在血管损伤部位的血小板活化和随后的血栓形成对于正常止血是至关重要的，但它也可能导致心肌梗塞和中风(coughlinsr.nature.2000；407：258-64)。血小板粘附和活化是涉及多个血小板受体-配体相互作用的多步过程。在血管壁损伤后，循环血小板通过糖蛋白(gp)ib-v-ix复合物与固定在暴露的内皮下细胞外基质上(例如胶原上)的vonwillebrand因子(vwf)的瞬时相互作用快速减少(shapiromj等人，thejournalofbiologicalchemistry.2000；275：25216-21)。这种相互作用使血小板靠近血管壁并促进gpvi和胶原之间的接触(nieswandtb等人，blood.2003；102：449-61)。gpvi-胶原相互作用诱导细胞内信号传导级联，导致血小板活化和次级血小板激动剂如血栓素a2(txa2)和二磷酸腺苷(adp)的释放。这些可溶激动剂与局部产生的凝血酶一起通过g蛋白(gi，gq，g12/13)偶联受体进一步促进血小板活化(offermannss，circulationresearch.2006；99：1293-304)。所有这些信号传导途径协同诱导复合细胞应答，如整联蛋白的活化，颗粒内容物的释放和提供用于活化凝血级联的促凝血表面(nakanishi-matsuim等人，nature.2000；404：609-13；cunninghamma等人，thejournalofexperimentalmedicine.2000；191：455-62)。最终的血栓被嵌入纤维蛋白网络中以承受由流动血液产生的剪切力。新形成的血栓的稳定对于在血管损伤部位阻止出血是必不可少的。然而，如果这个过程以不受控制的方式发生，它也可能导致引起危及生命的疾病状态如心肌梗塞或缺血性中风的血栓形成事件。因此，单独或组合使用的抗血小板药物和抗凝血药物对于治疗心脑血管疾病是重要的(mayf等人，blood.2009；114：3464-72；schroderj等人，molcellbiol.2009；29：1083-94；brauna等人，blood.2009；113：2056-63)。虽然目前的抗血小板治疗减少血管事件的复发，但由血小板抑制引起的出血风险增加是已经历中风的患者特别关注的问题，并且还有一部分患者仍然对抗血小板治疗难以耐受(pleinesi等人，pflugersarchiv：europeanjournalofphysiology.2009；457：1173-85)，从而强调需要新颖的抗血小板策略。
它们在血小板粘附中的中心作用使两种受体复合物成为血小板研究的焦点：i)gpib-v-ix复合物与固定在受损血管壁或活化血小板上的vwf相互作用，从而将血小板从血流中募集到在高剪切条件下的反应性表面。ii)gpiib/iiia(整联蛋白αiibβ3)是纤维蛋白原和vwf的受体，其需要由激动剂受体介导的内向外活化，有助于牢固抗剪切血小板粘附并且对于聚集体形成是必需的。gpib-v-ix复合物由4种相关的跨膜gp组成：gpibα，gpibβ，gpv和gpix，它们以2：4：2：1的化学计量结合(luosz等人，blood.2007；109(2)：603-9)。在这个复合体中，gpibα和gpibβ通过二硫键连接，并与gpix非共价结合。gpv与gpib-ix非共价结合(nieswandtb等人，journalofthrombosisandhaemostasis.2009；7：206-9)。在人血小板表面上发现大约30,000个拷贝的gpib-ix复合物(varga-szabod等人，journalofthrombosisandhaemostasis.2009；7：1057-66)。gpib-v-ix功能的丧失引起bernard-soulier综合征(bss)，一种严重的出血性疾病。bss的特征在于异常巨大的循环血小板，其对vwf的粘附有缺陷并且凝血酶响应性降低(canobbioi，等人cellularsignaling.2004；16：1329-44)。尽管gpib或gpix缺乏或功能障碍与bss相关，但未报道过gp5中的功能缺失突变，并且小鼠中gpv的缺乏不导致bss表型(ramakrishnanv等人，pnas.1999；96：13336-41；kahnml等人，blood.1999；94：4112-21)。gpv是复合物正确表达所不需要的唯一亚基(dongj等人，journalofbiologicalchemistry.1998；273：31449-54)。wo95/02054a2，us6,005,089和lanzaf等人journalofbiologicalchemistry.1993；268:20801-20807公开了人gpv基因的序列和结构以及人gpv的氨基酸序列。gpv是高度糖基化的并且含有凝血酶切割位点，导致在凝血酶存在下gpv从血小板表面的定量去除和可溶性gpv(sgpv)的产生(ravanatc等人，blood.1997；89：3253-62；azorsado等人，thrombosisandhaemostasis.1999；81：131-8；whitegc等人，thrombosisresearch.38：641-648)。通过凝血酶切割产生的可溶性人gpv具有如seqidno：10所示的氨基酸序列。值得注意的是，该凝血酶切割位点在小鼠、大鼠和人蛋白中是保守的(ravanatc等人，blood.1997；89：3253-62)。然而，与对凝血酶刺激不响应的蛋白酶活化受体(par)4-缺陷型小鼠(kahnml等人，blood.1999；94：4112-21；kahnml等人，nature.1998；394：690-4)相比，gp5-/-小鼠显示出非常正常的血小板功能。除了凝血酶之外，gpv可像gpibα或gpvi一样被去整合素和金属蛋白酶(adam)家族的脱落酶(最显著的是adam17(也称为肿瘤坏死因子转化酶tace)和adam10(gartonkj等人，journalofbiologicalchemistry.2001；276：37993-8001；gardineree等人，blood.2004；104：3611-7；bergmeierw等人，thrombosisandhaemostasis.2004；91：951-8))切割，这导致了sgpv稍微更长的变体。然而，凝血酶被认为是gpv表面表达的主要调节剂。sgpv水平在血浆和血清之间差异很大(分别为17.3±6.3ng/ml和1.2±0.17μg/ml)(azorsado等人，thrombosisandhaemostasis.1999；81：131-8)，并且sgpv水平在某些病理学条件例如缺血性中风下略微升高(相比于对照中的28.1ng/ml，为39.4ng/ml)(wolffv等人，stroke.2005；36：e17-9)。迄今为止，没有描述过sgpv在血栓形成或止血中的作用。
发明概述
发明人令人惊讶地发现可溶性gpv具有抗血栓作用，而不影响出血时间。因此，本发明提供了包含可溶性gpv的抗血栓剂。本发明涉及以下实施方案(1)至(36)：
(1)包含修饰的糖蛋白v(gpv)的可溶性多肽，其用于治疗和/或预防受试者中的血栓性疾病，所述治疗和/或预防包括向受试者施用有效量的所述可溶性多肽。
(2)根据第(1)项使用的可溶性多肽，其中所述血栓性疾病选自：血栓炎症性病症，静脉血栓形成，动脉血栓形成，毛细血管血栓形成，门静脉血栓形成，肾静脉血栓形成，颈静脉血栓形成，脑静脉窦血栓形成，血液与人造表面接触期间或之后的血栓形成，特别是体外膜式氧合(ecmo)，动脉粥样硬化，关节炎，凝血障碍，深静脉血栓形成(dvt)，弥散性血管内凝血障碍(dic)，慢性或急性血栓栓塞症，肺血栓栓塞症，布加综合征，paget-schroetter病，中风和心肌梗塞。
(3)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述修饰的gpv是截短的gpv。
(4)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述修饰的gpv或截短的gpv由天然gpv的胞外结构域的片段组成，所述片段具有至少6个氨基酸的长度。
(5)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述修饰的gpv或截短的gpv由天然gpv的胞外结构域的片段组成，所述片段具有至少8个氨基酸的长度。
(6)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述修饰的gpv或截短的gpv由天然gpv的胞外结构域的片段组成，所述片段具有至少30个氨基酸的长度。
(7)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述修饰的gpv或截短的gpv由天然gpv的胞外结构域的片段组成，所述片段具有至少100个氨基酸的长度。
(8)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述修饰的gpv或截短的gpv由天然gpv的胞外结构域的片段组成，所述片段具有至少250个氨基酸的长度。
(9)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述修饰的gpv或截短的gpv由天然gpv的胞外结构域的片段组成，所述片段具有至少400个氨基酸的长度。
(10)根据(4)至(9)中任一项使用的可溶性多肽，其中所述片段具有抗血栓活性。
(11)根据(4)至(10)中任一项使用的可溶性多肽，其中所述片段在施用后基本上不影响出血时间。
(12)根据(4)至(11)中任一项使用的可溶性多肽，其中所述天然gpv由seqidno：3所示的氨基酸序列构成，所述胞外结构域基本上由seqidno：3的氨基酸1-503组成。
(13)根据(4)至(11)中任一项使用的可溶性多肽，其中所述天然gpv由seqidno：7所示的氨基酸序列构成，所述胞外结构域基本上由seqidno：7的氨基酸1-502组成。
(14)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述可溶性多肽是非天然存在的多肽。
(15)根据第(14)项使用的可溶性多肽，其还包含延长半衰期的部分。
(16)根据第(15)项使用的可溶性多肽，其中所述延长半衰期的部分直接或经由接头与所述修饰的gpv缀合。
(17)根据第(16)项使用的可溶性多肽，其中所述延长半衰期的部分选自羟乙基淀粉(hes)，聚乙二醇(peg)，聚唾液酸(psa)和白蛋白结合配体，例如脂肪酸链。
(18)根据第(15)项使用的可溶性多肽，其中所述延长半衰期的部分是与所述修饰的gpv直接或通过接头融合的异源氨基酸序列。
(19)根据第(18)项使用的可溶性多肽，其中半衰期延长的异源氨基酸序列包含选自以下的多肽或由其组成：白蛋白及其长度为至少100个氨基酸的片段，免疫球蛋白恒定区及其片段，特别是fc片段，转铁蛋白及其片段，人绒毛膜促性腺激素的c端肽，具有大流体动力学体积的溶剂化随机链(xten)，同型氨基酸重复序列(hap)，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(pas)，afamin，甲胎蛋白，维生素d结合蛋白，能够在生理条件下结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽，以及它们的组合。
(20)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述可溶性多肽可通过在真核细胞中重组表达而获得。
(21)根据第(20)项使用的可溶性多肽，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
(22)根据第(21)项使用的可溶性多肽，其中所述哺乳动物细胞是cho细胞。
(23)根据第(20)项使用的可溶性多肽，其中所述真核细胞是昆虫细胞，例如sf9细胞。
(24)根据(1)至(19)中任一项使用的可溶性多肽，其中所述可溶性多肽可通过在原核细胞中例如在细菌细胞中重组表达而得到。
(25)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述可溶性多肽具有抗血栓活性。
(26)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述可溶性多肽基本上不影响施用后的出血时间。
(27)根据前述项中任一项使用的可溶性多肽，其中所述治疗和/或预防进一步包括向所述受试者施用抗血小板或抗凝血药物。
(28)药物组合物，其包含如项(1)至(26)中任一项所定义的可溶性多肽和药学上可接受的赋形剂。
(29)第(28)项的药物组合物，其中可溶性多肽不由seqidno：10所示的氨基酸序列组成。
(30)一种治疗受试者中的血栓性疾病的方法，其包括向该受试者施用有效量的如项(1)至(26)中任一项所定义的可溶性多肽或项(28)或(29)的药物组合物。
(31)一种制备根据(1)至(26)中任一项使用的可溶性多肽的方法，包括在哺乳动物中表达编码如项(1)至(26)中任一项所定义的可溶性多肽的核酸细胞，和从培养基中回收可溶性多肽。
(32)如(5)至(26)中任一项所定义的非天然存在的可溶性gpv。
(33)第(32)项的非天然存在的可溶性gpv，其不由seqidno：10所示的氨基酸序列组成。
(34)不由seqidno：10所示的氨基酸序列组成的可溶性gpv。
(35)一种药物试剂盒，其包含(i)根据(1)至(26)中任一项所述的可溶性多肽和(ii)除所述可溶性多肽以外的抗血小板或抗凝血药物。
(36)第(35)项的药物试剂盒，其中可溶性多肽不由seqidno：10所示的氨基酸序列组成。
附图的简要说明
图1：可溶性gpv在主动脉损伤模型中具有抗血栓作用。使用镊子通过单次紧压将腹主动脉机械性损伤，并用多普勒流量计监测血流量。显示了至最终闭塞的时间。a、b)注射可溶性人gpv(a：shgpv；b：shgpv-白蛋白-融合蛋白(afp))或可溶性鼠gpv(c：smgpv)后的闭塞时间。每个符号代表一只单独的小鼠。在小鼠不能形成闭塞性血栓的情况下，使用fisher精确检验来计算p值。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001
图2：可溶性人gpv保护避免缺血性中风。小鼠经历60分钟的短暂性大脑中动脉闭塞(tmcao)。在tmcao后24小时通过面积测量法测量野生型(黑色条)和用shgpv-afp预处理的野生型小鼠(灰色条)的脑梗塞体积。结果代表平均值±sd。
图3：可溶性gpv对尾出血时间没有影响。显示了接受媒介物或可溶性人gpv(a：shgpv；b：shgpv-afp)的指示小鼠系的尾出血时间。每个符号代表一只动物。
图4：用可溶性gpv处理导致在体外流动下胶原蛋白上减少的表面覆盖率和血栓体积。a)将人血用shgpv-afp处理，并在1000s-1的剪切速率下在胶原包被的表面上灌注。b)将来自野生型小鼠的血液与smgpv一起孵育，并在1700s-1的剪切速率下在胶原包被的表面上灌注。结果显示为平均值±sd。
发明详述
本发明涉及包含缺乏功能性跨膜结构域的修饰的糖蛋白v(gpv)的可溶性多肽，其用于治疗或预防受试者中的血栓性疾病，所述治疗或预防包括向受试者施用有效量的所述可溶性多肽。优选地，修饰的gpv是截短的gpv。
如本文所用的术语“可溶性”是指不结合细胞膜的多肽。特别地，可溶性多肽没有经由跨膜结构域整合到细胞膜中和/或其不能经由跨膜结构域整合到细胞膜中。通常，可溶性多肽缺乏功能性跨膜结构域。优选地，可溶性多肽可溶于水或缓冲剂，例如pbs。
糖蛋白v
如本文所用，术语“糖蛋白v”或“gpv”表示与seqidno：3中所示氨基酸序列具有至少50％序列同一性的蛋白质。优选地，gpv与seqidno：3所示的氨基酸序列具有至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％的氨基酸同一性。根据本发明，在两个序列的比对后，被评估的序列(“比较序列”)与要求保护或描述的序列(“参考序列”)具有某一“百分比同一性”，或者是某一“百分比相同”的。“百分比同一性”是根据以下公式确定的：
同一性百分比＝100[1-(c/r)]
在该公式中，c是参考序列和比较序列之间在两个序列之间的比对长度上的差异数目，其中(i)参考序列中在比较序列中不具有对应的碱基的每个碱基，和(ii)参考序列中的每个间隙，以及(iii)参考序列中与比较序列中的比对碱基不同的每个比对碱基构成差异。r是参考序列在与比较序列的比对长度上的碱基数目，在参考序列中创建的任何缺口也被计算为碱基。
如果比较序列和参考序列之间存在比对，使得百分比同一性(如上计算)大约等于或大于指定的最小值，则比较序列具有指定的最小百分比同一性，即使比对可能在别处以显示比指定的百分比更低的百分比同一性存在于序列中。
在一个优选的实施方案中，用于比较目的的比对序列的长度为参考序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，80％或90％。
两个氨基酸序列之间的序列比较和百分比同一性(和百分比相似性)的确定可以使用任何合适的程序来完成，例如，程序“blast2sequences(blastp)”(tatusova等人，femsmicrobiol.lett.1999，174：247-250)，其具有以下参数：matrixblosum62；打开缺口11和延伸缺口1的罚分；缺口x_dropoff50；预计10.0字大小3；过滤器：无。根据本发明，序列比较覆盖至少40个氨基酸，优选至少80个氨基酸，更优选至少100个氨基酸，最优选至少120个氨基酸。
通常，gpv是血小板gpv，并且修饰的gpv是修饰的血小板gpv。
天然(即未修饰的)gpv包含功能性跨膜结构域，即其包含能够在表达过程中赋予在细胞膜(例如质膜)中的整合的氨基酸序列。
天然gpv是天然存在的gpv。优选天然gpv来源于哺乳动物。在一个实施方案中，gpv是人gpv。根据该实施方案，天然gpv优选包含seqidno：3中所示的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施方案中，天然gpv是鼠gpv。根据该实施方案，天然gpv优选地包含seqidno：7中所示的氨基酸序列或由其组成。本文所用的术语天然gpv包括但不限于由seqidno：2(具有信号肽)和seqidno：3(不含信号肽)表示的人gpv的同系物和直系同源物。除非另有说明，否则术语gpv是指缺乏信号肽的成熟多肽。
最优选地，天然gpv包含seqidno：3所示的氨基酸序列或由其组成。
修饰的gpv
根据本发明的修饰的gpv不同于其源自的天然gpv(也称为“亲本gpv”或“未修饰的gpv”)，至少在于由于突变或任何其他手段而跨膜结构域不再有功能。例如，代表修饰的gpv中的跨膜结构域的氨基酸序列相对于亲本gpv可具有一个或多个取代、缺失和/或插入。在一个实施方案中，修饰的gpv的氨基酸序列缺少亲本gpv的至少整个跨膜结构域。在另一个实施方案中，修饰的gpv是截短的gpv。人gpv的跨膜结构域从seqidno：3的氨基酸位置504延伸至527。鼠gpv的跨膜结构域从seqidno：7的氨基酸位置503延伸至526。
gpv的跨膜结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸残基可以在修饰的gpv中被缺失或取代。在一个实施方案中，人gpv的跨膜结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸(seqidno：3的氨基酸504至527)可被缺失或取代。在另一个实施方案中，鼠gpv的跨膜结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸(seqidno：7的氨基酸503-526)可被缺失或取代。
修饰的gpv、优选截短的gpv具有抗血栓活性。可如实施例1所述的实验中所示测定抗血栓活性(参见实施例“材料和方法”部分中的“腹主动脉的机械损伤”)。如果受试化合物(例如20μg)能够延迟或防止小鼠动脉闭塞性血栓形成，则具有抗血栓活性。优选地，动脉闭塞性血栓形成被延迟至少1分钟，更优选至少5分钟，最优选至少10分钟。
截短的gpv
截短的gpv由gpv的片段组成。截短通常位于gpv的c-端。n-端可能被截短，或者它可能不被截短。
gpv的片段具有至少6个氨基酸的长度。优选地，gpv片段的长度为至少7，至少8，至少9，至少10，至少15，至少20，至少50，至少100，至少200，至少300或至少400个氨基酸。在某些实施方案中，截短的gpv由如seqidno：3所示的氨基酸序列的片段组成，其中所述片段具有6个氨基酸的最小长度，优选至少7个，至少8个，至少9个，至少10，至少15，至少20，至少50，至少100，至少200，至少300或至少400个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，截短的gpv具有c-端截短并且缺乏其源自的gpv的完整跨膜结构域。在另一个实施方案中，截短的gpv具有c-端截短并且缺少跨膜结构域至截短的gpv不与膜结合的程度。
优选的截短的gpv由选自下列氨基酸序列的氨基酸序列组成，其中所有氨基酸位置分别指代seqidno：3(实施方案1-71)或seqidno：7(实施方案72-141)，如下面所示的：
表1
上述实施方案的氨基酸序列的上限和下限可以彼此组合。
特别地，截短的gpv的优选实施方案由seqidno：3的氨基酸1-516或seqidno：7的氨基酸1-502组成。
在其他实施方案中，截短的gpv包含以下序列或由以下序列组成。
表2
在本发明的具体实施方式中，如本文所述使用的可溶性多肽包含seqidno：10所示的氨基酸序列或由其组成。
在另一个具体实施方案中，本发明的可溶性多肽是非天然存在的多肽。在又一个具体实施方案中，本发明的可溶性多肽不由seqidno：10中所示的氨基酸序列组成。在又一个具体的实施方案中，本发明的可溶性多肽是非天然存在的多肽并且不由seqidno：10中所示的氨基酸序列组成。
多肽的其他组分
本发明的可溶性多肽可以包含不同于衍生自gpv的氨基酸的其它氨基酸或其他延长半衰期的部分。
在本发明的一个实施方案中，本发明的可溶性多肽的半衰期通过化学修饰延长，例如，通过直接或经由接头附接延长半衰期的部分，所述延长半衰期的部分是例如聚乙二醇(聚乙二醇化)，糖基化peg，羟乙基淀粉(hes化)，聚唾液酸，弹性蛋白样多肽，肝素聚合物或透明质酸。在另一个实施方案中，可溶性多肽(优选修饰的gpv)通过化学接头与延长半衰期的蛋白(hlep)如白蛋白缀合。conjuchemllc以示例的方式描述了该缀合技术的原理(参见例如美国专利号7,256,253)。
在本发明的另一个实施方案中，可溶性多肽包含异源氨基酸序列(即对于所使用的各自gpv是异源的)，其直接或通过接头与所述gpv融合。
异源序列可以是被抗体或对标签具有高亲和力的其他分子识别的标签序列。实例包括但不限于多聚组氨酸标签，flag标签，myc-标签，gst标签等。标签序列通常有利于在宿主细胞中表达时纯化多肽。
在一个优选的实施方案中，可溶性多肽还包含半衰期延长蛋白(hlep)。优选地，hlep是白蛋白或其片段。白蛋白的n端可以与修饰的gpv的c端融合。一个或多个hlep可以与修饰的gpv的n-或c-端部分融合，只要它们不干扰或消除修饰的gpv的抗血栓活性。
在一个实施方案中，该多肽具有以下结构：
mgpv-l1-h，[式1]
其中mgpv是修饰的gpv，l1是化学键或接头序列，并且h是hlep。
l1可以是化学键或由一个或多个氨基酸组成的接头序列，例如，为1至50、1至30、1至20、1至15、1至10、1至5或1至3(例如1、2或3)个氨基酸，并且它们可以彼此相同或不同。通常，接头序列不存在于野生型gpv中的相应位置。存在于l1中的合适氨基酸的例子包括gly和ser。接头应该是非免疫原性的并且可以是不可切割或可切割的接头。不可切割的接头可以由交替的甘氨酸和丝氨酸残基组成，如wo2007/090584中所例举的。在本发明的另一个实施方案中，修饰的gpv部分和白蛋白部分之间的肽接头由肽序列组成，其作为人蛋白质中的天然域间接头。优选地，这些肽序列在其天然环境中位于靠近蛋白质表面的位置并且可被免疫系统接近，从而可以假定对该序列呈现天然的耐受性。实例在wo2007/090584中给出。可切割的接头序列描述于例如wo2013/120939a1中。
下面描述了优选的hlep序列。同样地，本发明包括与相应hlep的确切“n端氨基酸”的融合物，或与相应hlep的“n端部分”的融合物，其包括hlep的一个或多个氨基酸的n端缺失。该多肽可以包含多于一个hlep序列，例如，两个或三个hlep序列。这些多个hlep序列可以串联地(例如，作为连续的重复序列)与修饰的gpv的c端部分融合。
延长半衰期的多肽(hlep)
优选地，延长半衰期的部分是延长半衰期的多肽(hlep)，更优选地，hlep选自白蛋白或其片段、免疫球蛋白恒定区及其片段，例如fc片段，具有大流体动力学体积的溶剂化随机链(例如xten(schellenberger等人，naturebiotechnol.2009.27：1186-1190)，同型氨基酸重复(hap)或脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(pas)，afamin，甲胎蛋白，维生素d结合蛋白，转铁蛋白或其变体，人绒毛膜促性腺激素-β亚基的羧基端肽(ctp)，能够在生理条件下结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽或脂质。
如本文所用，“延长半衰期的多肽”优选选自白蛋白，白蛋白家族的成员，免疫球蛋白g的恒定区及其片段，能够在生理条件下与白蛋白、白蛋白家族的成员以及免疫球蛋白恒定区的片段结合的区域和多肽。它可以是本文所述的延长半衰期的全长蛋白(例如白蛋白，白蛋白家族的成员或免疫球蛋白g的恒定区)或其能够稳定或延长修饰的gpv的治疗活性或生物学活性的一个或多个片段。这种片段的长度可以是10个或更多个氨基酸，或者可以包括来自hlep序列的至少约15个，至少约20个，至少约25个，至少约30个，至少约50个，至少约100个或更多个连续氨基酸或可包含相应hlep的部分或全部特定结构域，只要hlep片段提供与不含hlep的相应多肽相比至少25％的功能性半衰期延长。
本发明提出的凝血因子插入构建体的hlep片段可以是正常hlep的变体。术语“变体”包括保守或非保守的插入、缺失和取代，其中这些变化基本上不改变赋予修饰的gpv的生物学活性的活性位点或活性结构域。
具体而言，本发明提出的修饰的gpv-hlep融合构建体可以包括hlep的天然存在的多态性变体和hlep的片段。hlep可以来自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物，例如人，猴，牛，绵羊或猪。非哺乳动物hlep包括但不限于母鸡和鲑鱼。
作为help的白蛋白
术语“人血清白蛋白”(hsa)和“人白蛋白”(ha)和“白蛋白”(alb)在本申请中可互换使用。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”较宽，并且包括人血清白蛋白(及其片段和变体)以及来自其他物种的白蛋白(及其片段和变体)。
如本文所用，“白蛋白”总体上指具有白蛋白的一种或多种功能活性(例如生物活性)的白蛋白多肽或氨基酸序列、或白蛋白片段或变体。特别地，“白蛋白”是指人白蛋白或其片段，尤其是人白蛋白或来自其他脊椎动物的白蛋白的成熟形式或其片段，或者这些分子的类似物或变体或其片段。
具体而言，本发明提出的修饰的gpv融合构建体可以包括人白蛋白的天然存在的多态性变体和人白蛋白的片段。一般而言，白蛋白片段或变体的长度至少为10个，优选至少40个，最优选多于70个氨基酸。
所提出的本发明的修饰的gpv融合构建体的白蛋白片段可以包含至少一个子结构域或ha的结构域或其保守修饰。
在优选的实施方案中，本发明的可溶性多肽包含seqidno：9所示的氨基酸序列或由其组成。
作为help的免疫球蛋白
本领域已知免疫球蛋白g(igg)恒定区(fc)增加治疗性蛋白质的半衰期(dumontja等人，biodrugs.2006；20：151-160)。重链的igg恒定区由3个结构域(ch1-ch3)和铰链区组成。免疫球蛋白序列可以来自任何哺乳动物，或分别来自亚类igg1，igg2，igg3或igg4。没有抗原结合结构域的igg和igg片段也可以用作hlep。治疗性多肽片段优选通过抗体的铰链区或肽接头(其甚至可以是可切割的)连接至igg或igg片段。若干专利和专利申请描述了治疗性蛋白质与免疫球蛋白恒定区的融合以增强治疗性蛋白质的体内半衰期。us2004/0087778和wo2005/001025描述了fc结构域或至少免疫球蛋白恒定区的片段与生物活性肽的融合蛋白，其增加肽的半衰期，否则肽将在体内被快速消除。描述了获得增强的生物学活性、延长的循环半衰期和更大的溶解度的fc-ifn-β融合蛋白(wo2006/000448)。公开了具有延长的血清半衰期和增加的体内效力的fc-epo蛋白(wo2005/063808)以及与g-csf(wo2003/076567)、胰高血糖素样肽-1(wo2005/000892)、凝血因子(wo2004/101740)和白细胞介素-10(us6、403、077)的fc融合蛋白，均具有延长半衰期的性质。
在某些实施方案中，fc融合蛋白是单体的。在其他实施方案中，fc融合蛋白是二聚体。
在wo2013/120939中详细描述了根据本发明可以使用的各种hlep。
核酸与表达
编码待表达多肽的核酸可根据本领域已知的方法制备。基于人gpv(seqidno：1)或鼠gpv(seqidno：5)的cdna序列，可以设计并产生编码上述修饰的gpv构建体的重组dna。表3总结了人和小鼠序列的进一步细节。
表3：小鼠和人野生型gpv序列的细节
其中cdna含有以正确方向插入表达质粒中的完整开放阅读框的构建体可用于蛋白质表达。典型的表达载体含有启动子，其指导对应于携带质粒的细胞中插入的核酸的大量mrna的合成。它们还可以包括允许它们在宿主生物体内自主复制的复制起始序列，以及增加翻译合成的mrna的效率的序列。通过使用例如病毒的调控元件(例如来自epsteinbarr病毒基因组的orip序列)，稳定的长期载体可以作为自由复制的实体来维持。也可以生产将载体整合到基因组dna中的细胞系，并且以这种方式连续生产基因产物。
通常，通过将编码包含修饰的gpv的多肽的核酸导入哺乳动物宿主细胞来获得待提供的细胞。
宿主细胞
根据本发明，可以利用任何易于细胞培养和表达多肽、优选糖基化多肽的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括balb/c小鼠骨髓瘤细胞系(nso/1，ecaccno：85110503)；人成视网膜细胞(per.c6(crucell，leiden，thenetherlands))；sv40转化的猴肾cv1系(cos-7，atcccrl1651)；人胚肾系(在悬浮培养物中亚克隆生长的hek293或hek293细胞，graham等人，j.genvirol.，36：59,1977)；幼仓鼠肾细胞(bhk，atccccl10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-dhfr(cho，urlaubandchasin，proc.natl.acad.sci.usa，77：4216,1980)；小鼠支持细胞(tm4，mather，biol.reprod。，23：243251,1980)；猴肾细胞(cv1atccccl70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76，atcccrl-1587)；人宫颈癌细胞(hela，atccccl2)；犬肾细胞(mdck，atccccl34)；水牛大鼠肝细胞(brl3a，atcccrl1442)；人肺细胞(w138，atccccl75)；人肝细胞(hepg2，hb8065)；小鼠乳房肿瘤(mmt060562，atccccl51)；tri细胞(mather等人，annalsny.acad.sci.，383：44-68,1982)；mrc5细胞；ps4细胞；人羊膜细胞(cap)；和人肝癌细胞系(hepg2)。优选地，细胞系是人或啮齿动物细胞系，特别是仓鼠细胞系如cho。
本领域已知适于将足以实现目的糖蛋白表达的核酸导入哺乳动物宿主细胞中的方法。参见，例如，gething等人，nature.1981；293：620-625；mantei等人，nature.1979；281：40-46；levinson等人ep117,060；和ep117,058。对于哺乳动物细胞，将遗传物质导入哺乳动物细胞的常用方法包括graham和vandererb的磷酸钙沉淀方法(virology.1978；52：456-457)或hawley-nelson的lipofectaminetm(gibcobrl)方法(focus.1993；15：73)。axel在us4,399,216中描述了哺乳动物宿主细胞系统转染的一般方面。关于将遗传物质引入哺乳动物细胞的各种技术，参见keown等人(methodsinenzymology，1989)，keown等人(methodsinenzymology.1990；185：527-537)和mansour等人(nature，1988；336：348-352)。
选择用于培养宿主细胞系的基础培养基对于本发明不是关键的，并且可以是适合于培养哺乳动物细胞的本领域已知的任何培养基或其组合。诸如dulbecco'smodifiedeaglemedium，ham'sf-12medium，eagle'sminimalessentialmedium和rpmi-1640medium等的培养基可商购获得。生长因子例如重组胰岛素的添加是可选的。在一个实施方案中，生产培养基不含动物来源的组分。在一个优选的实施方案中，培养基是“无蛋白质”的，即它完全不含任何蛋白质或至少不含任何不是重组产生的蛋白质。人血清白蛋白可以用作产生糖蛋白的无血清培养补充物。任选地，培养基含有蛋白酶抑制剂，例如丝氨酸蛋白酶抑制剂，其适合于组织培养并且是合成或植物来源的。
一般而言，本发明可以用适合糖蛋白表达的任何细胞培养方法来进行。例如，细胞可以在分批或补料分批培养物中生长，其中在充分表达糖蛋白后终止培养，然后收获表达的糖蛋白。优选地，细胞可以在连续培养物(例如灌注培养物)中生长，其中将新鲜培养基周期性地或连续地添加到培养物中，并且周期性地或连续地收获表达的糖蛋白。培养可以是任何常规类型的培养，例如分批、补料分批或连续培养，但优选连续培养。合适的连续培养包括灌注培养。
本领域普通技术人员将能够调整特定细胞培养条件以优化细胞培养物的某些特征，包括但不限于生长速率、细胞活力、细胞培养物的最终细胞密度、有害代谢副产物例如乳酸盐和铵的最终浓度、表达的糖蛋白的效价、寡糖侧链的程度和组成、或这些或被实践者认为是重要的其他条件的任何组合。
表达的可溶性多肽的分离
一般而言，通常希望分离和/或纯化根据本发明表达的糖蛋白。在某些实施方案中，表达的糖蛋白分泌到培养基中，因此可以通过例如离心或过滤除去细胞和其他固体，作为纯化过程的第一步。
表达的糖蛋白可以通过标准方法(包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、尺寸排阻和羟基磷灰石层析)，凝胶过滤，离心或差异溶解度，乙醇沉淀)和/或通过可用于纯化蛋白质的任何其他技术分离和纯化(参见例如scopes,proteinpurificationprinciplesandpractice2ndedition,springer-verlag,newyork,1987；higginssjandhamesbd(eds.),proteinexpression:apracticalapproach,oxfordunivpress,1999；和deutschermp,simonmi,abelsonjn(eds.),guidetoproteinpurification:methodsinenzymology(methodsinenzymologyseries,vol.182),academicpress,1997，各自通过引用并入本文)。特别是对于免疫亲和层析，可以通过将糖蛋白与包含针对该糖蛋白产生并将其固定到固定支持物上的抗体的亲和柱结合来分离糖蛋白。或者，可通过标准重组技术将亲和标签如流感衣壳序列、聚组氨酸或谷胱甘肽-s-转移酶附着于糖蛋白，以允许经由在适当的亲和柱上通过来进行简易纯化。如果待纯化的可溶性gpv包含hlep，则可以将针对hlep的抗体或能够与hlep结合的其他化合物固定至亲和柱以进行亲和层析。蛋白酶抑制剂如苯基甲基磺酰氟(pmsf)、亮肽素、胃蛋白酶抑制剂或抑肽酶可以在任何或所有阶段加入，以减少或消除纯化过程中糖蛋白的降解。当细胞必须被裂解以分离和纯化表达的糖蛋白时，蛋白酶抑制剂是特别有利的。另外或可选地，可以在任何或所有阶段加入糖苷酶抑制剂，以减少或消除共价连接的寡糖链的酶修剪。
本领域普通技术人员将会理解，确切的纯化技术将根据待纯化的多肽的特性、表达多肽的细胞的特性和/或其中生长细胞的培养基的组成而变化。
组合物和试剂盒
本发明的另一方面是包含本发明的可溶性多肽和药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物。药物组合物可以包含有效量的可溶性多肽用于治疗或预防受试者中的血栓性疾病。药物组合物可以包含约10μg-1,000mg，优选约100μg-500mg，更优选1mg-100mg的可溶性多肽。药物组合物可包含约0.01-20,000μg/ml，优选约0.1-1000μg/ml，更优选0.5-500μg/ml，最优选约100μg/ml的可溶性多肽。药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体或稀释剂。适用于药物组合物的载体和稀释剂在本领域中是公知的。
通过将具有所需纯度的糖蛋白与本领域通常使用的任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(所有这些在本文中被称为“载体”，即缓冲剂，稳定剂，防腐剂，等渗剂，非离子型洗涤剂，抗氧化剂和其他各种添加剂，参见remington'spharmaceuticalsciences，第16版(osol，ed.)1980)混合，可以制备适用于本文所述方法的本发明糖蛋白的治疗性制剂作为冻干制剂或水性溶液贮存。这种添加剂必须在所用剂量和浓度下对接受者无毒。
缓冲剂有助于将ph保持在接近生理条件的范围内。它们可以以约2mm至约50mm的浓度存在。合适的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲剂(例如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物，柠檬酸-柠檬酸三钠混合物，柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)，琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸单钠混合物，琥珀酸-氢氧化钠混合物，琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸盐缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物，酒石酸-酒石酸钾混合物，酒石酸-氢氧化钠混合物等)，富马酸盐缓冲剂(例如富马酸-富马酸一钠混合物，富马酸-富马酸二钠混合物，富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)，葡糖酸盐缓冲剂(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物，葡糖酸-氢氧化钠混合物，葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)，草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物，草酸-氢氧化钠混合物，草酸-草酸钾混合物尿等)，乳酸盐缓冲剂(例如，乳酸-乳酸钠混合物，乳酸-氢氧化钠混合物，乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如乙酸-乙酸钠混合物，乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可以使用磷酸盐缓冲剂，组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如tris。
可以添加防腐剂以阻止微生物生长，并且可以以0.2％-1％(w/v)的量添加。合适的防腐剂包括苯酚，苯甲醇，间甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，十八烷基二甲基苄基氯化铵，苯扎卤铵(例如氯化物，溴化物和碘化物)，六甲基氯化铵和对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇和3-戊醇。可以添加有时称作“稳定剂”的等渗剂以确保液体组合物的等渗性，并且包括多元糖醇，优选三元或更多元糖醇，例如甘油，赤藓糖醇，阿拉伯糖醇，木糖醇，山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂是指广泛类型的赋形剂，其功能范围可以是从增量剂到溶解治疗剂的添加剂，或有助于防止变性或粘附到容器壁。典型的稳定剂可以是多元糖醇(上面列举的)；氨基酸例如精氨酸，赖氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，丙氨酸，鸟氨酸，l-亮氨酸，2-苯丙氨酸，谷氨酸，苏氨酸等，有机糖或糖醇如乳糖，海藻糖，水苏糖，甘露醇，山梨糖醇，木糖醇，核糖醇，肌醇，半乳糖醇，甘油等，包括环醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂如尿素，谷胱甘肽，硫辛酸，巯基乙酸钠，硫代甘油，α-硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个残基或更少的肽)；蛋白质如人血清白蛋白，牛血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮单糖，如木糖，甘露糖，果糖，葡萄糖；二糖如乳糖，麦芽糖，蔗糖和三糖如棉子糖；和多糖如葡聚糖。稳定剂可以以每重量份活性蛋白质0.1-10,000重量的范围存在。
可以加入非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助增溶治疗剂以及保护治疗蛋白免受搅动诱导的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力而不引起蛋白质的变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨酸酯(20、80等)，泊洛沙姆(184、188等)，pluronic多元醇，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(
另外的各种赋形剂包括填充剂(例如淀粉)，螯合剂(例如edta)，抗氧化剂(例如抗坏血酸，甲硫氨酸，维生素e)和助溶剂。
药物组合物可具有约5.0-10.0，优选约5.6-9.0，更优选约6.0-8.8，最优选约6.5-8.0的ph。例如，ph可以是约6.2、6.5、6.75、7.0或7.5。
本发明的药物组合物可以配制用于口服，舌下，鼻内，眼内，直肠，透皮，粘膜，局部或肠胃外给药。肠胃外给药可以包括皮内，皮下，肌内(i.m.)，静脉内(i.v.)，腹膜内(i.p.)，动脉内，髓内，心内，关节内(关节)，滑膜内，颅内，脊柱内和鞘内(脊髓液)注射或输注，优选在小鼠中腹膜内(i.p.)注射，并且在人中静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)注射。任何适用于药物制剂的肠胃外注射或输注的装置均可用于此类给药。例如，药物组合物可以包含在无菌的预填充注射器中。
本发明的另一个方面是药物试剂盒，其包含(i)如上定义的可溶性多肽和(ii)除所述可溶性多肽之外的抗凝血或抗血小板药物。在一个实施方案中，可溶性多肽和抗凝血或抗血小板药物包含在单独的组合物中。
术语“抗凝血或抗血小板药物”是指肝素，直接凝血酶抑制剂(dti)，直接或选择性因子xa抑制剂(xaban)和维生素k拮抗剂(vka)。因此，“抗凝血或抗血小板药物”可以包括天然存在的或合成的肝素。术语“抗凝血或抗血小板药物”还意味着包括通过直接或选择性抑制凝血酶或因子xa来防止血液凝结的物质。在另一个实施方案中，抗凝血物质是维生素k拮抗剂。
在一些实施方案中，抗凝血或抗血小板药物选自
(i)肝素，特别是未分级肝素(ufh)或低分子量肝素(lmwh)，
(ii)直接凝血酶抑制剂(dti)，特别是达比加群，美拉加群，阿加曲班，水蛭素，lepirudin，比伐卢定，ximelagatran或desirudin(dinisio等人，nengljmed.2005；353：1028-40)，
(iii)直接或选择性因子xa抑制剂(xaban)，特别是利伐沙班(eriksson等人，circulation.114：2374-81)，阿哌沙班(arterioscler.thromb.vasc.biol.27：1238-47)，贝曲西班，依他沙班，奥米沙班(cohen等人，circulation115：2642-51)或磺达肝素(peters等人，eur.heartj.29：324-31)
(iv)维生素k拮抗剂(vka)，特别是苯丙香豆素，醋硝香豆素或华法林和相关的含4-羟基香豆素的分子，杀鼠迷，双香豆素，乙基双肉豆蔻酸酯，氯吲哚二酮，diphenandione，phenandione或tioclomarol(参见例如ansell等人，2008,"pharmacologyandmanagementofthevitaminkantagonists”,americancollegeofchestphysiciansevidence-basedclinicalpracticeguidelines(第8版)，chest133(6suppl):160s–198s)。
本发明的另一方面是药物试剂盒，其包含(i)如上定义的可溶性多肽和(ii)除所述可溶性多肽以外的抗血小板或抗凝血药，用于同时、分开或相继用于治疗血栓性疾病。
血栓性疾病的治疗
本发明的可溶性多肽可用于治疗或预防血栓性疾病。
本文使用的“血栓性病症”或“血栓性疾病”是以形成阻碍或减少血流的血栓(血块)为特征的任何病症或疾病。血栓可能局限于形成的部位，或者它可能脱离以阻塞下游的血流(血栓栓塞)。在一些实施方案中，血栓形成可以发生在包括心脏和大脑在内的身体任何地方的静脉(静脉血栓形成)或动脉(动脉血栓形成)中。当血栓形成发生在冠状动脉循环中时，它被称为冠状动脉血栓形成。当脑循环中出现血栓形成时，它被称为脑血栓形成。
血栓性疾病可以包括静脉、动脉或毛细血管血栓形成，心脏中的血栓形成，慢性和/或急性血栓栓塞(例如肺栓塞，心房颤动诱发的血栓形成后的脑血栓栓塞(例如心房颤动中的中风预防(spaf))，由于使人或动物受试者的血液与人造表面接触(例如具有瓣膜置换的患者中，特别是具有机械心脏瓣膜、支架、经皮冠状动脉介入(pci)、体外膜式氧合(ecmo)或进行体外循环手术(cpb手术)的患者中)引起的血栓形成。血栓可导致或增加以下疾病的风险：中风，急性缺血性中风，心肌梗塞，不稳定型心绞痛，深静脉血栓形成(dvt)，门静脉血栓形成，血栓栓塞，肾静脉血栓形成，颈静脉血栓形成，脑静脉窦血栓形成，布加综合征，paget-schroetter疾病或无症状性脑缺血(sbi)。根据本发明的血栓性疾病可以进一步包括肺栓塞，动脉粥样硬化，因子vleiden，抗凝血酶iii缺乏症，蛋白c缺乏症，蛋白s缺乏症，凝血酶原基因突变(g20210a)，同型半胱氨酸血症，抗磷脂抗体综合征，抗心磷脂抗体，血栓形成综合症，狼疮抗凝综合征，恶性肿瘤，大手术，固定化，口服避孕药的使用，沙利度胺的使用，尤其是结合地塞米松，肝素诱导的血小板减少症，怀孕，骨髓增殖性疾病，炎症性肠疾病，肾病综合征，阵发性睡眠性血红蛋白尿，高粘滞综合征，waldenstrom巨球蛋白血症和创伤。术语血栓性疾病也指癌症引起的血栓形成，例如，多发性骨髓瘤和其他血液癌症，腺癌，胰腺癌，胃癌，卵巢癌，前列腺癌，结肠癌，肺癌，脑癌，乳腺癌，肾癌，皮肤癌，宫颈癌和耳鼻喉癌。
术语“血栓性疾病”特别包括血栓性炎症病症。血栓性炎症是指疾病状态，其中促血栓形成和促炎症性级联协同作用并且机械相关以促进疾病进展和器官损伤。血栓炎症疾病状态包括缺血后器官损伤的病况，例如脑(急性缺血性中风)、肺、肝、结肠、心肌或骨骼肌的缺血/再灌注损伤(i/r-损伤)，但也包括全身炎症病况如脓毒症或脓毒性休克。
优选地，血栓性疾病选自血栓炎症性疾病，静脉血栓形成，动脉血栓形成，毛细血管血栓形成，门静脉血栓形成，肾静脉血栓形成，颈静脉血栓形成，脑静脉窦血栓形成，血液与人造表面接触期间或之后的血栓形成，特别是体外膜式氧合(ecmo)，动脉粥样硬化，关节炎，凝血障碍，深静脉血栓形成(dvt)，弥散性血管内凝血障碍(dic)，慢性或急性血栓栓塞症，肺血栓栓塞症，布加综合征，paget-schroetter病，中风和心肌梗塞。
确定使用本发明的可溶性多肽的治疗的有效剂量、总剂量和时间长度完全在本领域技术人员的能力范围内，并且可以使用标准剂量递增研究来确定。待施用的本发明可溶性多肽的剂量将根据特定的可溶性多肽、受试者、疾病的性质和严重程度、受试者的身体状况、治疗方案(例如是否使用第二治疗剂)和选择的给药途径而变化；本领域技术人员可以容易地确定合适的剂量。
取决于许多临床因素，包括疾病的特定类型、疾病的严重程度和患者对本发明的可溶性多肽的敏感性，给药方案可以从每月一次到每天一次不等。在具体的实施方案中，本发明的可溶性多肽是每周两次，每5天，每周一次，每10天，每两周，每三周，每四周或每月一次，或者在任何两个前述值之间的范围内，例如从每周到每个月，从每10天到每两周，或从每周两次到三次等。
本领域技术人员将认识到，本发明可溶性多肽的单独剂量的最佳量和间隔将由所治疗病症的性质和程度、施用的形式、途径和部位、以及正在治疗的特定受试者的年龄和状况决定，并且医生将最终确定使用的适当剂量。该剂量可以根据需要经常重复。如果出现副作用，按照正常的临床实践，可以改变或减少剂量的量和/或频率。
表4：序列表中显示的序列的概述
实施例
结果
实施例1：可溶性gpv具有抗血栓作用
为了研究sgpv对腹主动脉机械损伤模型中体内血栓形成的潜在作用，直接在实验前将20μg人sgpv(shgpv)静脉内注射到wt小鼠中。在主动脉损伤后8分钟内，在pbs注射的对照小鼠中由于闭塞性血栓形成而血流停止(图1)。使用sgpv的预处理保护wt小鼠避免动脉闭塞性血栓形成，表明shgpv具有抗血栓作用(图1)。
实施例2：可溶性人gpv保护避免缺血性中风
为了评估可溶性gpv在局灶性脑缺血后脑梗塞中的作用，将小鼠进行60分钟的短暂性大脑中动脉闭塞(tmcao)，并在24小时后评估梗塞体积。引人注目的是，与野生型小鼠相比，用shgpv-afp处理的野生型小鼠的梗塞体积显著减少(图2)。因此，用可溶性人gpv预处理可以防止脑梗塞进展。
实施例3：可溶性人gpv对尾出血时间没有影响。
为了评估可溶性gpv对止血的作用，用媒介物或20μg可溶性人gpv(shgpv)处理的小鼠经受尾出血时间测定。用手术刀去除尾尖的2mm部分。通过用滤纸以20秒的间隔轻轻吸收血液而不直接接触伤口部位来监测尾出血。当在纸上没有观察到血液时，确定出血已经停止。(图3)。这些数据表明，发挥抗血栓作用的shgpv剂量(图1)不影响止血，表明shgpv是安全的抗血栓剂。
实施例4：体外流动下与胶原蛋白的粘附
为了评估可溶性gpv在体外测定中流动下胶原蛋白上血栓形成中的作用，将抗凝全血与20μg可溶性gpv孵育5分钟，并在胶原包被的表面上灌注。用shgpv-afp(a)预处理的人血或用可溶性鼠gpv(b)预处理的野生型血液显示出显著降低的表面覆盖度和减少的血栓形成。因此，体外流动粘附测定在很大程度上模拟了体内条件并再现了体内表型。
实施例1-4的材料和方法
小鼠
动物研究由下弗兰肯地区政府(bezirksregierungunterfranken)批准。
可溶性gpv
1.可溶性人gpv(shgpv)
在杆状病毒转染的昆虫细胞中重组表达可溶性人gpv(成熟人gpv的氨基酸1-518)，使用标准次氮基三乙酸(ni-nta)柱纯化并溶解于pbs缓冲剂中。使用标准sdspage检查纯度。
成熟shgpv的氨基酸序列(信号肽未显示)：
(斜体：聚his标签)
2.与白蛋白融合的可溶性人gpv(shgpv-afp)
shgpv-afp在chok1细胞中表达，并在灌注发酵罐系统中产生。使用具有30kd膜(例如centramateos030t12)的tff系统(例如centramate500spall)将无细胞收获物浓缩30倍。将该浓缩物加入nacl和edta至最终浓度为0.75mol/lnacl和5mmol/ledta，并在用20mmph7.4的tris缓冲剂预平衡的captureselect人白蛋白柱(lifetechnologies)上加载过夜。用平衡缓冲剂洗涤柱后，用20mmtris加2mmgclph7.4缓冲剂洗脱shgpv-afp。将洗脱物浓缩并用50mmtris+150mmnaclph7.4使用具有30kd截留的超离心过滤器(例如amiconref.ufc903024)透析。
成熟shgpv-afp的氨基酸序列(信号肽未显示)：
(下划线：凝血酶切割位点和ggs接头；斜体：人白蛋白序列)
3.可溶性鼠gpv(smgpv)
在cho细胞中重组表达可溶性鼠gpv(成熟鼠gpv的氨基酸1-519)，使用抗flag柱纯化并溶解于pbs缓冲剂中。使用标准sdspage检查纯度。
成熟smgpv的氨基酸序列(信号肽未显示)：
(斜体：flag标记)
腹主动脉的机械损伤
为了打开麻醉小鼠(10-16周龄)的腹腔，进行纵向中线切割并暴露腹主动脉。在主动脉周围放置多普勒超声波流量探头(transonicsystems，maastricht，netherlands)，并通过在流量探头上游以镊子单次紧压(15s)的机械损伤诱导血栓形成。监测血流直到发生完全闭塞或已过去30分钟。
短暂性大脑中动脉阻塞(tmcao)
通过短暂性大脑中动脉闭塞(tmcao)在8至12周龄的小鼠中诱导局灶性脑缺血。在70％n2/30％o2混合物中用2％异氟烷诱导吸入麻醉，并在手术过程中使用伺服控制加热装置记录并保持体温。每只动物手术的持续时间保持在15分钟以下。将硅橡胶涂层的6.0尼龙单丝(6021pk10，doccol，redlands，ca，usa)推进通过颈动脉直至大脑中动脉(mca)的原点，引起mca梗塞。在60分钟的闭塞时间后，将细丝移除以允许再灌注。再灌注后24小时处死动物并检查脑内出血。再灌注24小时后在2,3,5-三苯基氯化四唑(ttc，sigma-aldrich)(2％(w/v)溶液)染色的脑切片上定量评估梗死程度。以盲法进行校正脑水肿的梗塞区域的平面测量(imagej软件，nih，bethesda，md，usa)。
出血时间测定
通过腹膜内注射三重麻醉剂麻醉小鼠，并用解剖刀移除尾尖的2mm段。通过用滤纸以20秒的间隔轻轻吸收血液而不直接接触伤口部位来监测尾出血。当在纸上没有观察到血液时，确定出血已经停止。20分钟后通过烧灼手动停止实验。
在体外流动下胶原蛋白上的血栓形成
对于胶原蛋白的粘附，盖玻片在37℃o/n下用200μgml-1胶原蛋白i包被并用1％bsa的pbs封闭1小时。将全血(700μl+300μl肝素(tbs中20u/ml，ph7.3))在含有ca2+的tyrode缓冲剂中以2:1稀释并装入1ml注射器中。灌注前，将抗凝血液与dylight-488缀合的抗gpix衍生物(0.2μg/ml)在37℃孵育5分钟。将装有涂覆的盖玻片的具有50μm狭缝深度的透明流动室连接到填充有稀释的全血的注射器。在相当于1000s-1或1,700s-1的壁剪切速率的高剪切应力下使用无脉冲泵进行灌注。用zeissaxiovert200倒置显微镜(40x/0.60物镜)观察聚集体的形成。使用coolsnap-ez相机记录相位对比和荧光图片，并使用metavue软件离线分析。
统计分析
结果显示为来自每组至少三次单独实验的平均值±sd。适用时，fisher精确检验用于统计分析。否则，进行welcht检验进行统计分析。p值<0.05被认为是统计学显著的。
序列表
<110>朱利叶斯-马克西米利维尔次堡大学
<120>用于治疗血栓性疾病的可溶性糖蛋白v
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leuserglyleuglnthrleuglyleuthrargasnproargleuser
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acctcctctgctgttagtttcaagggggctgagggtgggggttcgacgggacttggctca1973
tcaggtccaactgtgcagcgctgggtgcctagtggagagaggagccctttcttggtttct2033
gaatttgaggacacatcctgccagtgggcaagacctctccgggacccagcaagggttgag2093
taacatttgctgaaggaacaccggcttaaaacgaaccctaggtccaagagatgaaggctc2153
ttcccaaaataaaggtggagtgttcttgtccctttacctgaaaggaaaaaaaaaaaaaaa2213
aa2215
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<211>567
<212>prt
<213>小家鼠
<400>6
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<212>prt
<213>小家鼠
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<212>prt
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<220>
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<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(457)
<223>人gpv
<220>
<221>misc_feature
<222>(458)..(463)
<223>凝血酶切割位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(464)..(493)
<223>ggs接头
<220>
<221>misc_feature
<222>(494)..(1078)
<223>人白蛋白
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<212>prt
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<220>
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<223>从凝血酶裂解获得的人gpv的片段(gpvf1)
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