靶向细胞内肿瘤相关抗原的用于治疗癌症的缀合物的制作方法

相关申请本专利合作条约申请基于2015年3月18日提交的美国临时专利申请no.62/134,634的优先权要求35u.s.c.§119的权益，所述美国临时专利申请no.62/134,634的全部内容通过引用并入本文。发明领域本公开涉及针对选择的非跨膜肿瘤抗原的缀合物、优选地抗体-药物缀合物，所述抗原在正常情况下为细胞内的并且可由癌细胞分泌，例如人组织蛋白酶d或组织蛋白酶e。背景用靶向疗法治疗癌症的挑战之一是选择性识别和杀灭癌性恶性细胞，同时避免对正常的未转化细胞造成损害。研究已鉴定出了许多肿瘤特异性抗原(tsa)或肿瘤相关抗原(taa)。已经开发出了通常针对一种或更多种肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的许多靶向生物疗法。这些靶向生物疗法包括单克隆抗体疗法和更近期的加强抗体疗法(potentiatedantibodytherapeutics)或抗体-药物缀合物(antibody-drugconjugates，adcs)，其是由抗原识别部分、稳定的或可切割的接头和与接头相连的药物(通常是高细胞毒性的分子)组成的生物前药。抗体-药物缀合物由于它们携带的细胞毒性有效载荷(payload)的活性高而可以实现癌细胞的特异性杀灭，主要的障碍是选择性。肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原通常包括突变的原癌基因、致癌基因、肿瘤抑制基因的产物，癌胚胎抗原(oncofetalantigens)，改变的细胞表面蛋白，细胞类型特异性分化抗原和由致癌病毒产生的抗原或正常表达水平或模式在癌症中已改变的蛋白质。迄今鉴定和验证的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原包括ca-125、癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，cea)、muc-1、甲肽蛋白(afp)、黑素瘤相关抗原(mage)、ca-125或muc-16等(hinrichs和restifo2013)。与正常细胞相比在癌细胞中具有异常表达水平或模式的肿瘤抗原还包括许多细胞表面表达的蛋白质，包括通常被发现在癌细胞中过表达的跨膜受体蛋白，例如egfr和erbb2(her2)。许多肿瘤特异性靶抗原或肿瘤相关靶抗原在癌症中具有非常多样的表达模式，并且一旦被靶向，可以通过负向选择和标志物阴性细胞的扩增而导致抗性的发生。在肿瘤内具有均一表达谱的靶抗原可以是有帮助的。已经开发了许多临床上成功的生物疗法，其基于选择的细胞表面抗原的过表达而相对于正常细胞对癌细胞有一定程度的选择性，例如靶向在其表面上过表达her2抗原的癌细胞的曲妥珠单抗及其抗体-药物缀合物曲妥珠单抗emtansine。高选择性对于成功的抗体-药物缀合物是重要的，因为抗体-药物缀合物的整体疗效或治疗窗是由抗癌活性与对正常细胞的安全性和毒性之间的精细平衡来确定的。抗体疗法通常识别和结合可接近的细胞表面暴露的抗原，并且几乎所有开发中的生物疗法或在临床中批准的那些均基于某种细胞表面表达的抗原而靶向癌细胞。这种限制同样存在于增强生物制剂的抗体-药物缀合物类的现有成员中，对此，被广泛承认的是：关于靶抗原选择，需要满足一些标准以实现治疗功效，包括：(a)抗体-药物缀合物必须是选择性的并且识别细胞表面表达的肿瘤抗原(即，相对于正常细胞在癌细胞上选择性表达或过表达)；和(b)抗体-药物缀合物的靶抗原必须能够促进其内化进入细胞以释放细胞毒性有效载荷(chari2008；trail2013)。例如，曲妥珠单抗emtansine如上所述是识别her2受体上的异位抗原的抗体-药物缀合物，其由her2受体在某些癌症中过表达而获得选择性，并由这种受体:抗体药物缀合物复合体的高速率内化和在溶酶体中的降解(后者导致释放毒性有效载荷)而获得活性(barok,joensuu等人，2014)。还已知：由于肿瘤抗原在正常细胞上的表达，抗体-药物缀合物可产生针对非癌细胞的显著在靶毒性，所述非癌细胞表达实质水平的所述抗体-药物缀合物的靶受体，从而导致缀合物内化(perez2008；bouchard,viskov等人，2014)。这可限制针对特定抗原的抗体-药物缀合物使用。据估计，超过100种不同的靶向某种细胞表面表达的跨膜肿瘤抗原的抗体-药物缀合物目前处于临床前和临床开发的各个阶段。然而，大多数有用的肿瘤抗原或癌症生物标志物(其仅在癌细胞中表达或在癌细胞中异常表达)是细胞内蛋白质。因此，它们的存在不能容易地在细胞表面上被识别和/或检测。目前认为这种肿瘤抗原或癌症生物标志物对于常规的生物疗法(包括抗体-药物缀合物)而言无成药性(undruggable)。实例包括诸如bcr-abl、brca1/2、brafv600e、s100蛋白、kras、myc蛋白质家族和p53的抗原。通过这种生物标志物的异常表达或活性鉴定的目前可用的针对肿瘤的靶向疗法通常基于小分子。例如，bcr-abl是由异常染色体易位引起的致癌产物。可以利用酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(imatinib)来靶向其中brc-abl驱动致癌生长的肿瘤，伊马替尼是一种对这种突变蛋白具有高度特异性的小分子。adc设计目前的标准包括：内化的抗体-药物缀合物被导向细胞表面表达的受体，以达到使抗体-药物缀合物治疗有效的足够内化(chari2008；senter2009；trail2013)；和抗体-药物缀合物被主动内化，即通过受体介导的内吞作用被内化，以达到在靶细胞中足够的积累和治疗活性(chari2008；senter2009；trail2013)。抗体-药物缀合物技术最近已经有很多进展，包括：毒性有效载荷的改进，缀合方法及其特异性的改进，接头设计和激活机制的改进，probodytm-药物缀合物的开发(probody是蛋白水解激活的抗体，其被设计为保持惰性直到在患病组织中局部地被激活)，以及作为用于该技术的合适靶标的新表面标志物的鉴定。新兴技术目前的焦点主要在于扩大抗体-药物缀合物的治疗窗，第二焦点在于鉴定新的细胞表面表达的肿瘤抗原作为合适的选择性靶标。美国专利申请us2014/0227175描述了结合到包含治疗性和/或诊断性部分的载体的半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶结合化合物，以用于诊断和/或治疗炎性疾病和/或用于诊断和/或治疗肿瘤性疾病，其中组织蛋白酶结合化合物被描述为结合到肿瘤基质的炎性细胞。概述在本公开中，证实了特异性结合人天冬氨酸蛋白酶组织蛋白酶d和/或组织蛋白酶d酶原(pro-cathepsind)(二者均不是跨膜受体)的抗体-药物缀合物可用于靶向和杀灭癌细胞。不希望受理论束缚，从疾病细胞分泌并且被细胞收回(重新内化或重新捕获)(例如通过受体介导的内吞作用、被动内吞作用或胞饮作用)的选择的在正常情况下在细胞内的蛋白质靶标可用于细胞毒性地靶向疾病细胞。在本公开中，还证实了：这种针对细胞外人组织蛋白酶d及其同种型的抗体-药物缀合物可用于优先于正常细胞选择性靶向和杀灭癌细胞(参见例如图3、4和8)。此外，如表2所示，对于乳腺癌细胞系，抗-组织蛋白酶dadc具有比得上抗-egfradc的ic50。然而，抗组织蛋白酶dadcimb-101和imb-102显示出比egfradcimb-701和imb-702低的对正常细胞的毒性。不希望受理论束缚，认为因为是癌细胞而非正常细胞主要分泌或过度分泌特定的靶抗原并使其重新内化，所以可导致选择性靶向。这种抗体-药物缀合物可以是有效和选择性的，无论蛋白质靶标仅被癌细胞重新内化还是被癌细胞和正常细胞二者重新内化均是如此。认为选择性主要是由于正常细胞(其中靶蛋白保持其细胞内定位)缺乏靶蛋白分泌，而癌细胞分泌蛋白靶标，其中大部分可留在细胞外环境中并紧邻肿瘤，其中一部分被癌细胞重新内化。通过靶标重新内化的特异性受体介导的内吞作用机制在肿瘤细胞和肿瘤相关基质(例如癌症相关成纤维细胞)的存在或放大，以及所述靶标重新内化的机制或受体在正常细胞的缺乏或低表达，从而赋予某些靶抗原额外的选择性。旁观者(bystander)肿瘤细胞杀伤也可由抗体-药物缀合物内化引起。例如，肿瘤中的一些细胞分泌的靶抗原可以与抗体-药物缀合物复合，然后被能够内化靶抗原的其它细胞内化。这包括归因于靶抗原-抗体-药物缀合物复合体被支持肿瘤生长的癌症相关成纤维细胞内化的旁观者效应。因此，在一个方面，本公开提供了一种缀合物，所述缀合物包含：a.靶向剂，其特异性结合人组织蛋白酶d靶抗原；b.细胞毒性部分，其任选地与所述靶向剂直接或间接连接；以及c.任选地，连接所述靶向剂和细胞毒性部分的接头。在一个实施方式中，缀合物是具有一个或更多个以下特征的抗体-药物缀合物：(a)与正常细胞相比对癌细胞有选择性；(b)能够基于肿瘤抗原或癌症生物标志物的异常或非规律的表达模式来识别或靶向癌细胞，所述肿瘤抗原或癌症生物标志物是非跨膜蛋白，不在细胞表面表达和/或在正常情况下具有细胞内表达模式；和(c)基于经由所述肿瘤抗原或癌症生物标志物的靶向而对肿瘤细胞有细胞毒性。在一个实施方式中，抗体药物缀合物特异性结合人组织蛋白酶d或组织蛋白酶d酶原，其是在正常情况下在细胞间但可以由癌细胞异常分泌的癌症生物标志物和/或肿瘤抗原。在一个实施方式中，本公开描述了包含强效细胞毒性有效载荷或毒素(“细胞毒性部分”)的抗体-药物缀合物。在一个实施方式中，adc包括ic50浓度(针对具有游离毒素的多个癌细胞系评估)在pm至低nm范围的毒素(trail2013)。此外，本文证实了：组织蛋白酶dadc显示出针对不同癌症类型进行选择性杀灭(图3、4和8)。因此，在一个实施方式中，本公开提供了将细胞毒素选择性递送至癌细胞的方法，所述方法包括使癌细胞与本文所述的缀合物或包含所述缀合物的组合物接触。在另一方面，本公开提供了选择细胞内肿瘤抗原作为靶标以生成选择性靶向剂-药物缀合物(例如抗体-药物缀合物)的方法，所述方法包括：(i)检测非癌细胞的候选抗原以确定其是否为细胞内的和/或在正常情况下不由非癌细胞分泌；(ii)检测癌细胞的候选抗原以确定其是否由癌细胞分泌；(iii)如果癌细胞以大于非癌细胞的量分泌靶抗原，则检测癌细胞的候选抗原以确定其是否能被癌细胞重新内化；(iv)将癌细胞以大于非癌细胞的量分泌且能被癌细胞重新内化的靶抗原鉴定为候选靶细胞内肿瘤抗原。在一个实施方式中，本文描述了针对非跨膜的，在正常情况下为细胞内的肿瘤抗原的抗体-药物缀合物。描述了对癌细胞有选择性和活性的针对人组织蛋白酶d肿瘤抗原的抗体-药物缀合物。抗体-药物缀合物也可对正常细胞提供最小毒性或对正常细胞无毒性。组织蛋白酶(包括人组织蛋白酶和组织蛋白酶d酶原)的抗体是本领域已知的。结合天然折叠的组织蛋白酶d和/或对天然折叠的组织蛋白酶d有特异性的抗体可用于产生本文所述的对组织蛋白酶d有特异性的抗体-药物缀合物。组织蛋白酶d是参与蛋白质降解和组织重塑的溶酶体天冬氨酰蛋白酶。人组织蛋白酶d或其已知的同种型(例如组织蛋白酶d酶原)在癌细胞中的表达或其由癌细胞的异常分泌已与癌症的存在、更活跃的癌症生长和进展、转移和/或癌症预后相关联(nomura和katunuma,2005；wozniak,mila-kierzenkowska等人，2008；vashishta,ohri等人，2009；abbott,margaryan等人，2010；dian,vrekoussis等人，2012；vetvicka和fusek,2012；khalkhali-ellis和hendrix,2014)。具体来说，组织蛋白酶d和/或组织蛋白酶d酶原已经被建议为多种癌症中的有用生物标志物，所述癌症包括：乳腺癌，包括三阴性乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、非小细胞肺癌(nsclc)、肝细胞癌(hcc)、头颈鳞状细胞癌(hnscc)、膀胱癌、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤(gbm)、小细胞肺癌、肾细胞癌、黑色素瘤和其他癌症(chambon等人，1994；makar等人，1994；ross等人，1995；nicotra等人，2010；sloman,d'amico等人，1996；tumminello,leto等人，1996；wang和zhao1998；gandour-edwards,trock等人1999；hara,miyake等人，2002；lentari,segas等人，2002；miyake,hara等人，2003；fukuda,iwadate等人，2005；merseburger,hennenlotter等人，2005；nomura和katunuma,2005；mbeunkui,metge等人，2007；vashishta,ohri等人，2009；elmelegy,aboulella等人，2010；chai,wu等人，2012；park,kang等人，2012；huang,liu等人，2013；salama,selem等人，2013；qi,ward等人，2014)。上述列表不旨在穷举。人组织蛋白酶d由癌细胞分泌，并显示出通过主动内吞作用被癌细胞重新内化(capony,braulke等人，1994；laurent-matha,farnoud等人，1998；benes,vetvicka等人，2008)。已被提示在受体介导的内化中起作用的机制和受体包括甘露糖-6-磷酸、ldl受体相关蛋白(lrp或lrp1)以及可能的其他物质(laurent-matha,farnoud等人，1998；herz和strickland，2001；laurent-matha,lucas等人，2002；beaujouin,prebois等人，2010；derocq,prebois等人，2012)。已经提出癌细胞中细胞内细胞器的缺陷酸化是导致在正常情况下具有细胞内定位并且不被分泌的溶酶体蛋白质异常分泌的机制之一，所述溶酶体蛋白质例如溶酶体水解酶组织蛋白酶d及其同种型(kokkonen,rivinoja等人，2004)。不希望受理论的束缚，本文所公开的抗体-药物缀合物可以利用“特洛伊木马”方法通过劫持癌细胞异常分泌的人组织蛋白酶d而进入细胞，从而实现进入的目的。从以下详细说明能够明显看出本公开的其他特征和优点。然而，应当理解，在指出本公开的优选实施方式时，详细说明和具体实例仅以例示方式给出，因为根据所述详细说明，在本公开的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言是明显的。附图简介现在将参考附图描述本公开的一个实施方式，其中：图1是这样的图，其示出了通过比色细胞增殖试验(mts)测量抗-人组织蛋白酶d、抗-人egfr和合适的同种型对照的smcc-dm1抗体-药物缀合物针对mda-mb-231乳腺癌细胞系的细胞毒性活性。imb-101-抗-人组织蛋白酶d-smcc-dm1；imb-102-抗-人组织蛋白酶d-spdb-dm4；imb-701-抗-人egfr-smcc-dm1；imb-702-抗-人egfr-spdb-dm4；imb-991-同种型匹配的单克隆-smcc-dm1；imb-992-同种型匹配的单克隆-spdb-dm4。图2是这样的图，其示出了通过比色细胞增殖试验(mts)测量抗-人组织蛋白酶d、抗-人egfr和合适的同种型对照的spdb-dm4抗体-药物缀合物针对mda-mb-231乳腺癌细胞系的细胞毒性活性。imb-101-抗-人组织蛋白酶d-smcc-dm1；imb-102-抗-人组织蛋白酶d-spdb-dm4；imb-701-抗-人egfr-smcc-dm1；imb-702-抗-人egfr-spdb-dm4；imb-991-同种型匹配的单克隆-smcc-dm1；imb-992-同种型匹配的单克隆-spdb-dm4。图3是这样的图，其示出了通过比色细胞增殖试验(mts)测量抗-人组织蛋白酶d、抗-人egfr和合适的同种型对照的smcc-dm1抗体-药物缀合物针对mcf-7乳腺癌细胞系的细胞毒性活性。imb-101-抗-人组织蛋白酶d-smcc-dm1；imb-102-抗-人组织蛋白酶d-spdb-dm4；imb-701-抗-人egfr-smcc-dm1；imb-702-抗-人egfr-spdb-dm4；imb-991-同种型匹配的单克隆-smcc-dm1；imb-992-同种型匹配的单克隆-spdb-dm4。图4是这样的图，其示出了通过比色细胞增殖试验(mts)测量抗-人组织蛋白酶d、抗-人egfr和合适的同种型对照的spdb-dm4抗体-药物缀合物针对mcf-7乳腺癌细胞系的细胞毒性活性。imb-101-抗-人组织蛋白酶d-smcc-dm1；imb-102-抗-人组织蛋白酶d-spdb-dm4；imb-701-抗-人egfr-smcc-dm1；imb-702-抗-人egfr-spdb-dm4；imb-991-同种型匹配的单克隆-smcc-dm1；imb-992-同种型匹配的单克隆-spdb-dm4。图5是这样的图，其示出了通过比色细胞增殖试验(mts)测量抗-人组织蛋白酶d和抗-人egfr的smcc-dm1抗体-药物缀合物针对正常的永生化人角化细胞细胞系hacat的细胞毒性活性。imb-101-抗-人组织蛋白酶d-smcc-dm1；imb-102-抗-人组织蛋白酶d-spdb-dm4；imb-701-抗-人egfr-smcc-dm1；imb-702-抗-人egfr-spdb-dm4；imb-991-同种型匹配的单克隆-smcc-dm1；imb-992-同种型匹配的单克隆-spdb-dm4。图6是这样的图，其示出了通过比色细胞增殖试验(mts)测量抗-人组织蛋白酶d和抗-人egfr的spdb-dm4抗体-药物缀合物针对正常的永生化人角化细胞细胞系hacat的细胞毒性活性。imb-101-抗-人组织蛋白酶d-smcc-dm1；imb-102-抗-人组织蛋白酶d-spdb-dm4；imb-701-抗-人egfr-smcc-dm1；imb-702-抗-人egfr-spdb-dm4；imb-991-同种型匹配的单克隆-smcc-dm1；imb-992-同种型匹配的单克隆-spdb-dm4。图7是这样的图，其示出了通过比色细胞增殖试验(mts)测量未缀合的(“裸的”)抗-人组织蛋白酶d抗体针对乳腺癌细胞系mcf-7和mda-mb-231的细胞毒性活性，所述测量与测量抗体-药物缀合物的活性以相同程序进行。图8是这样的图，其示出了通过比色细胞增殖试验(mts)测量抗-人组织蛋白酶d的spdb-dm4抗体-药物缀合物针对前列腺癌细胞系lncap的细胞毒性活性。imb-102-抗-人组织蛋白酶d-spdb-dm4；imb-992-同种型匹配的单克隆-spdb-dm4。图9是示出了示例性缀合物和毒性部分接头的示意图。表1总结了合成的抗体-药物缀合物及通过分光光度法测定的其近似有效载荷(药物:抗体比)的表征。表2总结了针对mcf-7、mda-mb-231和hacat细胞系检测的抗体-药物缀合物的计算的50％抑制浓度(ic50)。(数据对应于图1-6)。详细说明i.定义除非另有说明，本文所用的以下术语和短语旨在具有以下含义：当在本文中使用商品名时，申请人旨在独立地包括商品名产品制剂、通用名药和商品名产品的活性药物成分。本文所用的术语“人组织蛋白酶d”是指包含人(homosapiens)ctsd基因(也称为cpsd、cln10和hel-s-130p)的表达形式(包括组织蛋白酶d酶原)和加工形式的任何蛋白质，其中所述蛋白质被命名为uniprotkb/swiss-protp07339(ncbi参考序列：np_001900.1，成熟肽对应于氨基酸残基65-412)。本文所用的术语“组织蛋白酶d”可以指野生型蛋白质及其所有天然存在的变体，包括组织蛋白酶d酶原(uniprotkb/swiss-protp07339和ncbi参考序列：np_001900.1，氨基酸残基19-412)和组织蛋白酶d酶原前体(pre-pro-cathepsind)(uniprotkb/swiss-protp07339和ncbi参考序列：np_001900.1，氨基酸残基1-412)和所有转录变体、翻译后修饰变体(人组织蛋白酶d的已知翻译后修饰被描述为uniprotkb/swiss-protp07339中的记录的一部分)和人组织蛋白酶d的加工形式，包括但不限于组织蛋白酶d轻链(uniprotkb/swiss-protp07339和ncbi参考序列：np_001900.1，氨基酸残基65-161)、组织蛋白酶d重链(uniprotkb/swiss-protp07339和ncbi参考序列：np_001900.1，氨基酸残基169-412)和组织蛋白酶d激活肽(uniprotkb/swiss-protp07339和ncbi参考序列：np_001900.1，氨基酸残基19-64)，而不管是否有催化活性。本文所用的术语“癌细胞”是指来自或源自癌症(包括癌细胞系)的细胞，并且其在受试者中是恶性的，瘤性的和/或能够引起癌症。例如，包括为肿瘤的一部分的细胞、能够引起肿瘤的癌细胞和处于进行性恶性状态的细胞。本文所用的术语“正常细胞”是指非癌性、非恶性的细胞，包括健康细胞(例如在对正常细胞和癌细胞进行比较的方法中与癌细胞的类型或谱系相同)，并且可以包括例如永生化细胞或永生细胞，如果预期此类细胞不会在健康受试者中引起疾病或癌症的话。本文所用的术语“细胞内”是指在正常条件下在亚细胞区室之一内发现的蛋白质，例如内吞的蛋白质、核蛋白质或线粒体蛋白质，或存在于细胞质中的非区室化的(non-compartmentalized)蛋白质。本文所用的术语“靶抗原”是指指示体内存在癌症，和/或由癌细胞优先表达或过表达并由癌细胞分泌或特异性分泌的的物质，任选是蛋白质。其包括但不限于肿瘤抗原。本文所用的术语“肿瘤抗原”是指由肿瘤细胞产生的物质，任选是蛋白质，包括“肿瘤相关抗原”或“taa”(其是指在肿瘤细胞中产生的且与相应的正常组织相比在癌症中差异表达的蛋白质)以及“肿瘤特异性抗原”或“tsa”(其是指在肿瘤细胞中产生的且与相应的正常组织相比在癌症中特异性表达或异常表达的肿瘤抗原)。本文所用的术语“由癌细胞特异性分泌”是指癌细胞比其非癌前体分泌的蛋白质的量增加至少25％、50％、75％或100％。人组织蛋白酶d、组织蛋白酶d酶原和所有同种型的抗体可从许多来源商购获得，包括例如来自r&dsystems,明尼阿波利斯,mn,usa的mab1014克隆#185111和来自abnova,台北,台湾的克隆3f12-1b9。组织蛋白酶d(包括组织蛋白酶d酶原以及所有同种型)的另一些抗体可从marcelgarcia博士(institutdesbiomoléculesmaxmousseron(ibmm),法国)获得，包括例如m1g8克隆(laurent-matha等人，1998；garcia等人，1985)。本文所用的术语“多肽”或“蛋白质”是指包含氨基酸残基(例如天然存在的残基和/或非天然存在的残基)的分子，包括例如单链多肽，以及多链蛋白的单链，多链蛋白例如传统抗体，重组多肽包括例如融合蛋白，标签化蛋白，突变蛋白和全长蛋白的片段(通常为活性片段)。蛋白质和多肽在本文中可互换使用。本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)键组成的连接的一系列核苷或核苷酸单体，包括例如cdna、载体和重组多核苷酸。该术语还包括包含非天然存在的单体或其部分的修饰的或取代的序列，其类似地发挥作用。由于诸如增强的细胞摄取或在核酸酶存在下增加的稳定性的性质，这种修饰的或取代的核酸分子可以相对于天然存在的形式是优选的。该术语还包括含有两个或更多个化学上不同的区域的嵌合核酸分子。例如，嵌合核酸分子可以含有至少一个赋予有益性质(例如提高的核酸酶抗性，增加的摄取到细胞)的修饰的核苷酸区域，或者两个或更多个本文所述的核酸分子可以连接以形成嵌合核酸分子。多核苷酸可以是脱氧核糖核酸序列(dna)或核糖核酸序列(rna)，可以包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。序列还可以含有修饰的碱基。这种修饰的碱基的实例包括氮杂和去氮腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。此外，术语“核酸”可以是双链的或单链的，代表有义链或反义链。此外，术语“核酸”包括互补核酸序列。本文所用的术语“靶向剂”是指任何结合蛋白，包括抗体、亲和体(affimer)和受体，任何核酸，例如dna、rna或特异性结合靶抗原的适配体。术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何上述的抗体片段，只要它们展示出期望的生物活性即可(miller等人(2003)jour.ofimmunology170:4854-4861)以及嵌合抗体，包括例如人源化抗体。抗体可以是鼠的、人的、人源化的、嵌合的或源自其他物种。人抗体可以例如从噬菌体展示文库中分离。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特异性结合感兴趣靶标或其部分的抗原的抗原结合位点的分子。本文公开的免疫球蛋白可以是任何类型(例如igg、ige、igm、igd和iga)、种类(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白可以来源于任何物种。然而，一方面，免疫球蛋白是人源的、鼠源的或兔源的。抗体可以来自重组来源和/或在转基因动物中产生。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双抗体；线性抗体；通过fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗id)抗体，cdr(互补决定区)，以及免疫特异性结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的任何上述的表位结合片段，单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。可以使用常规技术使抗体片段化。例如，可以通过用胃蛋白酶处理抗体来产生f(ab')2片段。可以处理所得的f(ab')2片段来减少二硫键以产生fab'片段。木瓜蛋白酶消化可导致fab片段的形成。fab、fab'和f(ab')2、scfv、dsfv、ds-scfv、二聚体、微抗体、双抗体、双特异性抗体片段和其他片段也可以通过重组技术合成。抗体片段意指结合片段。本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能的天然突变之外，该群体包含的单个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们可以不被其他抗体污染地合成。修饰语“单克隆”表示抗体从基本上同质的抗体群体获得的特征，不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本公开要使用的单克隆抗体可以通过kohler等人(1975)nature256:495首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组dna方法制备(参见美国专利no.4,816,567，通过引用并入本文)。也可以使用例如clackson等人(1991)nature,352:624-628；marks等人(1991)j.mol.biol.,222:581-597(两者都通过引用并入本文)中所述的技术从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。本文中的抗体特别包括“嵌合”抗体，包括人源化抗体和嵌合单克隆抗体，其中重链和/或轻链的部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展示出期望的生物活性即可(美国专利no.4,816,567；和morrison等人(1984)proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855，各参考文献均通过引用并入)。本文中的感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化(primatized)”抗体，其包含源自非人灵长类(例如旧大陆猴或猿)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。本文中的“完整抗体”是包含vl和vh结构域，以及轻链恒定结构域(cl)和重链恒定结构域ch1、ch2和ch3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可以具有一种或更多种“效应子功能”，其是指可归因于抗体的fc区(天然序列fc区或氨基酸序列变体fc区)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括clq结合；补体依赖性细胞毒性；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬作用；以及细胞表面受体(例如b细胞受体和bcr)的下调。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“fab”片段，每个片段都具有单个抗原结合位点；和残留的“fc”片段，其名称反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并仍然能够交联抗原的f(ab′)2片段。“fv”是含有完全的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在这种构型中，每个可变结构域的三个高变区相互作用以限定vh-vl二聚体表面上的抗原结合位点。总之，六个高变区赋予抗体抗原结合特异性。然而，即便单个可变结构域(或包含仅三个对抗原特异的高变区的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管比完整结合位点的亲和力低。fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。fab'片段与fab片段的差异在于：在重链ch1结构域的羧基末端添加几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或更多个半胱氨酸。fab'-sh在本文中表示其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有至少一个游离巯基的fab'。f(ab′)2抗体片段最初作为成对的fab'片段产生，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而归属于两种明显不同的类型(称为κ和λ)之一。“单链fv”或“scfv”是指包含抗体的vh和vl结构域的单链可变区抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。fv多肽可以进一步包含介于vh和vl结构域之间的多肽接头，其使得scfv能够形成用于抗原结合的期望结构(plückthun，thepharmacologyofmonoclonalantibodies，第113卷，rosenburg和moore编，springer-verlag，newyork，第269-315页(1994)。抗-erbb2抗体scfv片段描述于wo93/16185；美国专利no.5,571,894；美国专利no.5,587,458中。术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中片段包含与同一多肽链(vh-vl)中的可变轻结构域(vl)连接的可变重结构域(vh)。通过使用太短而不允许同一链上两个结构域之间配对的接头，所述结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体更充分地描述于例如ep404,097；wo93/11161；和hollinger等人(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448。“人源化”形式的非人(例如啮齿类动物)抗体是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体大部分是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)的高变区的残基代替，所述非人物种例如小鼠，大鼠，兔或具有期望的特异性、亲和力和能力的非人灵长类动物。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(fr)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可包含在接受者抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体包含基本上所有的至少一个且通常为两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的fr是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见jones等人(1986)nature,321:522-525；riechmann等人(1988)nature332:323-329；和presta,(1992)curr.op.struct.biol.,2:593-596。靶向剂，例如“特异性结合”感兴趣靶抗原(例如组织蛋白酶d抗原)的抗体，是能够以10-5m(10000nm)或更低(例如，10-6m、10-7m、10-8m、10-9m、10-10m、10-11m、10-12m或更低)的kd结合抗原的靶向剂。当抗体是结合组织蛋白酶d的抗体时，其通常以相对于其他组织蛋白酶家族成员例如至少2×、3×、5×或更高的特异性优先结合组织蛋白酶d，并且其可以是不与其他蛋白质显著交叉反应的抗体。例如，在一些实施方式中，通过荧光激活细胞分选(facs)分析或放射免疫沉淀(ria)测定时，抗体与这些其它蛋白质结合的程度(例如与内源性受体的细胞表面结合)小于10％。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防或防御措施二者，其中目标是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或疾病，例如癌症的发生或扩散。为了本公开的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻，疾病程度的降低，疾病状态的稳定(即不恶化)，疾病进展的延迟或减缓，疾病状态的改善或缓和，以及缓解(不管是部分还是全部)，不管是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可以表示：与如果没有接受治疗的预期的生存期相比，延长生存期。需要治疗的包括已经患有病症或疾病的，以及倾向于患病症或疾病的或者要预防病症或疾病的。术语“治疗有效量”是指有效治疗哺乳动物中的疾病或病症的缀合物的量。在癌症的情况下，缀合物的治疗有效量可以：(i)减少癌细胞的数量；(ii)减少肿瘤尺寸；(iii)抑制、延迟、减缓到一定程度，优选地阻止癌细胞浸润到外周器官中；(iv)抑制(即，减缓到一定程度，优选地阻止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；和/或(vi)在一定程度上缓解一种或更多种与癌症相关的症状。在缀合物可以预防癌细胞生长和/或杀灭现有癌细胞的程度上，它可以是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。在动物模型中，可以通过在施用缀合物(任选的adc)之后的过程中物理测量肿瘤以及通过测定肿瘤的部分缓解和完全缓解来评估功效。对于癌症疗法，例如可以通过评估疾病进展时间(ttp)和/或测定反应率(rr)来测量功效。术语“癌症”和“癌性”是指或描述了通常以不受调节的细胞生长为特征的哺乳动物的生理状况。“肿瘤”包含一个或更多个癌性细胞。癌症的实例包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这种癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“nsclc”)、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌、胃肠道间质瘤(gist))、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛癌、阴茎癌以及头颈癌。已证明过表达和/或分泌组织蛋白酶d或组织蛋白酶d酶原的癌症包括但不限于乳腺癌、三阴性乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌(nsclc)、肝细胞癌(hcc)、头颈鳞状细胞癌(hnscc)、膀胱癌、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤(gbm)、小细胞肺癌、子宫内膜癌、黑素瘤和肾细胞癌。“过表达”靶抗原(例如，组织蛋白酶d)的癌症是与相同组织类型的非癌细胞相比具有显著更高水平的蛋白质(例如，组织蛋白酶d)的癌症。这种过表达可由基因扩增或由增加的转录或翻译引起。可以在治疗前评估靶抗原的过表达。例如，可以在诊断试验或预后试验中通过评估细胞内或循环中存在的组织蛋白酶d蛋白质的增加水平(例如通过免疫组织化学试验；ihc)来确定组织蛋白酶d过表达。或者或另外，可以测量细胞中编码组织蛋白酶d的核酸的水平，例如通过荧光原位杂交(fish；参见wo98/45479)，southern印迹或聚合酶链反应(pcr)技术，例如实时定量pcr(rt-pcr)。还可以通过测量诸如血清的生物流体中的流出抗原(shedantigen)(例如，组织蛋白酶d或组织蛋白酶d酶原)来研究组织蛋白酶d过表达(参见例如美国专利no.4,933,294；wo91/05264；美国专利no5,401,638)。除了上述试验之外，本领域技术人员可利用各种其它体内试验。例如，可以将患者体内的细胞暴露于任选地用可检测标记(例如诊断性放射性同位素)标记的抗体，并且可以评估患者中细胞与抗体的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自患者的活检来实现。本文所用的术语“细胞毒性部分”是指引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如，211at、131i、125i、90y、186re、188re、153sm、212bi、32p、60c和lu的放射性同位素)，化学治疗剂和毒素例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括蓖麻毒素，相思豆毒素，蒴莲根毒素(modeccin)，槲寄生素(viscumin)，细菌毒素蛋白例如霍乱毒素，大肠杆菌热不稳定毒素，百日咳毒素，破伤风毒素，肉毒杆菌毒素，假单胞菌毒素，志贺氏菌毒素和白喉毒素(该列表是非穷举性的)，包括合成类似物及其衍生物，包括类美登素(maytansinoid)，澳瑞他汀(auristatin)，卡奇霉素(calicheamicin)，倍癌霉素(duocarmycin)，pdb二聚体和α-鹅膏素(alpha-amanitin)药物部分。“类美登素药物部分”是指具有美登素化合物或其衍生物或类似物的结构的靶向剂-药物缀合物的细胞毒性部分。美登素最早是从东非灌木maytenusserrata中分离出的(美国专利no.3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生类美登素，例如美登醇和c-3美登醇酯(美国专利no.4,151,042)。已经报道了合成的美登醇和美登醇类似物。参见美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663和4,371,533，以及kawai等人(1984)chem.pharm.bull.3441-3451)，上述文献均明确地通过引用并入。“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括厄洛替尼(erlotinib)(genentech/osipharm.)，硼替佐米(bortezomib)(milleniumpharm.)，氟维司群(fulvestrant)(astrazeneca)，舒尼替尼(sunitinib)(su11248,pfizer)，来曲唑(letrozole)(novartis)，甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)(novartis)，ptk787/zk222584(novartis)，奥沙利铂(oxaliplatin)(sanofi)，5-fu(5-氟尿嘧啶)，甲酰四氢叶酸(leucovorin)，雷帕霉素(rapamycin)(sirolimus,wyeth)，拉帕替尼(lapatinib)(gsk572016,glaxosmithkline)，洛那法尼(lonafarnib)(sch66336)，索拉非尼(sorafenib)(bay43-9006,bayerlabs.)和吉非替尼(gefitinib)(astrazeneca)，ag1478，ag1571(su5271；sugen)，烷化剂例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡；氮丙啶例如苯并多巴(benzodopa)、卡泊醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenins)(特别是泡番荔枝辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；海绵他汀(callystatin)；cc-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycins)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，kw-2189和cb1-tm1)；,刺五加素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮介(mechlorethamineoxidehydrochloride)、马法兰(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝脲类(nitrosureas)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，特别是卡奇霉素γ1i和卡奇霉素ωi1(angewchem.intl.ed.engl.(1994)33:183-186)；dynemicin，包括dynemicina；二膦酸盐，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)，以及新抑癌蛋白发色团和相关的发色蛋白烯二炔抗生素发色团)，阿克拉霉素(aclacinomysins)，放线菌素，安曲霉素(authramycin)，重氮丝氨酸，博莱霉素，放线菌素c(cactinomycin)，carabicin，caminomycin，嗜癌菌素(carzinophilin)，色霉素(chromomycinis)，更生霉素(dactinomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸，阿霉素(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉-阿霉素和脱氧阿霉素)，表柔比星，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素例如丝裂霉素c，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素(olivomycins)，匹来霉素(peplomycin)，泊非霉素(potfiromycin)，嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链霉黑素(streptonigrin)，链脲菌素(streptozocin)，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，例如二甲叶酸，甲氨蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物例如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如环胞苷(ancitabine)，阿扎胞苷，6-氮杂尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷；雄激素例如卡普睾酮(calusterone)，屈他雄酮丙酸酯(dromostanolonepropionate)，环硫雄醇，美雄烷(mepitiostane)，睾内酯；抗肾上腺类例如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂例如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶；比曲比新(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地佛法明(defofamine)；脱羰秋水仙碱；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵；埃博霉素(epothilone)；乙环氧啶(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；类美登素例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；硝氨丙吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；多糖复合物(jhsnaturalproducts,eugene,oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是t-2毒素、抚抱菌素a(verracurina)、杆孢菌素a(roridina)和蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；氮烯唑胺(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌血生；加西托新(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“ara-c”)；环磷酰胺；塞替派(thiotepa)；紫杉烷类，例如紫杉醇(bristol-myerssquibboncology,princeton,n.j.)，abraxanetm不含克列莫佛，紫杉醇的白蛋白工程纳米颗粒制剂(americanpharmaceuticalpartners,schaumberg,ill.)和多西他赛(-poulencrorer,antony,france)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物例如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨(vinorelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；cpt-11；拓扑异构酶抑制剂rfs2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylomithine)(dmfo)；类视黄醇例如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)(roche)；以及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。本文所用的术语“接头”是指包含或源自共价连接到靶向剂(例如抗体)并且还共价连接到细胞毒性部分的原子组的化学部分。接头包括包含或源自二价自由基的化合物，例如亚烷基，亚芳基，亚杂芳基，部分例如：—(cr2)no(cr2)n—，其中r2独立地为烷氧基(例如聚亚乙基氧基、peg、聚亚甲基氧基)和烷基氨基(例如聚亚乙基氨基、聚醚胺诸如jeffaminetm)的重复单元，且n独立地≥1，特别地n可以是1至15；包括实施例1中所述接头的化合物，n-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(smcc)和n-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(spdb)；以及二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺，以及肽，例如但不限于具有一个或更多个赖氨酸残基或用于连接到靶向剂和细胞毒性部分的其他合适化学基团的g、a和c的重复单元(例如多达10个)。接头任选是c1-30亚烷基，未被取代或被一个或更多个取代基取代，和/或任选地被一个或更多个独立地选自o、s、nr1的杂部分(heteromoieties)中断，和/或任选地被一个或更多个c(o)和c(s)中断，其中r1独立地选自h和c1-6烷基。接头可包含不可切割的单元(稳定接头)或可切割的单元(不稳定接头)，例如肽键或二硫键。接头可通过反应性官能团缀合到靶向剂和/或细胞毒性部分。本文所用的术语“烷基”，无论是单独使用还是作为另一基团的一部分使用，均指直链或支链饱和烷基。提及的烷基中可能的碳原子数用数字前缀“cn1-n2”来表示。例如，术语c1-6烷基是指具有1、2、3、4、5或6个碳原子的烷基。本文所用的术语“亚烷基”，无论是单独使用还是作为另一基团的一部分使用，均指直链或支链饱和亚烷基；即其两端具有取代基的饱和碳链。提及的亚烷基中可能的碳原子数用数字前缀“cn1-n2”来表示。例如，术语c4-20亚烷基是指具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的亚烷基。本文所用的术语“受试者”包括动物界的所有成员，包括哺乳动物，并且适当地指人。本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括基本上化学惰性且无毒的组合物，其不干扰药物组合物的生物活性的有效性。合适的药物载体的实例包括但不限于水、盐水溶液、甘油溶液、乙醇、n-(1(2,3-二油烯基氧基)丙基)n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)和脂质体。这类组合物应该含有治疗有效量的缀合物和适量的载体，以提供直接施用到受试者的形式。在理解本公开的范围时，本文所用的术语“包括”及其派生词旨在是开放式术语，其指定所述特征、要素、组分、组、整体和/或步骤的存在，但不排除存在其他未陈述的特征、要素、组分、组、整体和/或步骤。上述内容也适用于具有类似含义的词语，例如术语“包含”、“具有”及其派生词。本文所用的术语“由……组成”及其派生词旨在是封闭式术语，其指定所述特征、要素、组分、组、整体和/或步骤的存在，并且还排除其他未陈述的特征、要素、组分、组、整体和/或步骤的存在。此外，本文所用的程度术语(诸如“基本上”、“约”和“近似”)表示被修饰术语的合理量的偏差，使得最终结果不会显著改变。这些程度术语应被解释为包括被修饰术语的至少±5％的偏差，条件是该偏差不会否定其修饰的词语的含义。更特别地，术语“约”表示加或减所提及数字的0.1-50％、5-50％、或10-40％、10-20％、10％-15％、优选5-10％、最优选约5％。在本说明书和所附权利要求中使用时，除非上下文另有明确规定，否则不使用数量词修饰时包括复数提及物。因此，例如，含有“化合物”的组合物包括两种或更多种化合物的混合物。还应该指出的是，除非上下文另有明确规定，否则术语“或”通常以包括“和/或”的含义使用。在特定部分中描述的定义和实施方式旨在适用于本领域技术人员理解的适合的本文所描述的其它实施方式。本文中通过端点叙述的数值范围包括包含在该范围内的所有数字和分数(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。还应当理解，所有数字及其分数都推定为用术语“约”来修饰。此外，在特定部分中描述的定义和实施方式旨在适用于本领域技术人员理解的适合的本文所描述的其它实施方式。例如，在以下段落中，更详细地说明了本发明的不同方面。ii.缀合物和方法因此，一方面，本公开提供了一种缀合物，所述缀合物包含：a.靶向剂，其特异性结合非跨膜靶抗原，其中所述靶抗原由癌细胞分泌；b.细胞毒性部分，其任选地与所述靶向剂直接或间接连接；c.和任选地，连接所述靶向剂和细胞毒性部分的接头。在某些实施方式中，靶抗原利用抗体-药物缀合物所结合的靶抗原的主动的、受体介导的重新内化。在一个实施方式中，提供了缀合物，其包含靶向剂、细胞毒性部分和任选地连接靶向剂和细胞毒性部分的接头。靶向剂是特异性结合非跨膜靶抗原的实体，其中靶抗原由癌细胞分泌。在一个实施方式中，靶向剂是特异性结合靶抗原的结合蛋白。在一个优选的实施方式中，缀合物是抗体-药物缀合物。在另一个实施方式中，靶向剂特异性结合为肿瘤抗原的蛋白质靶抗原。在一个实施方式中，靶抗原是细胞内蛋白。在另一个实施方式中，靶抗原是内吞蛋白或溶酶体蛋白。在另一个实施方式中，靶抗原由癌细胞特异性分泌。分泌的靶抗原可保持与癌细胞相关联。分泌的靶抗原可以通过一种或更多种机制(包括内吞作用、胞饮作用)被细胞内化或重新内化，和/或通过受体介导的内吞作用主动内化。在一个实施方式中，内化靶抗原的癌细胞多于正常细胞。在另一个实施方式中，靶抗原被癌细胞内化，而不被正常细胞内化。例如，血清中可检测到的组织蛋白酶d的量可从低ng/ml范围到更低的浓度而异。相比之下，由肿瘤分泌或发现在肿瘤中积累的组织蛋白酶d的量被证明高达每mg肿瘤组织ug水平的组织蛋白酶d(capony等，1989)。已经报道了一些癌症过表达和/或分泌组织蛋白酶e，例如胃癌或胰腺癌。溶酶体天冬氨酸蛋白酶包括例如人组织蛋白酶d和人组织蛋白酶e。在一个实施方式中，靶抗原是溶酶体蛋白。在一个实施方式中，靶抗原是天冬氨酰溶酶体酶。在一个实施方式中，靶抗原是人组织蛋白酶d或人组织蛋白酶e。在另一个实施方式中，靶抗原是人组织蛋白酶d。在另一个实施方式中，靶抗原是或包括人组织蛋白酶d酶原(例如，其中靶向剂特异性结合肽原区域的19-64位氨基酸内的表位)。在另一个实施方式中，靶抗原是或包括人组织蛋白酶d重链(特别地，169-412位氨基酸内的表位)。在另一个实施方式中，靶抗原是或包括人组织蛋白酶d轻链(特别地，65-161位氨基酸内的表位)。在一个实施方式中，缀合物结合组织蛋白酶d受体(例如甘露糖-6-磷酸酯(m6p)受体、lrp1或分拣蛋白)所结合的区域之外的人组织蛋白酶d的表位。在一个实施方式中，缀合物(例如经由其靶向剂部分)结合不包括氨基酸asn70和/或asn199的组织蛋白酶d中的表位，氨基酸asn70和/或asn199是可以用甘露糖-6-磷酸修饰并且参与甘露糖6磷酸受体内化的氨基酸。在一个实施方式中，缀合物结合不包括asn70和/或asn199周围的残基(例如asn70和/或asn199的n末端和/或c末端的至多3个氨基酸)的表位。在另一个实施方式中，靶抗原选自组织蛋白酶a、组织蛋白酶b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、组织蛋白酶f、组织蛋白酶g、组织蛋白酶h、组织蛋白酶k、组织蛋白酶l1、组织蛋白酶l2、组织蛋白酶o、组织蛋白酶s、组织蛋白酶w、组织蛋白酶z、载脂蛋白e(apoe)、脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶、组织纤溶酶原激活物(tpa)、尿型纤溶酶原激活物(upa)、ixa因子、viiia因子、viia/tfpi因子、基质金属蛋白酶(mmp)(例如，mmp-13、mmp-9)、鞘脂激活蛋白(sap)、妊娠带蛋白、α-2-巨球蛋白(α2m)、补体c3、纤溶酶原激活物抑制剂-1(pai-1)、c1抑制剂、抗凝血酶iii、组织因子途径抑制剂(tfpi)、肝素辅因子ii、α1-抗胰蛋白酶、淀粉样前体蛋白(app)、血小板反应蛋白-1、血小板反应蛋白-2、乳铁蛋白、ras相关蛋白(rap)和热休克蛋白-96(hsp-96)。在一个实施方式中，缀合物通过表位结合肿瘤抗原以形成能够内化到细胞中的复合物。这可以例如在重新内化试验中测定。实施例4提供了一个实例。靶抗原的靶向剂(例如针对特定靶抗原的抗体)可以与ph响应性荧光标签(例如phrodored标签)缀合，ph响应性荧光标签是ph敏感性染料，其光谱(荧光)性质响应于ph降低而变化。这可以通过如下来实现：使用phrodored琥珀酰亚胺基(nhs)酯试剂(molecularprobes,lifetechnologies,carlsbad,ca,us)，使该试剂与靶向剂接触，然后通过除去未反应的标签来纯化phrodored-缀合物。之后，可以将phrodored-缀合物加入到已知分泌靶抗原的培养细胞(例如在组织蛋白酶d的情况下的mcf-7细胞)中，孵育，并且可以测量560nm处培养物的荧光，以确定phrodored-缀合物内化的程度。在将含染料的缀合物内化到细胞中并暴露于低ph内体和溶酶体细胞内区室时，染料在560nm范围内的荧光放射增加。因此，通过测量细胞培养物中560nm范围内的荧光增加，可以相对定量phrodored-缀合物内化的程度。这可以用多模式板读取器或流式细胞术来评估。在另一个实施方式中，缀合物还包含细胞穿透肽(cpp)以增加其到细胞的内化。例如，称为tat肽(氨基酸序列为grkkrrqrrrpq)的人免疫缺陷病毒(hiv)衍生的tat蛋白的细胞穿透部分。另一个实例是cady细胞穿透肽(氨基酸序列为乙酰基-glwralwrllrslwrllwra-半胱胺)。在一个实施方式中，cpp与靶蛋白或其任何亚基的c末端框内融合。在缀合物包含接头的实施方式中，接头可以是稳定的或不稳定的。在一个实施方式中，稳定接头是n-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(smcc)或其衍生物。在另一个实施方式中，不稳定接头是n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)或其衍生物。在另一个实施方式中，不稳定接头是n-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(spdb)。例如可以通过还原剂例如在细胞胞质溶胶中发现的还原剂或细胞中的酶的作用来切割所述不稳定接头。在一些实施方式中，不稳定接头可产生增强的功效，例如其中内化导致缀合物循环到细胞表面或内化后将缀合物运送到溶酶体区室失败的情况。例如，接头可以包含大分子，例如包含酶切割位点(例如肽大分子的蛋白酶切割位点)的肽。例如，接头可以是二肽接头，例如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)或苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)接头。在该实施方式的一个方面，不稳定接头是自我毁灭的接头。例如，接头可以包含对-氨基苄氧基羰基(pab)部分或其衍生物。在该实施方式的一个方面，不稳定接头为可在细胞内切割的，例如取决于ph、还原剂、存在于细胞内的酶或存在于细胞内区室(例如溶酶体)内的酶等可切割。在一个实施方式中，接头可以来源于选自以下的交联试剂：n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)、n-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(spp)、n-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(spdb)、n-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基-丁酸酯(磺基-spdb)、n-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(sia)、n-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(siab)、n-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(sba)、n-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(sbap)、马来酰亚胺pegnhs、n-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(smcc)、n-琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸酯)(lc-smcc)、n-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(磺基-smcc)或2,5-二氧代吡咯烷-1-基17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸酯(cxi-1)、k-马来酰亚胺基十一烷酸n-琥珀酰亚胺酯(kmua)、γ-马来酰亚胺丁酸n-琥珀酰亚胺酯(gmbs)、ε-马来酰亚胺己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(emcs)、m-马来酰亚胺苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯(mbs)、n-(a-马来酰亚氨基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(amas)、琥珀酰亚胺基-6-(p-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(smph)、n-琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(smpb)或n-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(pmpi)。在一个实施方式中，缀合物包含选自以下的细胞毒性部分：微管稳定剂、微管去稳定剂、澳瑞他汀(auristatin)、海兔毒素(dolastatin)、类美登素、微管蛋白裂解素(tubulysin)、念珠藻素(cryptophycins)、甲硫氨酸氨基肽酶、卡奇霉素、核输出蛋白crm1抑制剂、dppiv抑制剂、蛋白酶体抑制剂、磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、cdk2抑制剂、cdk9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、hdac抑制剂、dna损伤剂、dna烷基化剂、dna嵌入剂、dna小沟结合剂、dhfr抑制剂、促凋亡剂、bcl2抑制剂、mcl1抑制剂、hsp90抑制剂、iap抑制剂和mtor抑制剂、n(2')-脱乙酰基-n(2')-(3-巯基-l-氧代丙基)-美登素(dm1)或n(2')-脱乙酰基-n2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(dm4)。在一些优选的实施方式中，缀合物包含n-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(spdb)接头和n(2')-脱乙酰基-n2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(dm4)细胞毒性部分，称为spdb-dm4。smcc接头特别用于产生细胞毒性部分与靶向剂如抗体的稳定连接。在另一些优选的实施方式中，缀合物包含n-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(smcc)接头和n(2')-脱乙酰基-n(2')-(3-巯基-l-氧代丙基)-美登素(dm1)缀合物，称为smcc-dm1。dm1和dm4细胞毒性部分基于天然分子美登素的复杂结构。保留细胞毒素活性的类美登素的几种形式是有用的。在一些优选的实施方式中，接头与细胞毒性部分的化学计量为1:1。在一些优选的实施方式中，接头和细胞毒性部分与靶向剂(例如抗体)的化学计量介于1-20分子的接头和细胞毒性部分：1分子的靶向剂(例如抗体)之间。在一个实施方式中，靶向剂选自结合蛋白和核酸，例如dna、rna或适配体。在该实施方式的一个方面，结合蛋白选自抗体、亲和体和受体。在该实施方式的一个方面，结合蛋白是抗体，其中抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链fv(scfv)、纳米抗体、单结构域抗体(sdab)和抗体片段例如fab片段和f(ab’)2片段。在一个优选的实施方式中，靶向剂是单克隆抗体，任选地嵌合单克隆抗体。在另一个实施方式中，对于其中细胞毒性部分是蛋白质毒素的缀合物和/或对于包含蛋白质接头的缀合物，还提供了编码所述缀合物或其部分(例如，靶向剂(例如结合蛋白或抗体)和接头，接头和蛋白质细胞毒性部分)的核酸。在另一方面，还提供了组合物，其包含本文所述缀合物或编码所述缀合物或其部分的核酸，任选地与载体、稀释剂或赋形剂组合。在一个实施方式中，载体、稀释剂或赋形剂是药学上可接受的。在一些实施方式中，组合物适用于静脉内施用、肌内施用、皮下施用、肠胃外施用、脊髓施用或表皮施用。在一个实施方式中，组合物是药物组合物。另一方面包括将细胞毒素选择性递送至癌细胞的方法，所述方法包括使细胞与本文所述缀合物或包含所述缀合物的组合物接触。还提供了缀合物和包含所述缀合物的组合物用于将细胞毒素选择性递送至癌细胞的用途。在一个实施方式中，要靶向的癌细胞在受试者中，并且通过向有此需要的受试者施用所述缀合物或组合物来接触细胞。在另一方面，还提供了治疗癌症的方法或用途。因此，在一个实施方式中，治疗癌症的方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述缀合物或包含所述缀合物的组合物。在一个实施方式中，向有此需要的受试者施用缀合物或包含缀合物的组合物，任选与另一种治疗剂组合。在一个实施方式中，提供了治疗癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用所述缀合物。在一个方面，所述方法包括将缀合物选择性递送至癌细胞，包括：向受试者全身或局部施用缀合物；其中所述受试者包含分泌靶抗原的癌细胞，和不分泌或与所述癌细胞相比较少分泌所述靶抗原的正常细胞；并且其中所述癌细胞内化所述靶抗原:缀合物复合体。在该实施方式的一个方面，受试者是人。在一方面，受试者具有转移。在一个实施方式中，向受试者施用每千克体重受试者1μg/kg至20mg/kg(0.001-20mg/kg剂量)的缀合物，任选地通过一次或更多次分开施用或通过连续输注进行。其他剂量方案可以是有用的。例如，施用单次大剂量，然后施用多次较低的维持剂量。对于重复施用，治疗施用持续至达到期望水平的癌症或相关症状的抑制。在该实施方式的一个方面，通过注射施用缀合物。在该实施方式的一个方面，癌症是实体肿瘤。在某些方面，癌症选自乳腺癌、三阴性乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、非小细胞肺癌(nsclc)、肝细胞癌(hcc)、头颈鳞状细胞癌(hnscc)、膀胱癌、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤(gbm)、小细胞肺癌、黑素瘤或肾细胞癌。在一方面，癌症是乳腺癌。在另一方面，癌症是三阴性乳腺癌。在另一个实施方式中，提供了制备抗体-药物缀合物的方法，所述方法包括：a.使靶向剂与接头前体试剂反应以形成包含1至20个接头分子的靶向剂-接头缀合物；b.使所述靶向剂-接头缀合物与细胞毒性部分反应以形成缀合物，所述缀合物包含1-20分子的所述细胞毒性部分；或者a.使所述细胞毒性部分与接头前体试剂反应以形成接头-细胞毒性部分缀合物；b.使所述接头-细胞毒性部分缀合物与靶向剂反应以形成缀合物，所述缀合物包含1至20个接头-细胞毒性部分分子。在一个实施方式中，通过胃肠外施用有效量的缀合物来提供使用缀合物的方法。合适的施用途径包括静脉内、皮下、肌内、颅内、眶内、心室内、囊内、脊柱内、脑池内、腹膜内、鼻内、经气雾剂、经眼睛、经肺和经口。在一些实施方式中，提供了药物组合物，所述药物组合物包含有效量的缀合物，其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。缀合物可以以单位剂型施用，合适的剂型为例如10mg、50mg、100mg、200mg、300mg和500mg。药物可以以1到多达20mg/ml的浓度配制在单次使用的小瓶中。合适的载剂包括例如盐水。在另一个实施方式中，提供了选择作为靶抗原的癌症生物标志物以制备缀合物的方法，所述方法包括：a.检测非癌细胞的候选抗原以确定其是否是细胞内的和/或在正常情况下不由非癌细胞分泌；b.检测癌细胞的候选抗原以确定其是否由癌细胞分泌；c.如果癌细胞以大于非癌细胞的量分泌所述靶抗原，则检测癌细胞的候选抗原以确定其是否能被癌细胞重新内化；和d.将癌细胞以大于非癌细胞的量分泌且能被癌细胞重新内化的靶抗原鉴定为候选靶细胞内肿瘤抗原。可以使用标准的现有生物化学和分子生物学技术来确定抗原是否在细胞内、被分泌和被细胞内化，例如流式细胞术、western印迹和其他免疫学检测方法。在一个实施方式中，将步骤a)所述的非癌细胞和步骤b)所述的癌细胞各自在培养基中培养一段时间，并测量各自的培养基的靶抗原水平。在一个实施方式中，使用质谱法来测量靶抗原的水平。在另一个实施方式中，提供了与缀合物的蛋白质靶标结合的诊断试剂。在一个方面，诊断试剂包含缀合物的靶向剂。在另一方面，基于缀合物的蛋白质靶标提供了配套诊断试剂盒。在一个实施方式中，抗体-药物缀合物靶抗原可以包括(非穷尽性地)组织蛋白酶，例如组织蛋白酶d、apoe、脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶、tpa、upa、ixa因子、viiia因子、viia因子/tfpi、mmp(例如，mmp-13、mmp-9)、鞘脂激活蛋白(sap)、妊娠带蛋白、α2m、补体c3、pai-1、c1抑制剂、抗凝血酶iii、tfpi、肝素辅因子ii、α1-抗胰蛋白酶、app、血小板反应蛋白-1、血小板反应蛋白-2、乳铁蛋白、rap、hsp-96(herz和strickland，2001)。在一个实施方式中，抗体-药物缀合物可以含有细胞穿透肽(cpp)以增强其内化到细胞内的能力。在某些实施方式中，接头-细胞毒性化合物与靶蛋白缀合。在一个实施方式中，用于与结合蛋白缀合的接头-细胞毒性部分化合物是如下化合物或其衍生物或其盐或其溶剂化物：在另一个实施方式中，用于与结合蛋白缀合的接头-细胞毒性部分化合物是式ii的化合物或其衍生物或其盐或其溶剂化物：与结合蛋白反应之后，nhs基团丢失。如图9所示，在一个实施方式中，缀合物的细胞毒性部分接头组分可以具有式iii或iv的结构。在一个实施方式中，缀合物可以具有如式v或vi所示的结构。在一个优选的实施方式中，可以通过以下步骤来合成靶向剂(在本实例中为抗体)与smcc-dm1和spdb-dm4接头-细胞毒性部分的缀合物：-更换缓冲液为(如果在缓冲液中的话)或将抗体悬浮于50mm磷酸钾/50mm氯化钠/2mmedta(ph6.5)中。可以通过在280nm处的吸光度来测量抗体浓度。(抗体将与7.5倍摩尔过量的smcc或spdb接头反应，并在与dm1或dm4缀合之前通过sephadexg25树脂进行纯化。)-在dmso中制备20mm的smcc溶液或spdb溶液。可以通过在302nm处的吸光度来证实储液的浓度。可以在二甲胺(dma)中制备10mm的dm1溶液或dm4溶液(以游离硫醇形式)。可以通过以下方法来证实溶液的浓度：测量其在乙醇中的稀释物在280nm处的吸光度。储备dm1/dm4制品中游离-sh的浓度可以使用ellman’s试剂(dtnb)来测量。然后使用7.5倍摩尔过量的smcc/spdb在抗体浓度为20mg/ml的条件下修饰抗体。反应在含有dmso(5％v/v)的50mm磷酸钾/50mm氯化钠/2mmedta，ph6.5(95％v/v)中在室温和搅拌条件下进行2小时。然后通过1.5×4.9cm的在50mm磷酸钾/50mm氯化钠/2mmedta(ph6.5)中平衡的sephadexg25树脂预填充柱凝胶过滤抗体-smcc或抗体-spdb前体。然后使抗体-smcc或抗体-spdb前体与1.7倍过量于接头的dm1或dm4反应(假设每个抗体平均5个接头)。反应在10mg/ml抗体浓度下，在含有dma(6％v/v)的50mm磷酸钾/50mm氯化钠/2mmedta，ph6.5(94％v/v)中进行。加入dm1或dm4后，在搅拌条件下，将反应物在室温下孵育16.5小时。然后通过1.5×4.9cm的在磷酸盐缓冲盐水(pbs)(ph6.5)中平衡的sephadexg25树脂预填充柱凝胶过滤缀合反应混合物。可以通过测量在252nm和280nm处的吸光度来确定每摩尔抗体连接的dm1或dm4分子数(药物:抗体比)。分析所得缀合物与靶抗原的结合和细胞毒性。以下非限制性实施例阐释了本公开：实施例实施例1抗体-药物缀合物：抗-组织蛋白酶d-smcc-dm1(imb-101)的合成和表征小鼠抗-人组织蛋白酶d抗体是从商业来源(r&dsystems,明尼阿波利斯,mn,mab1014,克隆185111,mw150kda)获得的，其通过western印迹识别人组织蛋白酶d并通过直接elisa识别天然蛋白。将抗体重构到无菌磷酸盐缓冲盐水(ph7.2)中至浓度为0.5mg/ml，然后针对无菌pbs进一步透析。提供已经与细胞毒性部分美登素dm1偶联的接头n-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(smcc)(作为smcc-dm1)，其是从商业来源(concortis,圣地亚哥,ca,mw1071.39)获得的，用于利用n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)化学直接偶联到抗体的伯胺。将smcc-dm1重悬于干dmso中至浓度为1mg/ml。确认溶液的ph在ph7.2和ph7.5之间。向抗体溶液中加入适当体积的smcc-dm1溶液以实现smcc-dm1与抗体的最终摩尔比为20:1，并使混合物在冰上反应2小时，然后在室温下反应1小时。使所得混合物针对pbs(ph7.2)广泛透析(更换缓冲液5-10次)，以除去未反应或未结合的smcc-dm1。或者，可以通过以下方法实现清除：使用离心超滤装置(例如amiconultra-0.5(50k或100kmwco)超滤装置(millipore,billerica,ma,us))进行重复脱盐或渗滤(根据需要，用pbs(ph7.2)更换缓冲液4-7次)。通过piercebca蛋白试验(burlington,on)测定所得产物的浓度。通过测量溶液在252nm和280nm处的的吸光度来确定药物:抗体比，假设抗体mw为约150kda；抗体消光系数在252nm处为87360m-1cm-1，在280nm处为224000m-1cm-1；接头-细胞毒性部分消光系数在252nm处为28044m-1cm-1，在280nm处为5700m-1cm-1。用于制备adc的smcc-dm1试剂的结构如下：抗体-药物缀合物：抗-组织蛋白酶d-spdb-dm4(imb-102)的合成和表征小鼠抗-人组织蛋白酶d抗体是从商业来源(r&dsystems,明尼阿波利斯,mn,mab1014,克隆185111,mw150kda)获得的，其通过western印迹识别人组织蛋白酶d并通过直接elisa识别天然蛋白。将抗体重构到无菌磷酸盐缓冲盐水(ph7.2)中至浓度为0.5mg/ml，然后针对无菌pbs进一步透析。提供已经与细胞毒性部分美登素dm4偶联的接头(作为spdb-dm4)，其是从商业来源(concortis,圣地亚哥,ca,mw994.35)获得的，用于利用n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)化学直接偶联到抗体的伯胺。将spdb-dm4重悬于干dmso中至浓度为1mg/ml。确认溶液的ph在ph7.2和ph7.5之间。向抗体溶液中加入适当体积的spdb-dm4溶液以实现spdb-dm4与抗体的最终摩尔比为20:1，并使混合物在冰上反应2小时，然后在室温下反应1小时。使所得混合物针对pbs(ph7.2)广泛透析(更换缓冲液5-10次)，以除去未反应或未结合的spdb-dm4。或者，可以通过以下方法实现清除：使用离心超滤装置(例如amiconultra-0.5(50k或100kmwco)超滤装置(millipore,billerica,ma,us))进行重复脱盐或渗滤(根据需要，用pbs(ph7.2)更换缓冲液4-7次)。通过piercebca蛋白试验(burlington,on)测定所得产物的浓度。通过测量溶液在252nm和280nm处的的吸光度来确定药物:抗体比，假设抗体mw为约150kda；抗体消光系数在252nm处为87360m-1cm-1，在280nm处为224000m-1cm-1；接头-细胞毒性部分消光系数在252nm处为28044m-1cm-1，在280nm处为5700m-1cm-1。用于制备adc的spdb-dm4试剂的结构如下：抗体-药物缀合物：抗-egfr-smcc-dm1(imb-701)的合成和表征小鼠抗-人egfr抗体是从商业来源(r&dsystems,明尼阿波利斯,mn,mab1095,克隆102618,mw150kda)获得的。将抗体重构到无菌磷酸盐缓冲盐水(ph7.2)中至浓度为0.5mg/ml，然后针对无菌pbs进一步透析。提供已经与细胞毒性部分美登素dm1偶联的接头(作为smcc-dm1)，其是从商业来源(concortis,圣地亚哥,ca,mw1071.39)获得的，用于利用n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)化学直接偶联到抗体的伯胺。将smcc-dm1重悬于干dmso中至浓度为1mg/ml。确认溶液的ph在ph7.2和ph7.5之间。向抗体溶液中加入适当体积的smcc-dm1溶液以实现smcc-dm1与抗体的最终摩尔比为20:1，并使混合物在冰上反应2小时，然后在室温下反应1小时。使所得混合物针对pbs(ph7.2)广泛透析(更换缓冲液5-10次)，以除去未反应或未结合的smcc-dm1。或者，可以通过以下方法实现清除：使用离心超滤装置(例如amiconultra-0.5(50k或100kmwco)超滤装置(millipore,billerica,ma,us))进行重复脱盐或渗滤(根据需要，用pbs(ph7.2)更换缓冲液4-7次)。通过piercebca蛋白试验(burlington,on)测定所得产物的浓度。通过测量溶液在252nm和280nm处的的吸光度来确定药物:抗体比，假设抗体mw为约150kda；抗体消光系数在252nm处为87360m-1cm-1，在280nm处为224000m-1cm-1；接头-细胞毒性部分消光系数在252nm处为28044m-1cm-1，在280nm处为5700m-1cm-1。抗体-药物缀合物：抗-egfr-spdb-dm4(imb-702)的合成和表征小鼠抗-人egfr抗体是从商业来源(r&dsystems,明尼阿波利斯,mn,mab1095,克隆102618,mw150kda)获得的。小鼠抗-人组织蛋白酶d抗体是从商业来源(r&dsystems,明尼阿波利斯,mn,mab1014,克隆185111,mw150kda)获得的，其通过western印迹识别人组织蛋白酶d并通过直接elisa识别天然蛋白。将抗体重构到无菌磷酸盐缓冲盐水(ph7.2)中至浓度为0.5mg/ml，然后针对无菌pbs进一步透析。提供已经与细胞毒性部分美登素dm4偶联的接头(作为spdb-dm4)，其是从商业来源(concortis,圣地亚哥,ca,mw994.35)获得的，用于利用n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)化学直接偶联到抗体的伯胺。将spdb-dm4重悬于干dmso中至浓度为1mg/ml。确认溶液的ph在ph7.2和ph7.5之间。向抗体溶液中加入适当体积的spdb-dm4溶液以实现spdb-dm4与抗体的最终摩尔比为20:1，并使混合物在冰上反应2小时，然后在室温下反应1小时。使所得混合物针对pbs(ph7.2)广泛透析(更换缓冲液5-10次)，以除去未反应或未结合的spdb-dm4。或者，可以通过以下方法实现清除：使用离心超滤装置(例如amiconultra-0.5(50k或100kmwco)超滤装置(millipore,billerica,ma,us))进行重复脱盐或渗滤(根据需要，用pbs(ph7.2)更换缓冲液4-7次)。通过piercebca蛋白试验(burlington,on)测定所得产物的浓度。通过测量溶液在252nm和280nm处的的吸光度来确定药物:抗体比，假设抗体mw为约150kda；抗体消光系数在252nm处为87360m-1cm-1，在280nm处为224000m-1cm-1；接头-细胞毒性部分消光系数在252nm处为28044m-1cm-1，在280nm处为5700m-1cm-1。抗体-药物缀合物：同种型对照-smcc-dm1(imb-991)的合成和表征小鼠igg1-κ同种型对照抗体是从商业来源(sigma,m9035,克隆mopc-31c,mw150kda)获得的，将其针对无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)(ph7.2)进行透析。提供已经与细胞毒性部分美登素dm1偶联的接头(作为smcc-dm1)，其是从商业来源(concortis,圣地亚哥,ca,mw1071.39)获得的，用于利用n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)化学直接偶联到抗体的伯胺。将smcc-dm1重悬于干dmso中至浓度为1mg/ml。确认溶液的ph在ph7.2和ph7.5之间。向抗体溶液中加入适当体积的smcc-dm1溶液以实现smcc-dm1与抗体的最终摩尔比为20:1，并使混合物在冰上反应2小时，然后在室温下反应1小时。使所得混合物针对pbs(ph7.2)广泛透析(更换缓冲液5-10次)，以除去未反应或未结合的smcc-dm1。或者，可以通过以下方法实现清除：使用离心超滤装置(例如amiconultra-0.5(50k或100kmwco)超滤装置(millipore,billerica,ma,us))进行重复脱盐或渗滤(根据需要，用pbs(ph7.2)更换缓冲液4-7次)。通过piercebca蛋白试验(burlington,on)测定所得产物的浓度。通过测量溶液在252nm和280nm处的的吸光度来确定药物:抗体比，假设抗体mw为约150kda；抗体消光系数在252nm处为87360m-1cm-1，在280nm处为224000m-1cm-1；接头-细胞毒性部分消光系数在252nm处为28044m-1cm-1，在280nm处为5700m-1cm-1。抗体-药物缀合物：同种型对照-spdb-dm4(imb-992)的合成和表征小鼠igg1-κ同种型对照抗体是从商业来源(sigma,m9035,克隆mopc-31c,mw150kda)获得的，将其针对无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)(ph7.2)进行透析。提供已经与细胞毒性部分美登素dm4偶联的接头(作为spdb-dm4)，其是从商业来源(concortis,圣地亚哥,ca,mw994.35)获得的，用于利用n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)化学直接偶联到抗体的伯胺。将spdb-dm4重悬于干dmso中至浓度为1mg/ml。确认溶液的ph在ph7.2和ph7.5之间。向抗体溶液中加入适当体积的spdb-dm4溶液以实现spdb-dm4与抗体的最终摩尔比为20:1，并使混合物在冰上反应2小时，然后在室温下反应1小时。使所得混合物针对pbs(ph7.2)广泛透析(更换缓冲液5-10次)，以除去未反应或未结合的spdb-dm4。或者，可以通过以下方法实现清除：使用离心超滤装置(例如amiconultra-0.5(50k或100kmwco)超滤装置(millipore,billerica,ma,us))进行重复脱盐或渗滤(根据需要，用pbs(ph7.2)更换缓冲液4-7次)。通过piercebca蛋白试验(burlington,on)测定所得产物的浓度。通过测量溶液在252nm和280nm处的的吸光度来确定药物:抗体比，假设抗体mw为约150kda；抗体消光系数在252nm处为87360m-1cm-1，在280nm处为224000m-1cm-1；接头-细胞毒性部分消光系数在252nm处为28044m-1cm-1，在280nm处为5700m-1cm-1。评价抗体-药物缀合物对人乳腺癌细胞系的活性在补充有10％fbs、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mml-谷氨酰胺的dulbecco'smodifiedeagle培养基(dmem,sigma-aldrich,圣路易斯,mo)中培养mcf-7(atcc,马纳萨斯,va)和mda-mb-231(atcc,马纳萨斯,va)乳腺癌细胞系。在平底96孔组织培养板的每个孔中接种2000-10000个细胞，随后在培养基中用多种浓度的试验品(缀合物)在37℃、湿润的5％co2孵育箱中孵育达5天。通过用培养基中的10％乙醇预处理对照孔2小时来建立阳性细胞杀灭对照。通过mts细胞活力试验(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2h四唑,内盐(mts),promega,麦迪逊,wi)，每个孔加入20-40μl试剂来测定每个孔中处理后剩余细胞的活力。然后孵育mts试验30分钟-2小时，随后通过在吸光度板读数器上测量490nm(和650nm，作为对照波长)处每个孔的吸光度来进行分析。评价抗体-药物缀合物对正常人角化细胞细胞系的活性在补充有10％fbs、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mml-谷氨酰胺的dulbecco'smodifiedeagle培养基(dmem,sigma-aldrich,圣路易斯,mo)中培养正常对照细胞系永生人角化细胞hacat细胞(中国典型培养物保藏中心(cctcc),武汉大学)。在平底96孔组织培养板的每个孔中接种2000-10000个细胞，随后在培养基中用多种浓度的试验品(缀合物)在37℃、湿润的5％co2孵育箱中孵育达5天。通过用培养基中的10％乙醇预处理对照孔2小时来建立阳性细胞杀灭对照。通过mts细胞活力试验(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2h四唑,内盐(mts),promega,麦迪逊,wi)，每个孔加入20-40μl试剂来测定每个孔中处理后剩余细胞的活力。然后孵育mts试验30分钟-2小时，随后通过在吸光度板读数器上测量490nm(和650nm，作为对照波长)处每个孔的吸光度来进行分析。未缀合的抗-人组织蛋白酶d抗体的细胞毒素活性如上所述培养mcf-7和mda-mb-231，并用未缀合的(“裸的”)抗-人组织蛋白酶d抗体处理。通过上述关于抗体药物缀合物的mts试验来评估裸抗体的效果。结果如图7所示。裸抗体对活力无统计学上显著的影响。表1候选物接头/有效载荷/(靶标)接头的化学性质药物-抗体比(dar)imb-101smcc-dm1稳定～8imb-102spdb-dm4不稳定～9-10imb-991smcc-dm1同种型稳定～8imb-992spdb-dm4同种型不稳定～8imb-701smcc-dm1抗-egfr稳定ndimb-702spdb-dm4抗-egfr不稳定ndnd＝未确定表2中提供了针对mcf-7、mda-mb-231和hacat细胞系检测的关于抗体-药物缀合物计算的50％抑制浓度(ic50)(数据对应于图1-6)。表2实施例2评价抗体-药物缀合物对前列腺癌细胞的活性使用实施例1中所述的缀合物来检测它们选择性杀灭前列腺癌细胞的能力。在补充有10％fbs、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mml-谷氨酰胺的roswellparkmemorialinstitute(rpmi)1640(sigma-aldrich,圣路易斯,mo)中培养lncap(atcc,马纳萨斯,va)前列腺癌细胞。在平底96孔组织培养板的每个孔中接种2000-10000个细胞，随后在培养基中用多种浓度的试验品(缀合物)在37℃、湿润的5％co2孵育箱中孵育达5天。通过用培养基中的10％乙醇预处理对照孔2小时来建立阳性细胞杀灭对照。通过mts细胞活力试验(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2h四唑,内盐(mts),promega,麦迪逊,wi)，每个孔加入20-40μl试剂来测定每个孔中处理后剩余细胞的活力。然后孵育mts试验30分钟-2小时，随后通过在吸光度板读数器上测量490nm(和650nm，作为对照波长)处每个孔的吸光度来进行分析。如图8所示，组织蛋白酶d缀合物imb-102以统计学显著的方式降低了lncap细胞的活力。作为spdb-dm4的同种型匹配的单克隆对照的imb-992没有统计学显著的毒性。实施例3评价另外的组织蛋白酶d抗体-药物缀合物对乳腺癌细胞的活性根据实施例1中所述的方法从结合组织蛋白酶d的其它抗体制备缀合物，并如实施例1所述评价其选择性杀灭癌细胞的能力。使用组织蛋白酶d抗体克隆3f12-1b9(abnova,台北,台湾)和组织蛋白酶d抗体m1g8(可从marcelgarcia博士(institutdesbiomoléculesmaxmousseron(ibmm),法国获得)制备带有smcc-dm1和spdb-dm4的缀合物。m1g8克隆识别具有高度亚-nm(sub-nm)亲和力的组织蛋白酶d酶原和组织蛋白酶d的天然形式(laurent-matha等人，1998；garcia等人，1985)已经在使用实施例1中的方法评价对乳腺癌细胞系的毒性的细胞培养试验中证明了：带有smcc-dm1和spdb-dm4的m1g8和3f12-1b9抗体的缀合物优先于正常细胞选择性靶向和杀灭癌细胞，并且具有比得上imb-101和imb-102抗体-药物缀合物的功效，显示出类似的特异性针对癌细胞的细胞毒性。实施例4确定与靶抗原结合的缀合物或靶向剂是否被细胞重新捕获的重新内化试验为了测量结合靶抗原(例如组织蛋白酶d)的缀合物或靶向剂(例如结合组织蛋白酶d的抗体)被细胞重新内化的能力，可以进行重新内化试验。这需要靶向剂与ph响应性荧光标签(例如phrodored标签)缀合，ph响应性荧光标签是光谱(荧光)性质响应于ph降低而变化的ph敏感性染料。phrodored琥珀酰亚胺基(nhs)酯试剂可用于直接标记靶向剂(molecularprobes,lifetechnologies,卡尔斯巴德,ca,us)，如下所示：-将phrodorednhs重悬于dmos中至储备浓度为10.2mm。立即使用该溶液。-将靶向剂更换到0.1m碳酸氢钠缓冲液(ph8.3)中至浓度为至少1mg/ml。-确定待使用的反应性染料的量，其将使染料与蛋白质的摩尔比(mr)为每摩尔蛋白质5-20摩尔染料。向碳酸氢钠缓冲液中的蛋白质溶液中加入适量的反应性染料并混合。在室温下孵育15-60分钟(避光)。-利用凝胶过滤、透析或渗滤(例如，使用sephadexg柱或amicon-ultra0.5单位)清除标记的靶向剂以除去未反应的标记。使用phrodored:靶向剂缀合物进行重新内化试验。可以使用mcf-7细胞或其它细胞系进行试验，添加或不添加重组人组织蛋白酶d。在补充有10％fbs、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mml-谷氨酰胺的dulbecco’smodifiedeagle培养基(dmem,sigma-aldrich,圣路易斯,mo)中培养mcf-7(atcc,马纳萨斯,va)乳腺癌细胞。在平底96孔组织培养板(理想情况下，荧光试验透明底板)的每个孔中接种2000-10000个细胞，随后在培养基中用多种浓度的标记的试验品(phrodored缀合物)在37℃、湿润的5％co2孵育箱中孵育1-24小时。使用未标记的和标记的同种型对照来建立背景和基线。通过在多模式板读数器上测量560nm处的每个孔的荧光来分析培养物。可以在含有phrodored-缀合物但不含细胞的人工酸化至ph为4的(对于阴性对照，类似地人工酸化至ph为8)的孔中建立阳性对照。观察到的荧光量与标记的靶向剂的内化程度成正比。参考文献abbott,d.e.,n.v.margaryan,等.(2010)."reevaluatingcathepsindasabiomarkerforbreastcancer:serumactivitylevelsversushistopathology."cancerbiolther9(1):23-30.barok,m.,h.joensuu,等.(2014)."trastuzumabemtansine:mechanismsofactionanddrugresistance."breastcancerres16(2):209.beaujouin,m.,c.prebois,等.(2010)."pro-cathepsindinteractswiththeextracellulardomainofthebetachainoflrp1andpromoteslrp1-dependentfibroblastoutgrowth."jcellsci123(pt19):3336-3346.benes,p.,v.vetvicka,等.(2008)."cathepsind--manyfunctionsofoneasparticprotease."critrevoncolhematol68(1):12-28.bouchard,h.,c.viskov,等.(2014)."antibody-drugconjugates-anewwaveofcancerdrugs."bioorgmedchemlett24(23):5357-5363.capony,f.,t.braulke,等.(1994)."specificmannose-6-phosphatereceptor-independentsortingofpro-cathepsindinbreastcancercells."expcellres215(1):154-163.chai,y.,w.wu,等.(2012)."thepotentialprognosticvalueofcathepsindproteininserousovariancancer."archgynecolobstet286(2):465-471.chari,r.v.(2008)."targetedcancertherapy:conferringspecificitytocytotoxicdrugs."accchemres41(1):98-107.derocq,d.,c.prebois,等.(2012)."cathepsindispartlyendocytosedbythelrp1receptorandinhibitslrp1-regulatedintramembraneproteolysis."oncogene31(26):3202-3212.dian,d.,t.vrekoussis,等.(2012)."expressionofcathepsin-dinprimarybreastcancerandcorrespondinglocalrecurrenceormetastasis:animmunohistochemicalstudy."anticancerres32(3):901-905.elmelegy,n.t.,h.a.aboulella,等.(2010)."potentialbiomarkersfordifferentiationofbenignprostatichyperplasiaandprostatecancer."brjbiomedsci67(3):109-112.fukuda,m.e.,y.iwadate,等.(2005)."cathepsindisapotentialserummarkerforpoorprognosisingliomapatients."cancerres65(12):5190-5194.gandour-edwards,r.,b.trock,等.(1999)."predictivevalueofcathepsin-dforcervicallymphnodemetastasisinheadandnecksquamouscellcarcinoma."headneck21(8):718-722.hara,i.,h.miyake,等.(2002)."serumcathepsindanditsdensityinmenwithprostatecancerasnewpredictorsofdiseaseprogression."oncolrep9(6):1379-1383.herz,j.和d.k.strickland(2001)."lrp:amultifunctionalscavengerandsignalingreceptor."jclininvest108(6):779-784.hinrichs,c.s.和n.p.restifo(2013)."reassessingtargetantigensforadoptivet-celltherapy."natbiotechnol31(11):999-1008.huang,l.,z.liu,等.(2013)."aprognosticmodelfortriple-negativebreastcancerpatientsbasedonnodestatus,cathepsin-dandki-67index."plosone8(12):e83081.khalkhali-ellis,z.和m.j.hendrix(2014)."twofacesofcathepsind:physiologicalguardianangelandpathologicaldemon."biolmed(aligarh)6(2).kokkonen,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