体(即酒石酸和己二酸)的存在下进行的，由于配体的引入和矿物生长面的表面覆盖，可以控制矿物在纳米级生长，以产生具有2-5nm的核结构的小的且稳定的纳米颗粒(图7)。通过静电排斥，大概是通过在酒石酸的第二pka——ph4.4以上的负电性的去质子化羧基，酒石酸在稳定溶液中纳米颗粒上起到了重要的作用。ζ电势显示由于强烈的颗粒排斥(|ζ电势|>30mv)，纳米颗粒足够地带负电荷(峰在-39mv)以阻止颗粒团聚，并因此形成非常稳定的悬浮液。xrd分析显示出无定形的矿物相，这很可能由于矿物相结构中引入了酒石酸。于此相反，本发明的发明人认为己二酸——具有对铜低亲和力的弱配体，主要因为自身的缓冲能力而使用，以控制合成中的ph。cutartad纳米颗粒也显示出无定形矿物相，很有可能是由于因酒石酸的矿物晶格的表面破坏。无定形态可影响易分解性，因为具有无定形矿物相的材料比结晶材料更易分解。cutartad纳米颗粒合成之后，其溶出曲线在细菌生长培养基中通过稀释至12.5、25和50ppmcu(在抗微生物实验中通常使用的浓度)来测定。稀释于培养基中之后纳米颗粒马上溶出(图8)，并在溶液中保持至少8个小时——本实验的研究期间。根据以前的观察，对cusi纳米颗粒来说，cutartad纳米颗粒以高的铜浓度下稳定在分散系中(图10b)，但是不像cusi纳米颗粒，cutartad纳米颗粒是非常易分解的，显示了铜在细菌生长培养基中的快速释。已经证实了易分解性，接着测试了cutartad纳米颗粒的抗微生物效力。使用了两个标准的细菌模型去测定抵抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两者——分别是革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌——的活性。发现cutartad纳米颗粒能有效抵抗这两种菌株，在50ppmcu中培养，抑制金黄色葡萄球菌的生长超过80％，同时完全抑制大肠杆菌的生长(图9a)。这代表了相对cusi纳米颗粒的改善，cusi纳米颗粒在相同浓度下不能完全抑制大肠杆菌的生长(图3)。这些结果增强了可溶性铜离子对抗微生物作用的意义。cusi纳米颗粒和cutartad纳米颗粒两种纳米颗粒表现出相似的物理化学性质(例如小尺寸和负电荷)，但是不同的溶出速率及相应的抗菌活性差异。此外，cutartad纳米颗粒显示出相当于可溶性铜的效力，证明了他们在递送杀生性铜上的合适性。本发明的配体修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒对于广泛范围的微生物具有杀菌作用，包括铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的致病菌模型(表3)。表3从cucl2或cutartad与若干种细菌模型的繁殖获得的最低杀菌浓度(mbc)，细菌模型包括常见的实验室菌株(大肠杆菌mc1061和枯草芽孢杆菌br151)、致病菌模型(金黄色葡萄球菌rn4220和铜绿假单胞菌)、毒性测试的iso标准(费氏弧菌)。每个细菌物种与cu——cucl2和cutartad纳米颗粒两者——在液体培养基中繁殖4-96个小时。然后，细菌培养物被转移至琼脂板，并且mbc值通过目视检查形成的菌落测定(n＝1)。跨革兰氏阴性和革兰氏阳性物种的广谱抗微生物效力对许多临床应用是有益的，特别是对创伤感染(由于受伤皮肤暴露于多种和大量的病原体)和感染对愈合的有害影响。因此，在已经证明了cutartad纳米颗粒的杀生效力后，测试了它们外用递送的适宜性。用于创伤愈合的典型制剂包括医用敷料或霜膏，活性成分浸满其中，并且在潮湿环境中释放。这里，因为原则性证明，纳米颗粒被引入至羟乙基纤维素(hec)基质中。hec为已在保健品和化妆品中广泛使用的纤维素衍生物，并且不像敷料或其他基质(例如聚乙二醇)，在基质制备过程中hec不需要进一步处理(例如加热或干燥)纳米颗粒，对纳米颗粒的物理化学性质的改变最小。因此，cutartad的引入简单地通过稀释胶体至期望的浓度并将hec溶解在悬浮液中形成了内含纳米颗粒的均匀胶质而达到。重要地，铜从此胶体中释放：以250ppm遍布了cutartad纳米颗粒的hec基质释放64±8ppm超过24小时，该浓度大于足以抑制细菌生长的浓度。于此相比，超过同样的时间段，由250ppmcu的氯化铜形成的胶体没有释放超过10ppmcu。这证实了在生理ph值下，铜盐作为递送剂的不适宜性。这样，cutartad纳米颗粒在此显示出对创伤感染防治的适宜的性质，因为它们容易地释放出杀生性铜离子，这导致了高的抗微生物活性并适合于外用递送。4.合成实例4.1从cuso4制备的cuoh40tart20ad20纳米颗粒纳米颗粒根据实例1.1.5合成，但是用cuso4替代cucl2。根据这个实例从cuso4合成的纳米颗粒表征了铜相分布。在合成过程中，随着ph的升高可溶性铜转化为微粒氧基-氢氧化铜。在ph7时，微粒相主要由纳米颗粒组成(大约总的铜的80％)。在根据实例1.1.5合成的酒石酸根-己二酸根修饰的氧基-氢氧化铜纳米微粒的合成方法中通过动态光散射测定流体力学粒度。除了提高了可分散性，ph的提高还导致了降低的粒度。例如ph6.5时回收的纳米颗粒显示出更大的粒度(73±10nm)——相比在更高ph时回收的纳米颗粒(例如在ph8，4.6±0.5nm)。当在ph8回收时，这些纳米颗粒具有在1.5-20nm之间的流体力学直径，平均直径在3-5nm之间。4.2从cuno3制备的cuoh40tart20ad20纳米颗粒根据实例1.1.5合成纳米颗粒，但是用cuno3替代cucl2。根据这个实例从cuno3合成的纳米颗粒通过动态光散射来表征。当在ph8时回收，这些纳米颗粒具有在2-10nm之间的流体力学直径，平均直径在3-5nm之间。4.3cuoh40葡萄糖酸60根据实例1.1.5合成纳米颗粒，但是用葡萄糖酸(60mm)替代酒石酸和己二酸。根据这个实例用了葡萄糖酸合成的纳米颗粒表征了铜相分布。在合成过程中，随着ph的升高可溶性铜转化为微粒氧基-氢氧化铜。在ph6时，微粒相主要由纳米颗粒组成(分数大于总的铜的80％)。根据这个实例用了酒石酸合成的纳米颗粒通过动态光散射表征。当在ph8时，这些纳米颗粒具有1-10nm之间的流体力学直径，平均直径在2-4nm之间。4.4cuoh20谷胱甘肽20根据实例1.1.5合成纳米颗粒，但是用谷胱甘肽(20mm)替代酒石酸和己二酸。cucl2的初始浓度也减半至20mm。根据这个实例用了谷胱甘肽合成的纳米颗粒表征了铜相分布。在合成过程中，随着ph的升高，可溶性铜转化为微粒氧基-氢氧化铜。ph在3-4之间，微粒相主要由大的团聚物组成(大约总的铜的70％)。在ph6时，微米级的颗粒分散并且微粒铜变得主要由纳米颗粒组成(分数大于总的铜的80％)。根据实例n4用了谷胱甘肽合成的纳米颗粒通过动态光散射表征。当在ph8时回收，这些纳米颗粒具有1-5nm之间的流体力学直径，平均直径大约2nm。4.5用了na2co3制备的cuoh40tart20ad20纳米颗粒根据实例1.1.5合成纳米颗粒，但是用na2co3替代naoh。本实施例中使用酸na2co3作为滴定标准液而合成的纳米颗粒通过铜相分布进行表征。在合成过程中，随着ph的升高可溶性铜转化为微粒氧基-氢氧化铜。在ph7时，微粒相主要由纳米颗粒组成(分数大于总的铜的90％)。采用酸na2co3作为滴定标准液(根据实例n5)合成的纳米颗粒通过动态光散射表征。当在ph8时回收，这些纳米颗粒具有1-8nm之间的流体力学直径，平均直径在2-4nm之间。4.6未修饰cuoh40(对照实例)遵照与实例1.1.5描述的相同的合成方法，但是无酒石酸和己二酸。在未修饰的氢氧化铜合成过程中，在ph4.3-5.2之间，大部分可溶性的铜转化为微粒。超过这个ph，微粒相完全由大的微米级颗粒组成(分数大于总的铜的95％)。还获得了生成的材料的xrd光谱(图11)。后者显示出相当于副氯铜矿的晶形，副氯铜矿是化学分子式为cu2(oh)3cl、其中氯离子被结合进矿物结构的铜的氢氧化物(下图)。4.7cuoh40tart20纳米颗粒根据实例1.1.5合成酒石酸根修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒，但是无己二酸。根据这个实例在无己二酸的情况下合成的纳米颗粒通过动态光散射表征。当在ph8时回收，这些纳米颗粒具有2-10nm之间的流体力学直径，平均直径在3-5nm之间。4.8cuoh2000tart1000纳米颗粒根据实例4.7合成酒石酸根修饰的氧基-氢氧化铜纳米颗粒，但是以更高的浓度(2.0mcu和1.0m酒石酸)。生成的材料是黏性的浆体。4.9cuoh2000tart1000纳米颗粒的二次悬浮将如n9所述制备的浆体在20mm己二酸溶液中稀释至～50mmcu并用naoh调整ph至8。根据这个实例从浓缩的浆体合成的纳米颗粒通过动态光散射表征。当ph8时回收这些纳米颗粒，这些纳米颗粒具有2-10nm之间的流体力学直径，平均直径在3-5nm之间。4.10未结合的配体的移除游离的配体和盐通过乙醇沉淀方法移除，其中cutartad纳米颗粒(根据实例1.1.5合成)悬浮液与乙醇以1:2的纳米颗粒悬浮液:乙醇体积比混合。团聚的纳米颗粒在1500rpm旋转沉降5分钟，并且丢弃上清液(包括游离配体和盐)。包含纳米颗粒的团粒二次悬浮至原始体积。5活性实验5.1cuoh40tart20ad20暴露于皮肤成纤维细胞人类真皮成纤维细胞(细胞系ccd-25sk)在最小必需培养基(包括l-谷氨酰胺和厄尔盐(earle'ssalts))中与cutartad纳米颗粒(0-200ppmcu)培养，辅以5％热灭活胎牛血清、1％青霉素-链霉素、1％两性霉素b和3.8％牛血清白蛋白，在37℃下湿润的5％co2的空气中培养48小时。cucl2和agno3作为阳性对照组平行测试。使用incucytezoom实验地测定细胞覆盖百分比并随着时间绘制，以确定每个测试浓度下曲线下面积(auc)。细胞的增殖被用作细胞毒性的指征，并通过暴露于测试化合物的细胞的auc与以正常速率生长的细胞的auc(对照组)标准化来确定。皮肤成纤维细胞暴露于cucl2、agno3或配体修饰的铜纳米颗粒(根据实例1.1.5合成)中48小时。如图12所示，cucl2、agno3以较低的浓度(分别从50mg/l和从10mg/l)——与铜纳米颗粒(从100mg/l)相比——引起细胞增殖的降低。除了降低的毒性，氧基-氢氧化铜纳米颗粒还在低浓度(10和25mg/lcu)下促进了细胞生长(增加细胞增殖)，表明了在创伤愈合上的有益效果。***本文所引用的或与本申请一起递交的所有出版物、专利和专利申请，包括做为信息公开声明的部分递交的参考文献，均通过引用全文并入。当前第1页12当前第1页12