用于组合抗癌疗法的聚合物‑药物结合物的制作方法

关于联邦政府资助的研究的声明

本发明是在美国国家科学基金会(nationalsciencefoundation)授予的批准号dge-1144085和美国国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的批准号1s10od010610-01a1的政府资助下完成的。政府享有本发明中的某些权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年3月9日提交的u.s.s.n.62/130,284的权益和优先权。

本发明大体上涉及药物组合物和向患者递送治疗活性剂，尤其是用于治疗癌症的方法。

背景技术：

拓扑异构酶i和ii是参与dna复制的核酶并且是抗癌疗法的靶标。如喜树碱、伊立替康(irinotecan)和拓扑替康(topotecan)等临床上适用的抗肿瘤药物干扰拓扑异构酶i(topi)的功能。如阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、氨柔比星(amrubicin)和安吖啶(amsacrine)等抗肿瘤药物抑制拓扑异构酶ii(topii)。无数努力都集中在鉴别topi和ii抑制剂的有效又安全的组合疗法。这些努力全都归因于酶的附属药物敏感性。暴露于topi抑制剂的癌细胞通过增强topii活性来补偿dna复制受阻。这种作用使得癌细胞对topii抑制剂变得更加敏感(杉本(sugimoto)等人,《癌症研究(cancerres)》,1990.50(24):7962-5)。

拓扑异构酶i和ii抑制剂的某些组合疗法已证明可体外抑制癌细胞生长。然而，由于某些原因，这些组合的临床研究在ii期试验后一直没有进展。举例来说，阿霉素在小细胞肺癌患者中提供>20％的总反应率(格兰特(grant)等人,《临床肿瘤学杂志(jclinoncol)》,1992.10(3):484-98)。然而，当阿霉素与伊立替康一起给予时，这种组合显示功效无改进，在患者中仅提供12.9％的总反应(齐尼迪斯(xenidis)等人,《癌症化疗与药理学(cancerchemotherpharmacol)》,2011.68(1):63-8)。氨柔比星和伊立替康的组合将总反应改进到了67％，但是在71％的患者中引出了严重的血液学毒性(原田(harada)等人,《日本临床肿瘤学杂志(jpnjclinoncol)》,2014.44(2):127-33)。此外，拓扑替康和聚乙二醇化脂质体阿霉素的临床试验因为剂量限制性毒性和无法达到可耐受组合剂量而终止(瑞恩(ryan)等人,《美国临床肿瘤学杂志(amjclinoncol)》,2000.23(3):297-300)。topi和ii抑制剂的临床组合的结果通常落在以下两个类别中的一个中：治疗功效几乎没有或没有改进；或相比于单一药物对应部分毒性增加。

已经研究了用聚合物-药物结合物来给予单一化疗剂并且这种结合物可能具有比单独给予的药物好的临床益处(邓肯(duncan),《先进药物递送综述(advdrugdelivrev)》,2009.61(13):1131-48)。临床益处可包括肝脏积累减少，药物在肿瘤中的定位增强，并且药物动力学改进(瓦齐(vasey)等人,《临床癌症研究(clincancerres)》,1999.5(1):83-94)。抗癌药物与聚合物的结合能够通过高通透性和滞留效应促进药物积累在肿瘤中而不是器官中来改进临床功效(拉默斯(lammers)等人,《控制释放杂志(jcontrolrelease)》,2005.110(1):103-18)。这种方法确保肿瘤暴露于有效量的药物组合中。

虽然已经制备和评估了一些药物结合物，但它们需要进一步改进以得到较好的功效(r.邓肯(r.duncan),《先进药物递送综述(advdrugdeliveryrevs)》第61卷,2009)。因此，存在着对可有效治疗癌症且副作用较少的抗癌疗法的需求。

本发明的一个目标是提供改良后的药物组合物，用于向需要治疗的患者递送两种或更多种治疗剂，并且尤其是用于减少或预防癌症患者的肿瘤生长同时限制来自活性剂的毒性。

本发明的另一个目标是提供治疗患者的癌症的改良方法，并且更具体来说是用于减少或预防癌症患者中的肿瘤生长并相比于通常单独递送的相同药物来说副作用减少。

本发明的另一个目标是提供用于向患者递送两种或更多种治疗活性剂的改良后的药物组合物。

本发明的另一个目标是提供这些组合物的制造方法。

技术实现要素：

本文中所述的药物组合物含有两种或更多种药物，呈聚合物-药物结合物形式。聚合物-药物结合物允许使用化学计量学修改药物之间的比率和/或修改递送时间表(即从聚合物-药物结合物中释放出药物)。药物组合物中的每个药物的所期望的递送时间表可以经改变药物与聚合物之间的键的键强度或改变用于结合药物与聚合物的连接基团的键的键强度实现，从而在递送两种或更多种药物时实现协同效应。

描述了含有与一种或多种生物相容性聚合物结合的两种或更多种抗癌剂的药物组合物，其中药剂的摩尔比、递送时间表或这两者提供协同治疗作用。生物相容性聚合物，或聚合物中的至少一个，优选聚合物中的每一个，优选是水溶性生物相容性聚合物。进一步描述了药物组合物的制造和使用方法。

在一些实施例中，药物组合物含有与相同生物相容性聚合物结合的两种或更多种抗癌剂，其摩尔比、递送时间表或这两者相比于单独递送这些药剂中的每一个而言提供协同效应。在其它实施例中，药物组合物含有两种或更多种抗癌剂，其中至少第一药剂与第一生物相容性聚合物结合，并且至少第二药剂与第二生物相容性聚合物结合，其摩尔比、递送时间表或这两者相比于单独递送这些药剂中的每一个而言提供协同效应，其中第一和第二聚合物相同或不同。聚合物或聚合物中的至少一个优选是透明质酸。在一些实施例中，抗癌剂是拓扑异构酶i抑制剂、拓扑异构酶ii抑制剂或这两种。两种或更多种药剂直接或间接(例如，通过连接基团)地共价偶联到聚合物上，并且由此可被递送到需要治疗的部位，如癌症患者中的肿瘤。

进一步描述了含有与生物相容性聚合物结合的两种或更多种治疗活性剂的药物组合物，其中药剂的摩尔比、递送时间表或这两者提供协同治疗作用。进一步描述了药物组合物的制造和使用方法。

在一些实施例中，药物组合物含有与相同生物相容性聚合物结合的两种或更多种治疗活性剂，其摩尔比、递送时间表或这两者相比于单独递送这些药剂中的每一个而言提供协同效应。在其它实施例中，药物组合物含有两种或更多种治疗活性剂，其中至少第一药剂与第一生物相容性聚合物结合，并且至少第二药剂与第二生物相容性聚合物结合，其摩尔比、递送时间表或这两者相比于单独递送这些药剂中的每一个而言提供协同效应，其中第一和第二聚合物相同或不同。聚合物或聚合物中的至少一个优选是透明质酸。

在一些实施例中，治疗活性剂是抗癌剂。在一些实施例中，治疗活性剂不是抗癌剂。两种或更多种药剂直接或间接(例如，通过连接基团)地共价偶联到聚合物上，并且由此可被递送到需要治疗的部位。

药物组合物可以通过用于任何合适的给药方法的任何合适方法配制。本文中描述了用于形成聚合物-药物结合物的示范性方法。用于肠胃外给药的合适剂型包括但不限于溶液、悬浮液和乳液。合适的口服剂型包括但不限于片剂、胶囊、溶液、悬浮液、乳液、糖浆以及锭剂。合适的鼻内剂型包括但不限于溶液、悬浮液和乳液。组合物可以任选地给予到粘膜部位并且通过粘膜部位。

组合物可有效治疗各种疾病或病症，如癌症。

附图说明

图1a和图1c是条形图，分别示出了经过喜树碱(cpt，带阴影线的)和阿霉素(dox，白色)的各种摩尔比的组合(黑条)处理的人类乳腺癌细胞系bt-474和小鼠脑内皮细胞系bend.3的细胞抑制。图1b和图1d分别呈现cpt和dox组合在bt-474和bend.3细胞中的组合指数(ci)值。

图2a是条形图，示出了经过各种药物处理的bt-474细胞中的凋亡细胞的百分比。细胞群体通过流式细胞仪定量如下：早期凋亡(黑条)和坏死和/或晚期凋亡(白条)。图2b呈现相对于仅用dox处理而言的早期凋亡细胞的增加百分比。

图3a和图3b呈现在存在dox的情况下在游离溶液(空心圆)或dox-ha(实心圆，图3a)中和在存在cpt的情况下在游离溶液(空心圆)或cpt-ha(实心圆，图3b)中人类乳腺癌细胞系bt-474的细胞抑制。

图4是条形图，示出了在37℃和5％co2下孵育24小时后的bt-474细胞中所存在的呈游离溶液形式(白条)或呈ha-结合物形式(黑条)的dox或cpt的定量荧光。

图5a是条形图，示出了经过cpt-ha和dox-ha的各种摩尔比的组合(黑条)处理的人类乳腺癌细胞系bt-474的细胞抑制。将dox-ha(白色)和cpt-ha(带阴影线的)的构成组合时的浓度的单一ha结合物处理并列以便直接比较。图5b呈现关于图5a中所示的cpt-ha和dox-ha组合所计算的组合指数(ci)值。

图6a呈现在存在dox-ha(空心圆)或cpt-ha-dox结合物(实心圆)的情况下bt-474细胞的细胞抑制。图6b呈现cpt-ha(空心圆)和r＝3.2cpt:dox的cpt-ha-dox(实心圆)结合物的细胞抑制的比较。

图7a呈现携带4t1乳腺癌肿瘤的小鼠在以下情况下的肿瘤生长：无处理(空心圆)、iv注射cpt-ha-dox(实心正方形)或含游离的cpt+dox的0.9％生理盐水(实心三角形)。图7b呈现对照小鼠(空心圆)、经过cpt-ha-dox处理的小鼠(实心正方形)或经过cpt+dox处理的小鼠(实心三角形)的体重改变。

图8是条形图，示出了结合有荧光素的ha在bt-474细胞中在37℃和4℃下的内化量。荧光在平均10μmz-堆叠(z-stack)中定量，并且针对每个图像的细胞计数归一化。

图9a和图9b是条形图，分别示出了暴露于游离的cpt+dox和cpt-ha+dox-ha的癌细胞系4t1的细胞抑制。图9c和图9d呈现了cpt和dox组合在4t1细胞中的组合指数(ci)值。

图10a和图10b是细胞抑制研究的条形图，比较了单一药物结合物(空心圆)与cpt-ha-dox(实心圆)的活性。图10a比较了dox-ha(空心圆)和cpt-ha-dox(实心圆)的细胞抑制细胞分数。图10b比较了cpt-ha(空心圆)和cpt-ha-dox(实心圆)的细胞抑制分数。

图11a到图11c是mda-mb231细胞随药物顺序(药物1→药物2)和三天孵育期中发生转换的时间而变的细胞抑制分数的线图。图11a示出了阿霉素(dox，0.3μm)和紫杉醇(pac，0.005μm)对的细胞抑制分数。dox转换为pac的药物顺序显示为空心正方形，pac转换为dox的药物顺序显示为实心圆。图11b示出了pac(0.005μm)和ixa(0.015μm)对的细胞抑制分数。pac转换为ixa的药物顺序显示为空心正方形，ixa转换为pac的药物顺序显示为实心圆。图11c示出了dox(0.3μm)和gem(0.2μm)对的细胞抑制分数。gem转换为dox的药物顺序显示为空心正方形，dox到gem的药物顺序显示为实心圆。

图12a到图12c是时间表对dox(0.3μm)与gem(0.3μm)之间对mda-mb231细胞的协同作用的影响的条形图和柱状图。图12a示出了dox(图案化条)和gem(实心黑条)的时间表随时间(天)的变化。图12b示出了时间表对细胞抑制分数的影响。dox、gem和dox/gem组合的细胞抑制分数分别显示为图案化柱、实心黑柱和实心白柱，时间表示出在图12a中。图12c示出了组合指数随图12a中所示的dox和gem的时间表的变化。

图13是散点图，示出了在三阴性乳腺癌细胞(mda-mb231，实心正方形)和健康的乳腺上皮细胞(mcf-10a，空心圆)中关于gem(1d)到dox(2d)的顺序递送的协同作用的程度随gem:dox摩尔比的变化，协同作用的程度表示为组合指数。

图14a和图14b是时间表对紫杉醇(pac，0.01μm)与拉帕替尼(lapatinib；lap，0.03μm)之间对bt-474细胞的协同作用的影响的条形图和柱状图。图14a示出了pac(图案化条)和lap(实心黑条)的时间表随时间(天)的变化。

图14b示出了组合指数随图14a中所示的pac和lap的递送时间表的变化。

图15a到图15c是示意图，示出了如dox、gem或另一种药剂这样的药物(r)可与如透明质酸这样的聚合物结合的不同策略。图15a示出了如dox、gem或另一种药剂这样的药物(r)通过葡糖醛酸单体的碳2和3上相邻的羟基实现的结合。图15b示出了如dox、gem或另一种药剂这样的药物(r)通过葡糖醛酸的羧酸基通过肼官能团实现的结合。图15c示出了如dox、gem或另一种药剂这样的药物(r)通过葡糖醛酸的羧酸基通过酰胺官能团实现的结合。

图16a到图16c是不同gem-甘氨酸前药的化学结构。在图16a中，通过使脱氧核糖的3'-羟基与甘氨酸的羧酸反应形成前药。在图16b中，通过使吉西他滨(gemcitabine)的伯胺与甘氨酸的羧酸反应形成前药。在图16c中，通过使脱氧核糖的5'-羟基与甘氨酸的羧酸反应形成前药。

具体实施方式

i.定义

术语“键强度”是两个原子或更多原子之间的键解离能的量度。当原子共价键合时，键强度是指两个原子之间的键解离能。

术语“结合物”当它是指聚合物-药物结合物时是指通过直接的或间接的共价键或非共价键连接的两个或更多个分子结构。非共价相互作用包括但不限于静电相互作用、氢键键合相互作用、范德华相互作用(vanderwaalsinteraction)、偶极-偶极相互作用、π-π堆积、磁相互作用以及金属配位。结合优选是通过共价键。

如本文所用的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指示，该方法至少使得异常细胞增殖减少。举例来说，该方法能够降低患者的癌症生长速率，或防止癌症继续生长，或甚至降低癌症的整体影响。

如本文所用的“生物相容性”一般是指材料以及其任何代谢物或降解产物通常对接受者无毒，并且不会对接受者造成任何显著不良影响。一般来说，生物相容性材料是在给予患者时不会引发显著的炎症反应或免疫反应的材料。

如本文所用的“水溶性聚合物”意指在37℃和标准压力下，在水或单相水性-有机混合物中具有至少1mg/升的溶解度的聚合物。

如本文所用的“协同治疗作用”是指对于特定的药物组合来说，如使用组合指数(ci)分析所确定，比累加效应大的治疗作用。

术语“药物递送时间表”或“递送时间表”是指如抗癌剂等治疗活性剂从其配制品中释放的时间。更具体来说，它是指如抗癌剂等治疗活性剂从聚合物-药物结合物中释放的时间。

术语“治疗剂”、“治疗活性剂”和“药物”在本文中可互换地使用，并且是指可以给予以预防、治疗或改善疾病或病症的一种或多种症状的药剂。

术语“治疗有效量”是指治疗活性剂以适用于任何药物治疗的合理效益/风险比产生某种所期望的作用的量。有效量可以取决于例如以下因素而变化：待治疗的疾病或病况、待给予的特定靶向构建体、受试者的体型、或疾病或病况的严重程度。本领域的普通技术人员可以在不需要进行过多实验的情况下凭经验确定特定化合物的有效量。

ii.药物组合物

药物组合物含有与相同或不同生物相容性聚合物结合的两种或更多种抗癌剂，其摩尔比、递送时间表或这两者相比于单独递送这些药剂中的每一个而言提供协同效应。

药物组合物中的每个药物的所期望的递送时间表可以这样实现，改变药物与聚合物之间的键的键强度或用于结合药物与聚合物的连接基团的键的键强度，从而在递送两种或更多种药物时实现协同效应。举例来说，药物组合物中的第一药物可以通过第一连接基团或具有第一键强度的共价键连接到聚合物上，并且药物组合物中的第二药物可以通过第二连接基团或具有第二键强度的共价键连接到相同或不同的聚合物上。第一和第二键强度可以相同或不同。关于含有超过两种药物的药物组合物，药物组合物可以类似地在额外的药物与第一和第二药物所连接的相同或不同聚合物之间具有额外的连接基团或共价键，其中额外的连接基团或共价键各自具有与第一和第二键强度中的任一个或两个相同或不同的键强度。

在一些实施例中，两种或更多种抗癌剂与相同生物相容性聚合物结合。在其它实施例中，至少第一药剂与第一生物相容性聚合物结合，并且至少第二药剂与第二生物相容性聚合物结合，其中第一和第二聚合物相同或不同。聚合物或聚合物中的至少一个优选是透明质酸。

两种或更多种抗癌剂直接地或通过连接基团间接地结合到一种或多种聚合物的主链或侧链上。参与直接结合的键的强度和连接基团中的键的强度可以是相同的、不同的或是其组合(即键强度中的一些是相同的，而其它的是不同的)。在一些实施例中，侧链具有相同或不同的化学部分。将两种或更多种抗癌剂与聚合物直接结合的键的键强度是相同的、不同的或是其组合(即键强度中的一些是相同的，而其它的是不同的)。通过连接基团间接结合两种或更多种抗癌剂的键的键强度是相同的、不同的或是其组合(即键强度中的一些是相同的，而其它的是不同的)。举例来说，当键或连接基团具有相同的键强度时，抗癌剂各自通过相同的键或相同的连接基团连接到聚合物上。当键或连接基团具有不同的键强度时，抗癌剂各自通过不同的键或不同的连接基团连接到聚合物上。

关于含有至少三种不同抗癌剂的药物组合物，间接结合两种或更多种抗癌剂的连接基团中的键的键强度或直接结合的键的键强度是相同的、不同的或是其组合(即键强度中的一些是相同的，而其它的是不同的)，键强度中的一些可以是相同的，而其它的可以是不同的。举例来说，将第一抗癌剂和第二抗癌剂与一种或多种聚合物直接或间接地结合的键可以具有相同的键强度，而将第三抗癌剂与一种或多种聚合物直接或间接地结合的键具有与结合第一和第二抗癌剂与一种或多种聚合物的键不同的键强度。

将两种或更多种抗癌剂与一种或多种聚合物直接地或通过连接基团间接地结合的键的键强度优选是不同的。这些键或连接基团中的键按相同或不同的速率或其组合(即一些键按一种速率裂解，其它键按另一种速率裂解)裂解。这些键或连接基团中的键优选按不同的速率裂解。

在一些实施例中，药物组合物含有两种或更多种通过结合到相同生物相容性聚合物上彼此偶联的治疗活性剂，其摩尔比相比于单独递送这些药剂中的每一个而言提供协同效应。在其它实施例中，相比于单独递送治疗活性剂中的每一个，通过结合到相同生物相容性聚合物上彼此偶联的治疗活性剂的摩尔比、递送时间表或这两者提供协同效应。聚合物优选是透明质酸。

在其它实施例中，药物组合物含有两种或更多种治疗活性剂，其中第一药剂与第一生物相容性聚合物结合，并且第二药剂与第二生物相容性聚合物结合，其摩尔比相比于单独递送这些药剂中的每一个而言提供协同效应，其中第一和第二生物相容性聚合物是相同或不同的聚合物。在其它实施例中，相比于单独递送治疗活性剂中的每一个，与第一和第二生物相容性聚合物结合的治疗活性剂的摩尔比、递送时间表或这两者提供协同效应。聚合物或聚合物中的至少一个优选是透明质酸。

在一些实施例中，治疗活性剂是拓扑异构酶i抑制剂、拓扑异构酶ii抑制剂或这两种。

两种或更多种治疗活性剂直接结合到一种聚合物或多种聚合物的主链或侧链上，或者，它们通过连接基团间接地结合。在一些实施例中，侧链具有相同或不同的化学部分。将两种或更多种治疗活性剂与聚合物直接结合的键的键强度是相同的、不同的或是其组合(即键强度中的一些是相同的，而其它的是不同的)。通过连接基团间接结合两种或更多种治疗活性剂的键的键强度是相同的、不同的或是其组合(即键强度中的一些是相同的，而其它的是不同的)。在一些实施例中，参与直接结合的键的强度和连接基团中的键的强度是相同的、不同的或是其组合(即键强度中的一些是相同的，而其它的是不同的)。举例来说，当键或连接基团具有相同的键强度时，治疗活性剂各自通过相同的键或相同的连接基团连接到聚合物上。当键或连接基团具有不同的键强度时，治疗活性剂各自通过不同的键或不同的连接基团连接到聚合物上。在键强度既有相同又有不同的实施例中通常存在三种或更多种不同的治疗活性剂。在这些实施例中，将第一治疗活性剂和第二治疗活性剂与一种或多种聚合物直接或间接地结合的键具有相同的键强度，而将第三治疗活性剂与一种或多种聚合物直接或间接地结合的键具有与结合第一和第二治疗活性剂与一种或多种聚合物的键不同的键强度。将两种或更多种治疗活性剂与一种或多种聚合物直接地或通过连接基团间接地结合的键的键强度优选是不同的。这些键或连接基团中的键按相同或不同的速率或其组合(即一些键按第一速率裂解，其它键按第二不同速率或超过一种不同速率裂解)裂解。这些键或连接基团中的键优选按不同的速率裂解。

a.治疗活性剂

描述了包含与生物相容性聚合物结合的两种或更多种治疗活性剂的药物组合物，其中这些药剂的摩尔比、递送时间表或这两者提供协同治疗作用。治疗活性剂可以是任何提供体内治疗或预防作用的药物。根据待治疗或预防的疾病或病症来选择药物。

如本文所用，提到治疗活性剂或抗癌剂时包括药剂的生物学上可接受的盐。举例来说，在本文中提到阿霉素、吉西他滨和/或拉帕替尼时也是指其生物学上可接受的盐，分别例如阿霉素盐酸盐、吉西他滨盐酸盐和拉帕替尼二对甲苯磺酸盐。

治疗活性剂的实例包括但不限于核酸、核酸类似物、小分子、肽模拟物、蛋白质、肽、碳水化合物或糖、脂质或表面活性剂或其组合。

设想用于本文中所述的药物组合物中的药物包括但不限于以下药物类别和实例以及这些药物的替代形式，如替代盐形式、游离酸形式、游离碱形式和水合物：止痛剂/退热剂(例如，阿司匹林(aspirin)、醋氨酚(acetaminophen)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生钠(naproxensodium)、丁丙诺啡(buprenorphine)、盐酸丙氧芬(propoxyphenehydrochloride)、萘磺酸丙氧芬(propoxyphenenapsylate)、盐酸哌替啶(meperidinehydrochloride)、盐酸氢吗啡酮(hydromorphonehydrochloride)、吗啡(morphine)、羟考酮(oxycodone)、可待因(codeine)、重酒石酸二氢可待因(dihydrocodeinebitartrate)、喷他佐辛(pentazocine)、重酒石酸氢可酮(hydrocodonebitartrate)、左啡诺(levorphanol)、二氟尼柳(diflunisal)、水杨酸三乙醇胺(trolaminesalicylate)、盐酸纳布啡(nalbuphinehydrochloride)、甲芬那酸(mefenamicacid)、布托啡诺(butorphanol)、水杨酸胆碱(cholinesalicylate)、布他比妥(butalbital)、柠檬酸苯托沙敏(phenyltoloxaminecitrate)、柠檬酸苯海拉明(diphenhydraminecitrate)、左美丙嗪(methotrimeprazine)、盐酸桂麻磺碱(cinnamedrinehydrochloride)和甲丙氨酯(meprobamate))；平喘药(例如，酮替芬(ketotifen)和曲诺(traxanox))；抗生素(例如，新霉素(neomycin)、链霉素(streptomycin)、氯霉素(chloramphenicol)、头孢菌素(cephalosporin)、氨苄青霉素(ampicillin)、青霉素(penicillin)、四环素(tetracycline)和环丙沙星(ciprofloxacin))；抗抑郁药(例如，奈福泮(nefopam)、奥昔哌汀(oxypertine)、多虑平(doxepin)、阿莫沙平(amoxapine)、曲唑酮(trazodone)、阿米替林(amitriptyline)、马普替林(maprotiline)、苯乙肼(phenelzine)、地昔帕明(desipramine)、去甲替林(nortriptyline)、反苯环丙胺(tranylcypromine)、氟西汀(fluoxetine)、多虑平、丙咪嗪(imipramine)、双羟萘酸丙咪嗪(imipraminepamoate)、异卡波肼(isocarboxazid)、三甲丙咪嗪(trimipramine)和普罗替林(protriptyline))；抗糖尿病药(例如，双胍和磺酰脲衍生物)；抗真菌剂(例如，灰黄霉素(灰黄霉素)、酮康唑(ketoconazole)、伊曲康唑(itraconizole)、两性霉素b(amphotericinb)、制霉菌素(nystatin)和杀念珠菌素(candicidin))；抗高血压药(例如，普萘洛尔(propranolol)、普罗帕酮(propafenone)、氧烯洛尔(oxyprenolol)、硝苯地平(nifedipine)、利血平(reserpine)、咪噻吩(trimethaphan)、苯氧苄胺(phenoxybenzamine)、盐酸帕吉林(pargylinehydrochloride)、地舍平(deserpidine)、二氮嗪(diazoxide)、单硫酸胍乙啶(guanethidinemonosulfate)、米诺地尔(minoxidil)、利血胺(rescinnamine)、硝普钠(sodiumnitroprusside)、蛇根木(rauwolfiaserpentina)、阿舍西隆(alseroxylon)和酚妥拉明(phentolamine))；抗炎剂(例如，(非甾体)吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、萘普生、布洛芬、雷米那酮(ramifenazone)、吡罗昔康(piroxicam)、(甾体)可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氟扎可特(fluazacort)、塞来昔布(celecoxib)、罗非考昔(rofecoxib)、氢化可的松(hydrocortisone)、泼尼松龙(prednisolone)和泼尼松(prednisone))；抗焦虑药(例如，劳拉西泮(lorazepam)、丁螺环酮(buspirone)、普拉西泮(prazepam)、氯氮卓(chlordiazepoxide)、奥沙西泮(oxazepam)、二钾氯氮(clorazepatedipotassium)、安定(diazepam)、双羟萘酸羟嗪(hydroxyzinepamoate)、盐酸羟嗪(hydroxyzinehydrochloride)、阿普唑仑(alprazolam)、氟哌利多(droperidol)、哈拉西泮(halazepam)、氯美扎酮(chlormezanone)和丹曲林(dantrolene))；免疫抑制剂(例如，环孢霉素(cyclosporine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、咪唑立宾(mizoribine)和fk506(他克莫司(tacrolimus)))；抗偏头痛药(例如，麦角胺(ergotamine)、普萘洛尔、半乳糖二酸异美汀(isometheptenemucate)和氯醛比林(dichloralphenazone))；镇静剂/安眠药(例如，巴比妥酸盐(barbiturate)，如戊巴比妥(pentobarbital)、戊巴比妥和司可巴比妥(secobarbital)；和苯二氮卓类(benzodiazapines)，如盐酸氟西泮(flurazepamhydrochloride)、三唑仑(triazolam)和咪达唑仑(midazolam))；抗心绞痛药(例如，β-肾上腺素能阻断剂；钙离子通道阻断剂，如硝苯地平(nifedipine)和地尔硫卓(diltiazem)；和硝酸盐，如硝化甘油(nitroglycerin)、二硝酸异山梨醇酯(isosorbidedinitrate)、季戊四醇四硝酸酯(pentaerythritoltetranitrate)和赤藓醇四硝酸酯(erythrityltetranitrate))；抗精神病药(例如，氟哌啶醇(haloperidol)、丁二酸洛沙平(loxapinesuccinate)、盐酸洛沙平(loxapinehydrochloride)、硫利达嗪(thioridazine)、盐酸硫利达嗪(thioridazinehydrochloride)、替沃噻吨(thiothixene)、氟奋乃静(fluphenazine)、癸酸氟奋乃静、庚酸氟奋乃静、三氟拉嗪(trifluoperazine)、氯丙嗪(chlorpromazine)、奋乃静(perphenazine)、柠檬酸锂和丙氯拉嗪(prochlorperazine))；抗躁狂药(例如，碳酸锂)；抗心律失常药(例如，托西溴苄铵(bretyliumtosylate)、艾司洛尔(esmolol)、维拉帕米(verapamil)、胺碘酮(amiodarone)、恩卡尼(encainide)、地高辛(digoxin)、洋地黄毒苷(digitoxin)、美西律(mexiletine)、磷酸丙吡胺(disopyramidephosphate)、普鲁卡因胺(procainamide)、硫酸奎尼丁(quinidinesulfate)、葡糖酸奎尼丁(quinidinegluconate)、聚半乳糖醛酸奎尼丁(quinidinepolygalacturonate)、醋酸氟卡尼(flecainideacetate)、妥卡尼(tocainide)和利多卡因(lidocaine))；抗关节炎药(例如，保泰松(phenylbutazone)、舒林酸(sulindac)、青霉胺(penicillamine)、双水杨酯(salsalate)、吡罗昔康、硫唑嘌呤、吲哚美辛、甲氯芬那酸(meclofenamate)、硫代苹果酸金钠(goldsodiumthiomalate)、酮洛芬(ketoprofen)、金诺芬(auranofin)、金硫葡糖(aurothioglucose)和托麦汀钠(tolmetinsodium))；抗痛风药(例如，秋水仙碱(colchicine)和别嘌呤醇(allopurinol))；抗凝血剂(例如，肝素(heparin)、肝素钠和华法林钠(warfarinsodium))；血栓溶解剂(例如，尿激酶(urokinase)、链激酶(streptokinase)和阿替普酶(alteplase))；抗纤维蛋白溶解药(例如，氨基己酸)；血液流变剂(例如，己酮可可碱(pentoxifylline))；抗血小板药(例如，阿司匹林)；抗惊厥药(例如，丙戊酸(valproicacid)、双丙戊酸钠(divalproexsodium)、苯妥英(phenytoin)、苯妥英钠、氯硝西泮(clonazepam)、扑米酮(primidone)、苯巴比妥(phenobarbitol)、卡马西平(carbamazepine)、异戊巴比妥钠(amobarbitalsodium)、甲琥胺(methsuximide)、甲巴比妥(metharbital)、甲苯比妥(mephobarbital)、美芬妥英(mephenytoin)、苯琥胺(phensuximide)、甲乙双酮(paramethadione)、乙妥英(ethotoin)、苯乙酰脲(phenacemide)、赛可巴比妥钠(secobarbitolsodium)、二钾氯氮和三甲双酮(trimethadione))；抗帕金森病药(antiparkinsonagent)(例如，乙琥胺(ethosuximide))；抗组胺药/止痒剂(例如，羟嗪、苯海拉明、氯苯那敏(chlorpheniramine)、马来酸溴苯那敏(brompheniraminemaleate)、盐酸赛庚啶(cyproheptadinehydrochloride)、特非那定(terfenadine)、富马酸氯马斯汀(clemastinefumarate)、曲普利啶(triprolidine)、卡比沙明(carbinoxamine)、二苯拉林(diphenylpyraline)、苯茚胺(phenindamine)、阿扎他定(azatadine)、曲吡那敏(tripelennamine)、马来酸右氯苯那敏(dexchlorpheniraminemaleate)和甲吡吩嗪(methdilazine))；适用于钙调节的药剂(例如，降血钙素(calcitonin)和甲状旁腺激素(parathyroidhormone))；抗细菌剂(例如，硫酸阿米卡星(amikacinsulfate)、氨曲南(aztreonam)、氯霉素(chloramphenicol)、棕榈酸氯霉素(chloramphenicolpalmitate)、环丙沙星、克林霉素(clindamycin)、棕榈酸克林霉素、磷酸克林霉素、甲硝唑(metronidazole)、盐酸甲硝唑、硫酸庆大霉素(gentamicinsulfate)、盐酸林可霉素(lincomycinhydrochloride)、硫酸妥布霉素(tobramycinsulfate)、盐酸万古霉素(vancomycinhydrochloride)、硫酸多粘菌素b(polymyxinbsulfate)、多粘菌素钠(colistimethatesodium)和硫酸粘菌素(colistinsulfate))；抗病毒剂(例如，干扰素α、β或γ、齐多夫定(zidovudine)、盐酸金刚烷胺(amantadinehydrochloride)、利巴韦林(ribavirin)和阿昔洛韦(acyclovir))；抗微生物剂(例如，头胞菌素，如头孢唑林钠(cefazolinsodium)、头孢拉定(cephradine)、头孢克洛(cefaclor)、头孢匹林钠(cephapirinsodium)、头孢唑肟钠(ceftizoximesodium)、头孢哌酮钠(cefoperazonesodium)、头孢替坦二钠(cefotetandisodium)、头孢呋辛(cefuroximeeazotil)、头孢噻肟钠(cefotaximesodium)、头孢羟氨苄一水合物(cefadroxilmonohydrate)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢噻吩钠(cephalothinsodium)、盐酸头孢氨苄一水合物(cephalexinhydrochloridemonohydrate)、头孢孟多酯钠(cefamandolenafate)、头孢西丁钠(cefoxitinsodium)、头孢尼西钠(cefonicidsodium)、头孢雷特(ceforanide)、头孢曲松钠(ceftriaxonesodium)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢拉定(cephradine)和头孢呋辛钠(cefuroximesodium)；青霉素，如氨苄青霉素、阿莫西林(amoxicillin)、苄星青霉素g(penicillingbenzathine)、环青霉素(cyclacillin)、氨苄青霉素钠、青霉素g钾、青霉素v钾、哌拉西林钠(piperacillinsodium)、苯唑西林钠(oxacillinsodium)、盐酸巴坎西林(bacampicillinhydrochloride)、氯唑西林钠(cloxacillinsodium)、替卡西林二钠(ticarcillindisodium)、阿洛西林钠(azlocillinsodium)、羧苄西林茚满钠(carbenicillinindanylsodium)、青霉素g普鲁卡因(penicillingprocaine)、甲氧西林钠(methicillinsodium)和萘夫西林钠(nafcillinsodium)；红霉素(erythromycin)，如琥乙红霉素(erythromycinethylsuccinate)、红霉素、依托红霉素(erythromycinestolate)、乳糖酸红霉素(erythromycinlactobionate)、硬脂酸红霉素(erythromycinstearate)和琥乙红霉素(erythromycinethylsuccinate)；和四环素，如盐酸四环素、盐酸强力霉素(doxycyclinehyclate)和盐酸米诺环素(minocyclinehydrochloride)、阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin))；抗感染药(例如，gm-csf)；支气管扩张剂(例如，拟交感神经药(sympathomimetics)，如盐酸肾上腺素、硫酸奥西那林(metaproterenolsulfate)、硫酸特布他林(terbutalinesulfate)、异他林(isoetharine)、甲磺酸异他林、盐酸异他林、硫酸沙丁胺醇(albuterolsulfate)、沙丁胺醇、甲磺酸比托特罗(bitolterolmesylate)、盐酸异丙基肾上腺素(isoproterenolhydrochloride)、硫酸特布他林、重酒石酸肾上腺素(epinephrinebitartrate)、硫酸奥西那林、肾上腺素和重酒石酸肾上腺素(epinephrinebitartrate)；抗胆碱能药，如异丙托溴铵(ipratropiumbromide)；黄嘌呤(xanthines)，如氨茶碱(aminophylline)、喘定(dyphylline)、硫酸奥西那林和氨茶碱；肥大细胞稳定剂，如色甘酸钠(cromolynsodium)；吸入性皮质甾类，如二丙酸倍氯米松(beclomethasonedipropionate；bdp)和二丙酸倍氯米松一水合物；沙丁胺醇；异丙托溴铵；布地奈德(budesonide)；酮替芬(ketotifen)；沙美特罗(salmeterol)；昔美酸(xinafoate)；硫酸特布他林；曲安西龙(triamcinolone)；茶碱(theophylline)；奈多罗米钠(nedocromilsodium)；硫酸奥西那林；沙丁胺醇；氟尼缩松(flunisolide)；丙酸氟替卡松(fluticasoneproprionate)；甾体化合物、激素和激素类似物(例如，肠促胰岛素(incretins)和肠促胰岛素模拟物，如glp-1和艾塞那肽(exenatide)，雄激素，如达那唑(danazol)、环戊丙酸睾酮(testosteronecypionate)、氟羟甲基睾酮(fluoxymesterone)、乙睾酮(ethyltestosterone)、庚酸睾酮(enathatetestosterone)、甲睾酮(methyltestosterone)、氟羟甲基睾酮(fluoxymesterone)和环戊丙酸睾酮；雌激素，如雌二醇、雌酮硫酸酯哌嗪(estropipate)和结合型雌激素(conjugatedestrogens)；孕激素，如醋酸甲氧孕酮(acetatemethoxyprogesterone)和醋酸炔诺酮(norethindroneacetate)；皮质甾类，如曲安西龙、倍他米松(betamethasone)、倍他米松磷酸钠、地塞米松(dexamethasone)、地塞米松磷酸钠、醋酸地塞米松、泼尼松(prednisone)、醋酸甲泼尼龙悬浮液(methylprednisoloneacetatesuspension)、曲安奈德(triamcinoloneacetonide)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、泼尼松龙磷酸钠(prednisolonesodiumphosphate)、甲泼尼龙丁二酸钠(methylprednisolonesodiumsuccinate)、氢化可的松丁二酸钠(hydrocortisonesodiumsuccinate)、己曲安奈德(triamcinolonehexacetonide)、氢化可的松、环戊丙酸氢化可的松、泼尼松龙、醋酸氟氢可的松(fludrocortisoneacetate)、醋酸帕拉米松(paramethasoneacetate)、泼尼松龙醋酸特丁酯(prednisolonetebutate)、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠和氢化可的松丁二酸钠；和甲状腺激素，如左甲状腺素钠(levothyroxinesodium))；降血糖药(例如，人胰岛素、纯化牛胰岛素、纯化猪胰岛素、重组产生的胰岛素、胰岛素类似物、格列苯脲(glyburide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、格列吡嗪(glipizide)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)和妥拉磺脲(tolazamide))；降血脂药(例如，氯贝丁酯(clofibrate)、右旋甲状腺素钠(dextrothyroxinesodium)、普罗布考(probucol)、普伐他汀(pravastitin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)和烟酸)；肽；蛋白质(例如，脱氧核糖核酸酶(dnase)、褐藻酸酶(alginase)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase)和脂肪酶(lipase))；核酸(例如，编码任何治疗上有用的蛋白质的有义或反义核酸，包括本文中所述的蛋白质中的任一种，和sirna)；适用于红细胞生成刺激的药剂(例如，红细胞生成素(erythropoietin))；抗溃疡/抗反流药(例如，法莫替丁(famotidine)、西咪替丁(cimetidine)和雷尼替丁(ranitidine)盐酸盐)；止恶心药/止吐药(例如，盐酸美克洛嗪(meclizinehydrochloride)、大麻隆(nabilone)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、茶苯海明(dimenhydrinate)、盐酸普鲁米近(promethazinehydrochloride)、硫乙拉嗪(thiethylperazine)和东茛菪碱(scopolamine))；油溶性维生素(例如，维生素a、d、e、k等)；以及其它药物，如米托坦(mitotane)、卤代亚硝脲(halonitrosoureas)、蒽环霉素(anthrocyclines)和玫瑰树碱(ellipticine)。

这些类别和其它类别的有用药物的说明和每个类别内的物种的清单可见于《马丁代尔氏大药典(martindale,theextrapharmacopoeia)》第30版(药典出版社(thepharmaceuticalpress)，伦敦，1993年)中，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。

1.拓扑异构酶i和拓扑异构酶ii抑制剂

在一个实施例中，组合物含有一种或多种拓扑异构酶i抑制剂与一种或多种拓扑异构酶ii抑制剂的组合。在一些实施例中，这些活性剂是抗癌剂。

拓扑异构酶i抑制剂是能够抑制由拓扑异构酶i催化的dna再连接酶促反应的治疗活性剂。拓扑异构酶i抑制剂产生了足够抑制该反应的稳定的dna-拓扑异构酶i复合物。拓扑异构酶i抑制剂包括但不限于植物碱、植物碱衍生物、喜树碱、伊立替康、拓扑替康和其类似物。在优选实施例中，拓扑异构酶i抑制剂是喜树碱。

类似地，拓扑异构酶ii抑制剂是能够抑制由拓扑异构酶ii催化的dna再连接酶促反应的治疗活性剂。拓扑异构酶ii抑制剂包括但不限于阿霉素、博莱霉素(bleomycin)、柔红霉素、表柔比星(epirubicin)、丝裂霉素(mitomycin)和放线菌素(actinomycin)。在优选实施例中，拓扑异构酶ii抑制剂是阿霉素。

2.抗癌剂

在一个实施例中，药物组合物含有两种或更多种抗癌药物的组合，优选地，抗癌药物中的至少一种是拓扑异构酶i抑制剂并且抗癌药物中的至少一种是拓扑异构酶ii抑制剂。

额外抗癌剂或其它治疗活性剂可以通过结合到与第一和/或第二抗癌剂相同的聚合物或结合到另一个生物相容性聚合物而偶联到第一和/或第二药剂上。

合适的额外抗癌药物包括但不限于抗肿瘤药，如伊沙匹隆(ixabepilone)、吉西他滨和其衍生物、拉帕替尼、环磷酰胺、甲氨蝶呤(methotrexate)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine；bcnu)、甲基-ccnu、顺铂(cisplatin)、依托泊苷、胆甾醇对苯乙酸氮芥(phenesterine)、紫杉醇和其衍生物、多西他赛(docetaxel)和其衍生物、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、他莫昔芬(tamoxifen)和哌泊舒凡(piposulfan)。

抗癌剂优选是阿霉素和其衍生物、紫杉醇和其衍生物、吉西他滨和其衍生物、多西他赛和其衍生物、喜树碱、伊沙匹隆或拉帕替尼。

3.其它治疗活性剂

在一些实施例中，治疗活性剂是抗癌剂。在一些实施例中，治疗活性剂不是抗癌剂。额外治疗活性剂包括但不限于肽、抗体和免疫刺激剂。

b.聚合物

在一些实施例中，治疗活性剂通过直接或间接(例如，通过连接基团)地共价连接到一个生物相容性聚合物上而彼此偶联，生物相容性聚合物例如含有羧酸、羟基、胺或硫醇官能团或其组合的水溶性生物相容性聚合物。

在其它实施例中，活性剂不是彼此偶联，而是第一活性剂通过共价键直接或间接(例如，通过连接基团)地偶联到第一聚合物上，并且第二活性剂通过共价键直接或间接(例如，通过连接基团)地偶联到第二聚合物上，其中第一和第二聚合物相同或不同。在活性剂中的两个或更多个不是彼此偶联而是偶联到相同聚合物上的实施例中，术语“相同聚合物”是指不考虑分子量，具有相同重复单元的不同聚合物分子。举例来说，第一聚合物可以是特定分子量的透明质酸并且第二聚合物可以是与第一聚合物相同或不同分子量的透明质酸。

如果在药物组合物中存在超过两种药剂，那么额外的药剂可以连接到额外的聚合物上，或可以连接到第一或第二聚合物上。

在一些实施例中，两种或更多种治疗活性剂通过非共价相互作用而不是共价键连接到一种或多种生物相容性聚合物上。

聚合物优选地无毒、非免疫原性并且容易从活的生物体中排出。聚合物任选地是生物可降解的。聚合物优选是水溶性聚合物，聚合物任选地含有羧酸、羟基、胺或硫醇官能团或其组合。

含有与羟基、氨基或巯基反应的官能团或能够转化为与羟基、氨基或巯基反应的官能团的基团的聚合物可以用来制备本文中所述的结合物。或者，聚合物可以含有亲核基团，如羟基、氨基或硫醇基，它们与每一个活性剂上的亲电基团反应。

合适的聚合物包括但不限于透明质酸(ha)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(hpma)、聚(异丁烯-交替-马来酸酐)(pibma)、聚(天冬氨酸)、聚(谷氨酸)、聚赖氨酸、聚(丙烯酸)、褐藻酸、壳聚糖、羧甲基纤维素、羧甲基葡聚糖、聚乙烯亚胺、聚酯以及其共混物和共聚物。

聚合物所具有的分子量通常是1,000到1,000,000道尔顿，优选是10,000到1,000,000道尔顿。在一个实施例中，聚合物可通过水解降解。在优选实施例中，聚合物是透明质酸。

c.连接基团

两种或更多种治疗活性剂，如两种或更多种抗癌剂，可以通过连接基团间接地结合到一种或多种生物相容性聚合物的主链或侧链上。

药物组合物中的连接基团(或其一部分)或药剂与连接基团之间的键中的一个或多个可以按与另一个连接基团或不同药剂与另一个连接基团之间的键中的一个或多个的裂解相同的速率或不同的速率裂解。裂解可以通过任何合适的机理发生，如通过水解、酶促裂解、施加热能、光能或其组合。

连接基团可以是同型双官能或异型双官能连接基团。在一些情况下，使用同型双官能连接基团和异型双官能连接基团的组合。

同型双官能连接基团的实例包括但不限于己二酸二酰肼；氨基酸，如甘氨酸；醛，如乙二醛、丙酮醛、2-甲酰基-丙醛、戊二醛、己二醛、庚二醛、辛二醛；二缩水甘油醚；二醇，如1,2-乙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、1,5-戊二醇、苯-1,4-二醇、1,6-己二醇、四(乙二醇)二醇)、peg；二硫醇，如1,2-乙二硫醇、1,3-丙二硫醇、1,4-丁二硫醇、2,3-丁二硫醇、1,5-戊二硫醇、苯-1,4-二硫醇、1,6-己二硫醇、四(乙二醇)二硫醇)；二胺，如乙二胺、丙-1,2-二胺、丙-1,3-二胺、n-甲基乙二胺、n,n'-二甲基乙二胺、戊-1,5-二胺、己-1,6-二胺、精胺和亚精胺、己二酸二乙烯酯、癸二酸二乙烯酯、二胺封端的peg、双酯peg-n-羟基丁二酰亚胺以及二异氰酸酯封端的peg。在一个优选实施例中，同型双官能连接基团是己二酸二酰肼。

异型双官能连接基团的实例包括但不限于表氯醇(epichlorohydrin)、s-乙酰基巯基乙酸n-羟基丁二酰亚胺酯、5-叠氮基-2-硝基苯甲酸n-羟基丁二酰亚胺酯、4-叠氮基苯甲酰甲基溴、溴醋酸n-羟基丁二酰亚胺酯、n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳化二亚胺、碘醋酸n-羟基丁二酰亚胺酯、4-(n-间马来酰亚胺基)二苯甲酮3-(2-吡啶二硫代)丙酸n-羟基丁二酰亚胺酯3-马来酰亚胺基苯甲酸n-羟基丁二酰亚胺酯、n,n'-胱胺-双丙烯酰胺、n,n'-亚甲基-双丙烯酰胺以及n,n'-亚乙基-双丙烯酰胺。

d.活性剂的比率

药物组合物中的每个活性剂的相对量经过选择，从而在药物组合按配制品形式一起递送时提供协同效应。

为了提供协同效应，配制品中活性剂的合适比率可以使用周(chou)和塔拉利(talalay)的组合指数(ci)确定。(周t.c.,《药理学综述(pharmacolrev)》,2006.58(3):第621-81页)。在这个分析中，按各种摩尔比(r)组合感兴趣的活性剂来评估协同作用。

组合指数(ci)定理提供关于药物组合的累加效应(ci＝1)、协同作用(ci<1)和拮抗作用(ci>1)的定量定义，其中协同作用大于累加效应，拮抗作用小于累加效应。

举例来说，关于含有两种药物的配制品，所推导出的组合指数方程是：

如在方程i中所使用的，d是剂量(或药物的浓度)；fa是受d影响的分数并且可以用来描述例如生长受到抑制的细胞的分数、肿瘤体积的减小分数或因为药物暴露而受到抑制的其它药物靶标的分数；dm是中效剂量(median-effectdose，例如ic50)；并且m是表示剂量-效应关系的形状的系数。(dx)1表示“单独”使体系抑制x％的(d)1，并且(dx)2表示“单独”使体系抑制x％的(d)2，然而在分子中，(d)1+(d)2“组合”也抑制x％。应注意，最后两项的分母是中效方程(median-effectequation；mee)的表达式。

ci值定量地定义协同作用(ci<1)、累加效应(ci＝1)和拮抗作用(ci>1)。

摩尔比可以从体外实验研究推导。如实例2中所公开的，在bt-474或bend.3细胞中评估了喜树碱与阿霉素的组合的摩尔比。组合指数(ci)随着药物摩尔比(r)增加而减小，在r(cpt:dox)>2(即，0.01<ci<0.08)时出现最大协同作用。

药剂的摩尔比在约1:1到约1:1000的范围内。在1:1与1:1000之间的摩尔比的所有整数对、有理数对或整数对和有理数对都被具体考虑到并公开。在一些方面，摩尔比范围的选择条件是ci小于1。另外，还具体地考虑并公开了所有由这些摩尔比中的任一对限定的范围。举例来说，在一些实施例中，紫杉醇:阿霉素对(pac:dox)的比率是在约1:1与约1:100之间，优选1:60；阿霉素:吉西他滨对(dox:gem)的比率是在约1:1与约1:10之间，优选1:1.3。

e.药物递送的时间表

药物组合物中的聚合物-药物结合物能够使得不同药物同时或在不同时间从配制品中释放以实现协同效应。在一些实施例中，药物在不同时间释放。

关于影响药物的同时释放的药物递送时间表，药物可以与相同或不同的聚合物结合。药物优选与相同聚合物通过键直接结合或通过按相同速率裂解的连接基团间接结合。药物优选通过与相同聚合物(即相同分子)结合而彼此偶联。裂解可以通过水解、酶促裂解、施加热能、光能或其组合发生。

当药物递送时间表影响药物在给予患者药物组合物之后的不同时间的释放时，药物使用键或按不同速率裂解的连接基团与相同或不同聚合物结合。裂解可以通过水解、酶促裂解、施加热能、光能或其组合发生。在给予含有一种或多种聚合物-药物结合物的药物组合物之后，不同药物按照相差数秒、数分钟、数小时、数天、数周、数月或数年的时间表释放。药物递送时间表优选相差数小时或一周以内，最优选相差数小时或数天。第二药物通常在第一药物释放后24小时、36小时或48小时内释放。举例来说，在给予含有一种或多种聚合物-药物结合物的药物组合物之后，具有第一药物的第一聚合物-药物结合物在给药后的第一段时间之后开始释放其药物。在给药后的第二段时间之后，具有第二药物的第二聚合物-药物结合物开始在第二段时间后释放第二药物。在第一和第二聚合物-药物结合物中的每一个中，药物释放时间(递送时间表)可以视需要改变以实现所期望的协同效应。

在一些实施例中，特定药物组合物中的不同药物的药物递送时间表是相同的，即各药物同时释放。

f.剂型

药物组合物可以采用任何合适的给药形式。在一些实施例中，剂型是肠胃外剂型。在某些实施例中，组合物局部给予，例如通过直接注射到待治疗部位中(例如，注射到肿瘤中)。在其它实施例中，药物组合物按肠内剂型提供。合适的口服剂型包括但不限于片剂、胶囊、溶液、悬浮液、乳液、糖浆以及锭剂。用于经粘膜给药(鼻内、经阴道、经直肠或舌下)的合适剂型包括但不限于溶液、悬浮液和乳液。

a.肠胃外剂型

合适的肠胃外剂型包括但不限于溶液、悬浮液和乳液。在一些实施例中，药物组合物被直接注射到肿瘤部位中。

用于肠胃外给药的配制品可以含有一种或多种药学上可接受的赋形剂，包括但不限于表面活性剂、盐、缓冲液、ph调节剂、乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、渗透压摩尔浓度(osmolality)/张力调节剂以及水溶性聚合物。

乳液在重构(reconstitution)后通常被缓冲到ph3-8以便肠胃外给药。合适的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液以及柠檬酸盐缓冲液。

防腐剂可以用来防止真菌和微生物的生长。合适的抗真菌剂和抗微生物剂包括但不限于苯甲酸、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、叠氮化钠、苯甲酸钠、丙酸钠、苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)、苄索氯铵(benzethoniumchloride)、苯甲醇、西吡氯铵(cetypyridiniumchloride)、氯丁醇、苯酚、苯乙醇以及硫柳汞(thimerosal)。

b.剂量

每个药物组合物的合适剂量可以通过已知方法确定。举例来说，肠胃外给予的药物组合物的合适剂量在1-300mg/m²范围内，这些药物组合物含有至少一种topi抑制剂和至少一种topii抑制剂与一种或多种生物相容性聚合物结合。剂量还可以表示为每千克体重药物的毫克数(mg/kg)。以mg/kg计，剂量优选≤50mg/kg。剂量还可以表示为聚合物-药物结合物中活性药物的摩尔百分比(mol％)。以mol％计，活性药物构成≤20mol％的聚合物配制品。剂量还能表示为浓度，如皮摩尔(pm)、纳摩尔(nm)或微摩尔(μm)。按微摩尔(μm)表示，每个治疗活性剂或抗癌剂的剂量在约0.001μm与约10μm之间、在约0.001μm与约5μm之间、在约0.001μm与约1μm之间、在约0.001与约0.5μm之间。每个治疗活性剂或抗癌剂的剂量优选在约0.001μm与约10μm之间。

iii.制造方法

本文中所述的组合物可以通过将如抗癌剂或其衍生物这样的治疗活性剂或其衍生物中的任一种共价连接到水溶性生物相容性聚合物上来制备。举例来说，使用本领域中已知的各种化学作用活化待与聚合物偶联的抗癌剂(或治疗活性剂)，形成反应性衍生物。在一些实施例中，抗癌剂或治疗活性剂已经含有不需要在与聚合物结合之前活化的官能团。抗癌剂(或治疗活性剂)的反应性衍生物与聚合物反应，把药剂共价连接到聚合物上。反应性衍生物可以含有亲核基团或亲电基团，它们分别与聚合物上相应的亲电基团或亲核基团反应。抗癌剂或治疗活性剂直接地或通过连接基团间接地结合到聚合物上。

一般来说，抗癌剂或其它治疗活性剂通过各种键与聚合物结合，由此修改药物的释放速率。举例来说，在透明质酸的情况下，已报道了氨基在葡糖醛酸残基的羧基官能团处的偶联(欧门(oomen)等人,《大分子生命科学(macromolecularbioscience)》2014,14,327-333)，其内容以引用的方式并入本文中。含有如胺这样的合适基团的抗癌剂或其它治疗活性剂可以通过酰胺键的形成与透明质酸结合。另外，可以使用如高碘酸钠这样的合适氧化剂氧化在葡糖醛酸残基的碳-2和碳-3处的邻二醇基团，形成醛。醛能够与抗癌剂或治疗活性剂上如胺这样的合适基团反应，通过亚胺键将药物结合到聚合物上。

此外，可以使用双官能连接基团来结合药物与聚合物(蔡(cai)等人,《控释杂志(journalofcontrolledrelease)2010,146(2),212-218)，其内容以引用的方式并入本文中。简单来说，如己二酸二酰肼这样的同型双官能连接基团与透明质酸的羧基反应形成腙，同时抗癌剂或其它治疗活性剂与未反应的连接基团的自由端反应以结合药物与聚合物。

此外，抗癌剂或其它治疗活性剂可以与合适的分子反应形成前药。举例来说，吉西他滨能够与氨基酸反应形成吉西他滨-氨基酸酯(宋(song)等人,《分子药剂学(molecularpharmaceutics)》2005,2(2),157-167)，其内容以引用的方式并入本文中。举例来说，甘氨酸的羧基能够与吉西他滨的脱氧核糖环的3'羟基处的羟基反应形成酯键(参见例如图16a)。吉西他滨的其它示范性前药描述于实例8中并且图示于图16b和图16c中。前药然后通过前药上的合适官能团与如透明质酸这样的聚合物结合。

本领域的普通技术人员将了解，这些仅仅是说明性实例，并且可以按照类似方式修改其它抗癌剂或治疗活性剂，或可以使用药剂与聚合物或连接基团的其它结合机理来制备聚合物-药物结合物。

iv.使用和给予方法

本文中所述的组合物可以用来治疗患者的癌症。待治疗癌症包括但不限于乳腺癌(例如，转移性或局部晚期乳腺癌)、前列腺癌(例如，激素难治的前列腺癌)、肾细胞癌、肺癌(例如，小细胞肺癌和非小细胞肺癌(包括腺癌、鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌和大细胞癌))、胰腺癌、胃癌(例如，胃食管癌、胃上部癌或胃下部癌)、结肠直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌(例如，晚期卵巢癌、对铂类药剂有耐药性的或复发性的卵巢癌)、淋巴瘤(例如，伯基特氏(burkitt’s)、霍奇金氏(hodgkin’s)或非霍奇金氏(non-hodgkin’s)淋巴瘤)、白血病(例如，急性骨髓性白血病)以及胃肠癌。

在一个实施例中，相比于递送相同量的呈非结合形式的治疗活性剂的组合，一种或多种不良副作用减少，治疗活性剂如拓扑异构酶i和ii抑制剂。在一些实施例中，不良副作用是血液学毒性。

实例

通过参考以下非限制性实例可以进一步理解本发明。

实例1.合成透明质酸结合物

材料和方法

从美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich(st.louis,mo,usa))购得喜树碱(cpt)、盐酸n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳化二亚胺(edc)、4-(二甲氨基)吡啶(dmap)、乙二胺、吐温-80(tween-80)以及罗丹明b(rhodamineb；rhob)。从美国马萨诸塞州沃本的lc实验室(lclaboratories(woburn,ma,usa))获得阿霉素(dox)。从美国北卡罗来纳州温斯顿塞勒姆(winstonsalem,nc,usa)的creativepegworks购得250kdamw的透明质酸(ha)。从美国新泽西州皮斯卡塔韦的ge医疗生命科学(gehealthcarelifesciences(piscataway,nj,usa))获得sephadexg-25pd-10柱。

根据方案1中的程序，cpt和dox通过亲核酰基取代与ha结合。

通过形成酯实现cpt与透明质酸上的羧酸部分的结合(李(lee)等人,《生物结合化学(bioconjugchem)》,2008.19(6):第1319-25页)，或通过氨解实现dox结合(明科(minko)等人,《国际癌症杂志(intjcancer)》,2000.86(1):108-17)。针对每个反应，在搅拌和轻微加热(40℃)下，将100mg的250kdamwha溶解在10ml的dmso/水(按体积计1:1)混合物中。相对于ha按0.75:1的摩尔比添加dmap和edc，并在搅拌下活化聚合物1小时。为了cpt结合的ha(cpt-ha)，按0.4:1cpt:ha的摩尔比向反应混合物中缓慢添加cpt。为了dox结合的ha(dox-ha)，按0.2:1dox:ha的摩尔比将dox溶解在反应混合物中。

通过将cpt-ha处理3天，然后使dox与cpt-ha偶联，合成cpt和dox结合的ha(cpt-ha-dox)。反应在40℃下进行。通过尺寸排阻色谱，通过在磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph7.4)中平衡后的sephadexg-25pd-10脱盐柱(排阻极限5000mw)，将cpt-ha和dox-ha与未反应的游离药物edc和dmap分离。将反应产物在0.5ml离心过滤管(3000nmwl)中最少浓缩三轮，每轮在16000g下进行15分钟。利用tecaninfinitem200pro读板仪，分别通过配制品连续稀释液在366nm和480nm下的吸光度测定cpt和dox的浓度。

结果

cpt-ha和dox-ha结合物均实现了1.6mol％药物:ha比率。cpt-ha-dox药物封装中的cpt是5.9mol％并且dox是1.8mol％。

实例2.细胞活力和药物组合研究

材料和方法：

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(mtt)来自赛默飞世尔(thermofisher)，draq5和hoechst购自英杰生命技术公司(invitrogenlifetechnologies)。从atcc获取乳腺癌her2过表达细胞系bt-474、小鼠转移性乳腺癌细胞系4t1、小鼠脑内皮细胞系bend.3、hybri-care培养基、杜氏改良伊格尔培养基(dulbecco’smodifiedeagle’smedium；dmem)以及细胞培养级别用水。从赛默科技(thermoscientific)购得胎牛血清(fbs)、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、rpmi-1640培养基、2-(n-吗啉基)乙磺酸(mes)缓冲液、0.25％胰蛋白酶、青霉素/链霉素以及nunclab-tek8孔腔室盖玻片。从美国纽约州的康宁(corning(ny,usa))购得细胞培养瓶和微量培养板。从美国马萨诸塞州比勒利卡的emd密理博(emdmillipore(billerica,ma,usa))购得微量离心过滤管。

细胞培养

使所有细胞系在含5％co2的湿润孵育箱中在37℃下生长。bt-474细胞在补充有10％fbs的hybri-care培养基中培养，并且4t1细胞在补充有10％fbs和1％青霉素/链霉素的rpmi-1640培养基中培养。内皮细胞系bend.3在补充有10％fbs和1％青霉素/链霉素的dmem培养基中培养。

bt-474和bend.3细胞中的细胞活力和药物组合研究

将bt-474或bend.3细胞按10,000个细胞/孔的密度按100μl/孔的总体积接种在96孔细胞培养板中并使其粘附过夜。然后用含有药物的新鲜培养基替换培养基。药物首先溶解在dmso中，然后在完全细胞培养基中进一步稀释以免将细胞暴露于超过0.5vol％的dmso中。bt-474细胞与药物溶液一起孵育72小时，而bend.3细胞则暴露于药物溶液中达48小时。药物孵育时间经过选择以使得所有未处理细胞不管是什么细胞系，在mtt代谢之后都展示类似的吸光度值。为了评估细胞活力，用含0.5mg/mlmtt的培养基替换培养基并孵育4小时。抽吸掉培养基并用二甲亚砜(dmso)替换以溶解细胞内还原的mtt(甲臜晶体)。通过瑞士文尼多夫(mannedorf,switzerland)的tecaninfinitem200pro读板仪在570nm下测量的吸光度测定甲臜染料强度。通过从未处理的对照细胞中减去实验孔中的活细胞并且针对对照细胞归一化来计算被抑制的细胞生长的分数。d50是指抑制50％细胞生长所需的药物浓度。将细胞毒性实验数据与由周和塔拉利开发的中效模型拟合，获得每个药物的体外细胞毒性曲线。

结果

cpt和dox在人乳腺癌细胞中的协同活性

测试cpt和dox在暴露72小时后对人乳腺癌细胞系bt-474的协同细胞生长抑制(图1a)。协同作用按组合指数(ci)定量(周,《药理学综述》,2006.58(3):621-81)；ci值低于1指示协同作用，而值大于1则意味着拮抗作用。ci随着药物摩尔比(r)增加而减小，在r(cpt:dox)>2(0.01<ci<0.08)时出现最大协同作用。最高ci是1±0.07，指示cpt和dox相互作用决不比添加剂差。

cpt和dox通过低ci值被鉴别为高度协同的，并被选择作为ha结合的模型组合。关于>2cpt:dox的摩尔比，发现ci值在0.01-0.1之间的范围内(图1b)。这些值是所报道的通过ci方法评定的药物相互作用研究中的最低值，并且因此协同作用最强，使得该对非常适用于对肿瘤共递送。先前报道发现cpt和dox在野生型大鼠c6神经胶质瘤细胞中仅仅是累加的，但在cpt抗性c6细胞系中稍微有点协同(帕维拉(pavillard)等人,《英国癌症杂志(brjcancer)》,2001.85(7):第1077-83页)。发现本研究中采用的bt-474人乳腺癌细胞本身对cpt具有抗性，d50是100μm，几乎是文献中所报道的cpt抗性c6细胞系的d50的50倍。然而，当用cpt和dox按r＝4.5的摩尔比处理bt-474细胞时，该对能够在比d50小100倍的cpt浓度下抑制95％的细胞生长(图1a)。此外，这种协同组合诱导凋亡前细胞相比于任一种单一药物处理增加>20％(图2)，从而显著改进了低药物浓度下的功效。

相比之下，cpt和dox在暴露于bend.3内皮细胞时展现拮抗作用。该组合不管比率如何，都能降低cpt或dox的毒性，如通过改进的内皮细胞活力所指示(图1c)。该组合对内皮细胞生长的抑制始终小于单独的cpt或dox，表明那一对对癌细胞的毒性远大于内皮细胞。

cpt和dox结合的ha的协同作用

按各种摩尔比混合cpt-ha和dox-ha并与bt-474细胞一起孵育。该组合对癌细胞生长的抑制比单独的cpt-ha或dox-ha要多(图5a)。就1<r<9cpt:dox来说，混合结合物的ci(图5b)小于1，指示cpt-ha和dox-ha在与游离的cpt和dox引发协同作用相同的比率下的确是协同的(图1b和图1d)。

cpt和dox然后与ha共结合。为了证实是协同的药物加载的载体，研究携带摩尔比r＝3.2cpt:dox的ha。体外细胞毒性研究显示，cpt-ha-dox对癌细胞生长的抑制比单独的cpt-ha(图6a)或dox-ha(图6b)要多。用混合的药物ha结合物和与ha共结合的药物进行的细胞抑制研究揭示，聚合物结合保留了cpt与dox之间的协同作用。虽然两种组合物都保留了药物对的效力，但是只有后者能够确保同时暴露于肿瘤细胞，并且能够提供用于捕捉体外以及体内抗肿瘤功效的手段。

实例3.膜联蛋白v(annexinv)/sytox绿色细胞凋亡分析

材料和方法

基于膜联蛋白v和sytox绿色复染进行细胞凋亡评估。研究遵循生命技术公司的细胞凋亡分析方案，针对bt-474细胞略微进行修改。简单来说，以每25cm²细胞培养瓶100×10⁴个细胞的浓度将细胞接种在总体积10ml的培养基中并使其粘附过夜。然后倾析掉培养基并用含有药物的新鲜培养基替换。药物首先溶解在dmso中，并在培养基中进一步稀释，使得细胞不会暴露于超过0.2vol％的dmso中。在药物存在下，孵育细胞72小时。在药物暴露之后，在膜联蛋白v结合缓冲液中收集到浓度为1×10⁶个细胞/毫升的细胞，并且将200μl的每个样品与5μl的膜联蛋白v-647和1μl的1μmsytox绿色一起孵育。染料孵育15分钟后，将细胞在冰冷的膜联蛋白v结合缓冲液中稀释5×，紧接着在bectondickinsonfacsaria细胞分类器(美国新泽西州富兰克林湖(franklinlakes,nj,usa))中通过流式细胞仪分析。为了给膜联蛋白v-647和sytox绿色荧光定量，分别采用具有660pmt的633nm激光器和具有530pmt的488nm激光器。被分类为-av/-sg的细胞是活细胞，+av/-sg的细胞是凋亡前细胞，并且被分类为+av/+sg的细胞是晚期凋亡或坏死细胞。

结果

流式细胞仪数据指示，相比于单独用dox处理，暴露于cpt+dox(r＝4.5，ci＝0.05±0.01)时早期凋亡群体增加24％(图2)，而暴露于累加比率r＝0.1的细胞则引起2％增加。仅暴露于cpt的细胞展现低百分比的凋亡细胞，与单独用dox处理的那些没法相比，可能是因为bt-474对cpt的固有抗性。因为cpt和dox分别抑制topi和ii，所以任一种药物对癌细胞的暴露都造成了dna损伤并且能够诱导细胞凋亡(沃尔顿(walton)等人,《癌症研究(cancerres)》,1993.53(8):1853-61)。

分析从经过膜联蛋白v/sytox绿色复染的细胞的流式细胞仪获得的散点图。图2中采用这些图对早期凋亡和晚期凋亡/坏死群体进行定量。被低水平的膜联蛋白v和sytox绿色(-av/-sg)染色的细胞是活细胞，被高水平的膜联蛋白v和低水平的sytox绿色(+av/-sg)染色的细胞是早期凋亡细胞，并且两种都是高水平的是坏死和/或晚期凋亡细胞。

实例4.内化研究

材料和方法

为了评估ha结合对cpt或dox在bt-474细胞中的内化的影响，采用共聚焦激光扫描显微镜。将细胞以每300μl培养基80,000个细胞的密度接种在8孔腔室硼硅酸盐盖玻片(nunclab-tek)上，并使其粘附过夜。将细胞在37℃和5％co2下暴露于相同药物浓度游离药物d50的游离药物溶液或ha结合物形式中达24小时。药物孵育后，用温热的pbs(ph7.4)洗涤细胞两次，然后在37℃、5％co2下用核染料染色。在暴露于dox的细胞的情况下，采用浓度为25μg/ml的hoechst核染料，达30分钟。至于暴露于cpt的细胞，为了避免cpt与核标志物之间的荧光重叠，使用培养基中浓度为5μm的draq5对核染色60分钟。细胞再在温热的pbs中洗涤两次，最后在即将成像之前悬浮于培养基中。所有细胞全都用配备有60×硅油物镜和37℃温控成像室的olympusfluoview1000光谱共聚焦进行实况成像。用以下激光器激发dox、cpt、hoechst和dapi：488nm10mw氩气(dox)、405nm50mw二极管(cpt或hoechst)和635nm20mw二极管(draq5)。捕捉到10μm的z-堆叠，随后用imagej1.47h软件(nih)分析。每个z-堆叠坍塌成平均图像，并按原始积分密度除以细胞数量报告荧光强度。每个视场中平均成像25个细胞。

以类似方式进行ha内化研究。从creativepegworks购得250kdamw的ha-荧光素(ha-f)并把它直接溶解在ph7.4的pbs中。聚合物经过在培养基中稀释，并与bt-474细胞一起孵育6小时。为了评估能量密集型内化的需要，在37℃或4℃下孵育细胞。使用hoechst标记细胞核。如上所述，在488nm下激发ha-f，并进行分析。

结果

进行内化研究是为了研究ha结合后药物活性变化的由来。通过有效方法使ha内化，如通过在4℃下缺乏内化得到证实(图8)。相比于游离的cpt，cpt-ha展现显著增强的吸收(图4a)，可能是因为其在结合到ha之后水溶性增强。dox-ha的吸收另一方面与游离的dox的吸收相当。然而，ha-dox的后续胞内分布显著不同于游离的dox的胞内分布。ha结合的dox大部分定位于围绕核的点状斑中，而游离的dox则扩散得更开并且与细胞核共定位。

实例5.体内抗肿瘤功效

材料和方法

在balb/c小鼠中采用原位4t1乳腺癌小鼠模型来评估cpt-ha-dox的体内抗癌功效。选择4t1模型是因为其在小鼠中稳固的肿瘤形成(普拉斯基(pulaski)和奥斯托兰得-罗森堡(ostrand-rosenberg),《免疫学实验室指南(currprotocimmunol)》,2001.第20章(2):第20单元2)，和为了用高度转移性侵袭性癌症攻击协同结合物(凡托齐(fantozzi.)和克利斯多佛利(christofori),《乳腺癌研究(breastcancerres)》,2006.8(4):212)。所有实验全部根据经过加州大学圣塔芭芭拉分校(theuniversityofcalifornia,santabarbara)的机构动物护理和使用委员会(institutionalanimalcareandusecommittee)批准的方案进行。从美国马萨诸塞州威尔明顿的查尔斯河实验室(charlesriverlaboratories(wilmington,ma,usa))购得六到八周龄的雌性balb/c小鼠。为了防止干扰正常的身体功能，通过在腹部乳腺中皮下注射5×10⁴个4t1细胞实现肿瘤接种。在注射之前，将4t1细胞在pbs中洗涤两次并再悬浮于无菌0.9wt/vol％nacl中。将小鼠随机分成实验组和对照组，从接种后第3天开始，每隔一天用所指定的配制品处理，总共处理五次(第3天、第5天、第7天、第9天、第11天)。通过相等药物剂量2mg/kgcpt和1.05mg/kgdox，用cpt-ha-dox或游离的cpt+dox的静脉内尾部注射液对小鼠进行处理。为了制备游离的药物配制品，首先将cpt溶解在10vol％吐温80、0.9wt/vol％nacl中。将dox直接溶解在0.9wt/vol％nacl中，随后与cpt溶液混合。在注射之前，在0.9％nacl中新制备cpt-ha-dox。通过肿瘤体积评估肿瘤生长抑制，肿瘤体积通过v＝1/2(l)×(w)²定量，其中l是通过数字卡尺测量到的最长的肿瘤直径并且w是最短的肿瘤直径。

结果

虽然所有体外研究都集中在bt-474人乳腺癌细胞的细胞抑制上，但cpt和dox协同作用也在4t1细胞中得到了验证并且在与bt-474相同的比率下发生(图9a到图10b)。每隔一天，静脉内给予小鼠指定配制品，总共处理5次。相对于对照，游离的药物组合实现了高达70％的肿瘤体积减少(图7a)，并且共结合聚合物实现了50％的肿瘤减少。两种情况下观察到的体重改变都可忽略不计(图7b)。

实例6.体内毒性

方法和材料

为了进一步评估肿瘤生长抑制，还对在处理后切下的肿瘤进行了胱天蛋白酶-3(caspase-3)免疫组织化学和苏木精和伊红(hematoxylinandeosin；h&e)组织学分析。将肿瘤固定并进一步送到masshistologyservices公司，这家公司对组织进行了石蜡封闭，染色，并分析。为了评估配制品毒性，每天一次测量体重。另外，在实验结束时收集肝脏、脾、心脏和肺器官，将其固定并进一步由美国马萨诸塞州伍斯特(worcester,ma,usa)的masshistologyservices公司通过h&e染色进行分析。对经过游离的和ha结合的cpt+dox处理的小鼠进行组织学分析以评估配制品毒性。在处理后收集心脏、肺、脾和肝脏器官，紧接着固定在10％甲醛中，并且进一步储存在70％乙醇中。组织学制备和h&e染色在100×放大倍数下获取并代表着每一组(n＝3)。

结果

对处理后的肿瘤切片进行胱天蛋白酶3免疫组织化学分析以进一步评估cpt和dox配制品的抗肿瘤功效。虽然经过游离的cpt+dox处理的小鼠中总的肿瘤减少更多，但在经过cpt-ha-dox处理的肿瘤中发现了更多凋亡细胞。h&e染色显示，相比于经过游离的cpt+dox处理的小鼠，在经过cpt-ha-dox处理的小鼠中，坏死更多。组织学分析表明，虽然宏观测量结果指示游离的cpt+dox混合物在减小肿瘤大小方面更有效，但是cpt-ha-dox在诱导坏死和凋亡诱导的细胞死亡方面更有效。在处理后，对重要器官进行组织学分析以进一步研究配制品毒性。在经过cpt+dox处理和经过cpt-ha-dox处理的小鼠中，肺、脾和肝脏器官都显示无毒性。从经过cpt-ha-dox处理的小鼠上切除的心脏切片指示轻度炎症，而从经过cpt+dox处理的小鼠上切除的心脏切片显示无毒性。总的来说，两种配制品都有良好的耐受性，无严重副作用。未处理小鼠、经过cpt-ha-dox处理的小鼠和经过游离的cpt+dox处理的小鼠之间的比较显示在肺、脾和肝脏器官中不存在处理相关的毒性。在经过cpt-ha-dox处理的小鼠的心脏中发现了轻度炎症，而在经过游离的cpt+dox处理的小鼠中观察到正常的心脏染色。总的来说，游离方法和ha结合的方法均显示极小毒性和良好的耐受性。

实例7.药物递送时间表对协同作用的影响

材料和方法

从美国马萨诸塞州沃本的lc实验室(lclaboratories(woburn,ma,usa))购得盐酸阿霉素(dox)、盐酸吉西他滨(gem)、紫杉醇(pac)、伊沙匹隆(ixa)以及拉帕替尼二对甲苯磺酸盐(lap)。从美国北卡罗来纳州温斯顿塞勒姆的creativepegworks购得250kdamw的透明质酸(ha)。从赛默飞世尔购得mtt。从西格玛-奥德里奇公司购得dmso。

细胞活力分析

在补充有10％fbs和1％ps的rpmi1640培养基中培养mda-mb-231细胞(atcc)。在补充有100ng/ml霍乱毒素的megm完全培养基(不包括ga-1000)中培养mcf-10a细胞(atcc)。关于细胞活力分析，将mda-mb-231和mcf-10a细胞按5000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。第二天，去除培养基，并且添加含有第一药物的培养基。取决于所测试的时间表，在稍后的时间点，通过去除孔中所有的培养基(其含有第一药物)，并向孔中添加含有第二药物的新培养基，添加第二药物(它不同于第一药物)。在研究结束时(通常是72小时)，用含mtt试剂的培养基(0.5mg/ml)替换培养基(其含有第二药物)。在将细胞与mtt一起孵育4小时之后，去除培养基并用dmso替换。在振荡30分钟后，在读板仪上在570nm下读取吸光度。

测试两类时间表：同时暴露，包括细胞对第一和第二药物的当前暴露；和依次暴露，包括细胞对第一药物暴露第一段时间，然后细胞对第二药物暴露第二段时间。

针对同时暴露所测试的时间表包括细胞对第一药物和第二药物同时暴露整整三天时间。针对依次暴露所测试的时间表包括细胞对第一药物暴露4、12、24或36小时，然后分别是细胞对第二药物暴露68、60、48或36小时。

结果

通过对随不同的药物给予时间表而变的细胞抑制进行定量，以实验方式观察药物递送时间表对协同作用的影响。每对药物在药物递送时间表与协同作用之间都有独特的关系。举例来说，示出了三对不同药物(利用接近单独药物的ic50的剂量)在mda-mb231细胞中的细胞毒性分数随时间的变化，其中细胞暴露于第二药物中(图11)。虽然某几对药物显示出了时间表对细胞毒性的显著影响(dox/pac和dox/gem)，但是药物递送时间表对其它几对药物(pac/ixa)不起显著作用。

为了确定时间表对协同作用的影响，需要按与组合中完全相同的时间表筛选单独的药物，因为每个药物都有其自身独特的药效学。举例来说，将三阴性乳腺癌细胞(mda-mb231)暴露于各种时间表的dox与gem的组合和单独的药物中(图12)。使用周-塔拉利方法计算每个药物给予时间表的组合指数(ci)。关于每个相应的时间表，ci值利用游离药物在相同的给药时间表下产生的剂量反应曲线，如图12b中关于一个特定剂量所示。

虽然dox和gem在同时提供三天时是协同的(ci<1)，但是当gem先于dox提供时，协同作用的程度显著增加(图12c)。当dox先于gem提供时，观察到相反的影响。

在设计含有dox和gem的聚合物-药物结合物组合时，化学连接基团的强度优选使得gem比dox更快地释放。

在设计聚合物-药物结合物用于组合疗法时，时间表和摩尔比均应该从癌症细胞和健康细胞毒性方面来考虑。在协同作用最强的时间表下，比较mda-mb231细胞(gem(1d)→dox(2d))与健康的乳腺上皮细胞系(mcf-10a)的协同作用程度。利用接近两个细胞系中的ic50的药物剂量，计算随dox与gem之间的摩尔比而变的ci。

在大于0.3的gem:dox摩尔比下，从gem到dox的依次递送在癌细胞中的协同作用显著大于健康细胞中。当提供gem超过dox时，这种差异增强(图13)。

当将lap和pac递送到her2+乳腺癌细胞系bt-474中时，观察到不同结果。举例来说，在pac之前4小时递送lap和在lap之前4小时递送pac对her2+乳腺癌细胞系bt-474具有协同作用；然而，同时递送两个药物具有拮抗作用(图14)。

实例8.合成dox-ha和gem-ha结合物

材料和方法

从美国马萨诸塞州沃本的lc实验室购得盐酸阿霉素(dox)和盐酸吉西他滨(gem)。从美国北卡罗来纳州温斯顿塞勒姆的creativepegworks购得透明质酸钠(250kdamw，10mg/ml)。从西格玛-奥德里奇公司购得n,n,n',n'-四甲基-o-(苯并三唑-1-基)脲鎓(uronium)四氟硼酸盐(tbtu)、盐酸1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(edc)、boc-甘氨酸、无水dmf、dmso、醋酸乙酯、dipea、甲醇、碳酸氢钠、dcm、tfa以及sio2树脂。

(i)dox-ha结合物

dox通过各种键与ha结合，这些键的强度不同，从而使得药剂(dox)在不同时间释放。

(a)dox-ha亚胺

可以用naio4氧化ha上的邻二醇基团，产生醛，醛与dox上的伯胺基反应，形成亚胺(图15a)。

将透明质酸钠(250kda，10mg/ml)溶解到去离子水中，与高碘酸钠(5mol％，相对于二糖重复单元)混合，在暗处在室温下搅拌4小时，使邻二醇基团氧化为醛。氧化后的聚合物通过透析和冻干纯化。然后，将聚合物溶解到ph6的5mm磷酸盐缓冲液(10mg/ml)中，与dox·hcl(5mol％，相对于二糖重复单元)混合。产物沉淀下来并用丙酮洗涤，然后进一步通过透析纯化。亚胺在大约一天之内被完全水解在ph5的酸性条件中。

(b)dox-ha肼

ha上的羧酸基能够与己二酸二酰肼偶联，它与dox上的酮反应形成腙(图15b)，腙在酸性条件下也快速水解。

本实例中所用的一般合成改编自先前报道(蔡等人,《控释杂志》2010,146(2),212-218)。简单来说，将透明质酸钠(250kda，10mg/ml)溶解在去离子水中并与等摩尔量的己二酸二酰肼(adh)混合。添加呈粉末形式的edc·hcl(10mol％，相对于二糖重复单元)，在室温下搅拌反应过夜。产物沉淀下来并用丙酮洗涤。然后将产物(ha-adh)溶解到ph6.5的5mm磷酸盐缓冲液(10mg/ml)中，与dox·hcl(5mol％，相对于二糖重复单元)混合，在室温下搅拌过夜。再次通过沉淀和在丙酮中洗涤，接着进行透析来分离产物。

(c)dox-ha酰胺

最后，可以通过使dox上的胺直接与ha上的羧酸结合，形成强酰胺键(图15c)。

本实例中所用的一般合成先前已有报道(欧门等人,《大分子生命科学》2014,14,327-333)。简单来说，将透明质酸钠(250kda，10mg/ml)溶解在去离子水中并与dox·hcl(5mol％，相对于二糖重复单元)混合。然后添加呈粉末形式的edc·hcl(5mol％，相对于二糖重复单元)，在室温下搅拌反应过夜。产物沉淀下来并用丙酮洗涤，然后进一步通过透析纯化。

(ii)gem-ha结合物

还可以按各种键强度形成ha-gem结合物。因为gem上的胺基的反应性比dox上的小得多，所以通常合成gem-甘氨酸前药来增加与ha结合的药物的量。本实例中形成了两个不同版本的前药来改变gem的活性形式从gem-甘氨酸释放的速率(图16)。

前药可以通过使boc保护的甘氨酸上的羧酸与gem上的胺或醇基团偶联形成酰胺或酯，然后去除boc保护基来合成。gem-甘氨酸前药然后可以利用甘氨酸上的胺基与ha结合，形成亚胺或酰胺，分别如图15a和图15c中所示。

(a)gem-甘氨酸酰胺

将boc-甘氨酸与等摩尔量的n,n,n',n'-四甲基-o-(苯并三唑-1-基)脲鎓四氟硼酸盐(tbtu)和无水dmf中的dipea(1.5摩尔当量)混合。将gem·hcl溶解到含有等摩尔量的dipea的无水dmf中。在将boc-甘氨酸上的羧酸活化30分钟之后，向gem溶液中逐滴添加boc-甘氨酸。搅拌反应1小时，然后通过旋转蒸发去除大部分dmf。boc-甘氨酸-gem酰胺通过洗涤步骤萃取到醋酸乙酯中，然后使用10:1.25dcm:甲醇溶剂洗脱剂进行sio2色谱来分离，洗涤步骤由di水、饱和碳酸氢钠和盐水组成。然后在tfa:dcm的1:1混合物中去除boc保护基，然后通过旋转蒸发去除溶剂。gem-甘氨酸酰胺前药的示意图示出在图16b中。

(b)gem-甘氨酸-ha酰胺

透明质酸钠通过与等摩尔量的hcl混合而转化成酸性形式(ha)并且分离冻干。然后将ha溶解到无水dmso(10mg/ml)中并与tbtu(5mol％，相对于二糖重复单元)和dipea(10mol％，相对于二糖单元)混合。搅拌15分钟后，向活化后的聚合物中添加gem-甘氨酸(5mol％，相对于二糖重复单元)。聚合物结合物通过沉淀和在醋酸乙酯中洗涤，然后进一步透析来分离。

(c)gem-甘氨酸-ha亚胺

将透明质酸钠(250kda，10mg/ml)溶解到去离子水中，与高碘酸钠(5mol％，相对于二糖重复单元)混合，在暗处在室温下搅拌4小时，使邻二醇基团氧化为醛。氧化后的聚合物通过透析和冻干纯化。然后，将聚合物溶解到ph6的5mm磷酸盐缓冲液(10mg/ml)中，与gem-甘氨酸(5mol％，相对于二糖重复单元)混合。搅拌4小时后，通过沉淀和用丙酮洗涤，然后透析来分离产物。