本发明涉及癌症的评估和治疗。具体而言，本发明涉及乳腺癌，更特别是三阴性乳腺癌的评估和治疗。
背景技术：
：三阴性乳腺癌，tnbc的管理。这些癌症特别具有侵袭性(aggressive)，并具有早期复发和导致死亡的倾向。tnbc是由雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)和人类表皮生长因子受体2型(her2)1的缺乏所定义的乳腺癌的独特亚型。它占所有乳腺癌的大约15-20％2和所有基底细胞样型乳腺癌(basal-likebreastcancer)的85％3。与其他亚型的乳腺癌不同，tnbc常与总体预后不良相关，其特征为更高的复发率和远处转移率，且没有有效的靶向治疗。化疗是用于治疗tnbc的唯一系统模式，并且可能幸运的是，与er阳性肿瘤相比，tnbc具有更高的病理学反应。尽管如此，疾病复发率很高，并且通常在头3年内发生。虽然化疗最初对一部分患者有效，但由于获得性化疗耐药(chemoresistantce)，该疾病常常复发并进展迅速，导致与其他亚型的乳腺癌相比总体生存时间更短4。那些未能达到完全病理反应(pcr)的患者的结果更糟糕。尽管是导致死亡的主要原因，但晚期tnbc的治疗选择仍然有限，因此需要确定以化疗耐药和转移为目标的新治疗策略。目前的指南并不推荐对新辅助化疗(neoadjuvantchemotherapy)后残留疾病进行进一步的化疗，并且似乎与不良预后相反，与我们在患者中观察到的相类似。这种明显的治疗不足的原因主要是由于验证额外毒性的临床获益的不确定性。目前的生物标志物er和pr预测化疗疗效(chemotherapyresponse)的程度非常有限，暗示乳腺肿瘤的分子多样性。即使在tnbc中，化疗疗效也不尽相同；具有最高pcr率的基底样bl-亚型。基底细胞样型bl亚型具有最高的pcr率。根据选择的基因表达模式，多基因组测定法，如oncotypedx，被开发用于对化疗效果进行分层(stratify)。除了限于er阳性肿瘤外，这些检测方法，如oncotypedx的情形下，未能在40％的不确定评分患者(sabcs2015)中给出确切的建议。分子多样性也导致对相同化疗剂的不同疗效(response)。尽管已经报道了化学预测性生物标志物，但是大多数没有被充分验证用于临床使用并预测单独对单一药物的耐药性，为临床医生提供关于合适的替代性非交叉耐药性药物的实用建议很少。因此，所需要的是生物标志物，它不仅能预测哪种肿瘤有望从化疗中获益，而且能预测肿瘤可能对其敏感的药物。tnbc的另一个挑战是缺乏治疗目标。随着曲妥珠单抗的加入，过度表达her2的肿瘤的预后显著改善。因此大部分工作都集中在开发有针对性的疗法(therapeutics)上。根据在具有缺陷型同源重组修复的tnbc中的功效的临床前数据，即使在不存在brca1/2突变的情况下，也正在研究聚(adp-核糖)聚合酶(papr)抑制剂。正在特定的亚组中对pi3k、mek和mtor抑制剂进行研究，并且最近，jak2抑制剂在具有jak2扩增的tnbc中出现希望。考虑到这些药剂的多样性和特异性，这些靶向治疗剂中的任何一种都可能仅在一小部分的tnbc中有效；用作比较，曲妥珠单抗仅在25％的乳腺癌中有效。炎症响应(inflammatoryresponse)在癌症进展中起着至关重要的作用5-7。特别地，通过诸如nf-κb、jak/stats和ifns等途径引发的炎性细胞因子和趋化因子的产生与癌症起始(initiation)、转移和化疗耐药性(chemoresistance)相关8-10。在乳腺癌中，发现nf-κb的组成型活化在tnbc中更为常见，其可通过自分泌和旁分泌机制引发，导致无数下游靶标表达，包括炎性细胞因子如il-6、il-8和cxcl以及抗凋亡基因以赋予侵袭性生长、干细胞性(stemness)和化疗耐药性11-14。虽然nf-κb似乎是癌症治疗的优秀靶点，但nf-κb抑制剂的开发尚未能提供临床益处，这是由于nf-κb在正常细胞中的基本功能，因而它们对正常组织造成严重毒性15-18。因此，已经投入努力来开发选择性靶向癌症特异性nf-κb下游事件的治疗策略，以便使正常细胞不受伤害19。或者，我们推断，在癌细胞而不是正常细胞中赋予nf-κb依赖性的可操作致癌性上游事件的鉴定也可能需要在nf-κb驱动的人类癌症如tnbc的治疗中进行治疗性探索。toll样受体(tlr)/白细胞介素1受体(il-1r)信号传导(singaling)参与irak4和irak1的磷酸化，以驱动炎症应答中的下游事件如nf-κb和干扰素信号传导，并且这一过程最近被认为与肿瘤发生有关20-23。此外，irak1/4的药理学抑制已被证明通过nf-κb依赖性或非依赖性机制而有效地靶向携带irak1活化的mds和急性淋巴细胞白血病(all)20,22。本说明书中显然在先公开的文件的列表或讨论不应必然被视为承认该文件是现有技术状态的一部分或者是公知常识。本文提及的任何文件通过引用整体并入本文。技术实现要素：在本发明中，我们阐明了白细胞介素1受体相关激酶1(irak1)在tnbc子集中的致癌作用，并且通过nf-κb依赖性和非依赖性机制展示了其与转移和化疗耐药性的功能性联系。在对紫杉醇具有耐药性的tnbc细胞中观察到irak1信号传导(signaling)的激活，并因此该途径的抑制诱导大量细胞凋亡。irak1信号传导的这种激活看起来对紫杉醇是特异性的，并且过度表达p-irak1的细胞对顺铂和吉西他滨(gemcitabine)保持敏感。因此，我们推测p-irak1可以鉴定紫杉醇耐药tnbc，这种tnbc可能会受益于使用替代性非交叉耐药试剂顺铂和吉卡替滨(gemcatibine)的进一步治疗。重要的是，我们证明irak1的药物抑制剂包括天然产物对tnbc转移和化疗耐药性具有强有力的活性，因此提供了容易探索的治疗策略，用于靶向目前难以治愈的难治性tnbc。另外，irak1也可能具有作为治疗靶标的潜力。表达高水平p-irak1的mda-mb-231细胞不再对增加剂量的紫杉醇敏感，但是当加入irak1抑制剂(irak-inh)以抑制irak1信号传导时观察到大量细胞凋亡。jak2抑制剂(帕克替尼，pacritinib)也被发现具有irak1抑制活性(通过与ctibiopharma的交流)，并且用帕克替尼处理紫杉醇耐药的mda-mb-231细胞产生类似于用irak-inh时观察到的效果。因此，我们推测irak1可能是对一线治疗剂紫杉醇具有获得性耐药的tnbc肿瘤中的一种新型治疗靶点。事实上，事实上，irak1抑制也被作为骨髓增生异常综合征和急性髓细胞白血病的治疗方式进行探索。因此，在本发明的第一方面，提供了调节irak1的组合物在制备用于治疗癌症例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌或胰腺癌等的药物中的用途。优选地，术语调节是指以下：irak1的活性、irak1的磷酸化，或irak1的表达水平包括mrna表达水平和蛋白质表达水平中的一种或多种的激活、抑制、延迟、阻遏(repression)或干扰。更优选地，术语调节是指irak1水平的降低。优选地，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。优选地，所述组合物包含人参皂甙。人参皂苷属于天然产物类固醇糖苷和三萜皂苷。该家族中的化合物几乎全部存在于人参属(genuspanax)植物(人参(ginseng))中，其在传统医学中具有很长的使用历史，这导致了对人参化合物的药理作用的研究。作为一个类别，人参皂甙在单独研究时表现出各种各样的微妙生物效应。人参皂甙可以从植物的各个部分分离，但通常来自根部，并且可以通过柱层析纯化。人参属植物的化学特征是不同的；尽管亚洲人参(panaxginseng)由于其在传统中药中的应用而被广泛研究，但西洋参(americanginseng，panaxquinquefolius)和日本人参(japaneseginseng，panaxjaponicus)有独有的人参皂苷。由于环境影响，人参皂甙含量也有很大差异。在一个实施方案中，所述组合物可以是包含药学上可接受的载体的药物组合物。优选地，所述组合物是含有每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当部分量的活性成分的单位剂量。在人类治疗中，所述组合物可以单独施用，但通常与根据预期施用途径和标准药物实践选择的合适的药物赋形剂稀释剂或载体混合施用。优选地，所述组合物适合于肠胃外施用于患者。适合肠胃外施用的组合物包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使组合物与预期接受者的血液等渗的溶质；以及可包含悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。所述组合物可以以单位剂量或多剂量容器(例如密封的安瓿和小瓶)存在，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用前立即加入无菌液体载体，例如注射用水。即时注射溶液和混悬液可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。在本发明的另一方面，提供了用于治疗乳腺癌患者的irak1活性抑制剂。在一个实施方案中，所述患者被施用另外的抗癌剂或治疗。在本发明的另一方面，提供了用于帮助对乳腺癌患者进行分类或确定预后，或者帮助为乳腺癌患者选择治疗策略的方法，所述方法包括评估样品中irak1核酸、蛋白质或活性的水平。样品中irak1和磷酸化irak1的水平的确定对于临床医生确定如何诊断和/或管理癌症以及决定患者的化疗策略将是有用的。另外，确定irak1的水平对于确定患者复发的可能性也是有用的。在一个实施方案中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。此外，所述方法评估所述样品中nf-κb核酸、蛋白质或活性的水平的步骤。另外或可选地，所述方法可以还包括评估所述样品中il-6、il-8或cscl1核酸、蛋白质或活性的水平的步骤。有利地，所述方法包括利用关于所述样品中irak1核酸、蛋白质或活性的水平的信息从而选择治疗方案的步骤。优选地，所述样品是其中怀疑有乳腺癌或者已经发现乳腺癌的组织的样品，或者是其中包含来自所述组织的细胞的样品。优选的是，核酸来源于其中怀疑有乳腺癌或者其中可能发现或已经发现有乳腺癌的组织的样品。例如，如果其中怀疑有乳腺癌或者其中可能发现或已经发现有乳腺癌的组织是乳房，则优选的是含有核酸的样品来源于患者的乳房(包括腋下组织，例如淋巴结组织)。乳房样品可通过手术切除、“实切(truecut)”活检、穿刺活检、乳头抽吸、肿块抽吸或图像引导活检获得。图像可以通过x射线、超声波或(较不优选的)选择性结合或定位于乳房的锝-99-标记的抗体或抗体片段产生。磁共振成像(mri)可用于区分纤维化和乳腺癌。所述样品也可以是可疑的转移部位如肝或肺或骨头的活检或针头抽吸物。所述样品可以直接来自患者，例如通过组织的活检，或者它可以来自患者远离组织的部位的，例如因为来自组织的细胞已经从组织迁移到身体的其他部位。或者，样品可以间接来源于患者，例如，来自其的组织或细胞可以在体外培养，或在异种移植模型中培养；或者核酸样品可以是已经从来自患者的原始来源的核酸复制(无论在体外还是体内)的核酸样品。因此，虽然源自患者的核酸可能物理上存在于患者身体内，但可以替代性地由物理上存在于患者体内的核酸复制而得。肿瘤组织可以取自原发性肿瘤或转移瘤。样品可以是淋巴结、淋巴或血液，和检测到的疾病的扩散。应该理解的是，上述方法可用于处于癌症风险组的患者的症状前筛查。筛查的高风险患者包括50岁以上的患者或携带导致易感性增加的基因(例如brca1、brca2或p53的易感染形式)的患者；具有乳房/卵巢癌家族史的患者；有患病的兄弟姐妹的患者；未生育妇女；以及初潮和绝经之间间隔较长的女性。类似地，这些方法可以用于肿瘤如乳腺肿瘤的病理分类。可以使用免疫组织化学处理的组织切片的定量分析。例如如下所述，单独评估核和细胞质irak1蛋白可能是有用的，但技术人员将能够进行任何合适的方法以评估蛋白质量，例如可以使用被认为与irak1反应的抗体。例如，通过免疫组织化学测量，irak1蛋白的水平至少可以被视为在复发概率高的癌细胞中比在复发概率低的癌细胞或在非癌细胞中要高得多。优选的是，如果含有来自患者的核酸(例如mrna)的样品不是所讨论的组织或细胞类型的基本上纯的样品，则对样品富集所述组织或细胞。例如，可以利用其中使用乳房细胞选择性抗体或至少对上皮细胞具有选择性的抗体的细胞分选方法，诸如荧光活化细胞分选(facs)来实现样品如血液样品中乳房细胞的富集。所述样品的来源还包括如上所述的活检材料和肿瘤样品，还包括固定石蜡悬挂标本以及新鲜或冷冻的组织。来自患者的核酸样品可以在与选择性杂交irak1mrna的核酸接触之前进行处理。例如，来自患者的核酸样品可以通过选择性扩增、逆转录、固定(例如序列特异性固定)或掺入可检测标记来处理。可以单独分析细胞，例如使用单细胞固定技术。可以分析单个细胞的方法包括使用激光捕获显微切割(lcm)技术的方法。该技术可以用于收集单细胞或同质细胞群进行分子分析，并且描述于例如jinetal(1999)labinvest79(4),511-512；simoneetal(1998)trendsgenet14(7),272-276；luoetal(1999)naturemed5(1),117-122；arcuturs更新，例如1999年6月和1999年2月；us5,859,699(全部通过引用并入本文)。感兴趣的细胞例如通过免疫组织化学技术可视化，并转移到由激光脉冲激活的聚合物膜上。该技术也可用于分离对特定组分不利(negative)的细胞。用于执行lcm的显微镜由arcturusengineering,inc.,1220terrabellaavenue,mountainview,ca94042,usa制造。lcm可以与其他分离或浓缩方法一起使用。例如，lcm可以在富集样品中目标细胞类型的方法之后使用。在更优选的实施方案中，测量所述irak1蛋白的水平。优选地，通过使蛋白质与选择性结合所述irak1多肽的分子相接触来测量所述蛋白质的水平。含有来自患者的蛋白质的样品方便地是样品组织。在某些情况下，例如评估乳房组织时，测量所述irak1多肽的升高水平(肿瘤)与较低水平(正常)相比可能是有用的。本发明的方法还包括测试样品中所述irak1多肽的测试和检测，以及它们在对照样品中的比较。含有来自患者的蛋白质的样品方便地是其中怀疑有癌症或者其中可能发现或已经发现癌症的组织的样品。与较早的方法相关而描述了获得合适样品的方法，这对于本领域技术人员将是显而易见的。例如，样品可以是针活检、组织芯活检、乳头或淋巴结抽吸物中的任一种。样品也可以是淋巴结来源的材料，其可特别用于确定癌症是否已经扩散。如上所述，可以分析单个细胞。涉及检测irak1蛋白的本发明方法对于历史样品例如含有肿瘤样品的石蜡包埋切片的那些样品特别有用。可以以任何合适的方式在样品中确定irak1蛋白的水平。在本发明的另一方面，提供了用于帮助为正在接受紫杉醇治疗的乳腺癌患者，或先前已接受或正在接受紫杉醇治疗且已复发的患者选择治疗策略的方法，所述方法包括评估irak1核酸、蛋白质或活性的水平，并评估患者的紫杉醇耐药状态。藉由“紫杉醇耐药状态”，我们纳入了患者癌细胞可能表现出对紫杉醇疗法耐药水平的量度的含义。据认为，这与irak1活性的测量结合可能使得知情治疗成为可能。可以在患者中首次进行“紫杉醇耐药状态”的评估，或者可以在先前用紫杉醇疗法对所述患者进行治疗之后的患者病历中得以暗示，或者可能之前通过其他一些方式评估。除了评估患者对紫杉醇疗法无应答史之外或作为替代方案，“紫杉醇耐药状态”可以通过任何已知的各种方式进行评估。优选地，如果样品中irak1核酸、蛋白质或活性的水平是升高的水平；并且如果患者被评估为具有升高的紫杉醇耐药状态或对紫杉醇疗法具有耐药性，则选择的治疗方案可以包括用irak1活性抑制剂治疗患者。所述抑制剂可以是人参皂甙。在本发明的另一方面，提供了用于帮助确定乳腺癌患者是否具有相对高或相对低的无病存活率的可能性的方法，所述方法包括评估从患者获得的样品中irak1核酸、蛋白质或活性的水平。例如，低irak1水平可以被认为表示用标准疗法有＞90％的治愈机会，而高水平可以被认为表示有＜85％的治愈机会。藉由“治愈”，其意味着包括至少10年的无乳腺癌生存期。本发明的另一方面，提供了治疗乳腺癌患者的方法，所述方法包括向患者施用irak1活性抑制剂。在一个实施方案中，其中所述抑制剂是人参皂甙。在本发明的另一方面，提供了irak1活性抑制剂在制备用于治疗乳腺癌患者的药物中的用途，其中来自患者的样品中irak1核酸或蛋白质的水平已被确定为升高的。所述乳腺癌可以是三阴性乳腺癌。在本发明的再另一方面，提供了可用于评估乳腺癌的组件试剂盒，其包括：(a)特异性地能够用于测定样品中irak1蛋白质水平的试剂；和(b)用于从样品中分离乳腺细胞(breastcell)或鉴定样品中的乳腺细胞以进行irak1测定的工具。优选地，所述试剂是与irak1核酸选择性杂交的核酸，或者是与irak1蛋白选择性结合的分子。在本发明的另一方面，提供了用于鉴定可能用于治疗乳腺癌的化合物的筛选方法，所述方法包括：(a)测定测试化合物对irak1核酸、蛋白质或活性水平的影响；和(b)选择降低所述水平的化合物。优选地，所述测试化合物在体外或在乳腺癌细胞系中确定。转移和肿瘤复发仍然是侵袭性乳腺癌疗法(aggressivebreastcancertherapy)的主要临床挑战。有利的是，在这里，我们报道白细胞介素1受体相关激酶1(irak1)在乳腺癌亚组特别是三阴性乳腺癌(tnbc)中过表达，其中它起到驱动侵袭性生长、转移和对化疗的获得性耐药性的作用。在tnbc中高水平的irak1表达赋予nf-κb相关细胞因子分泌和侵袭性生长对irak1的遗传和药理学灭活的易感性。此外，转移性tnbc显示irak1表达增加，以及侵袭和转移的irak1依赖性增加。重要的是，化疗激活irak1信号传导，有助于增加癌症干细胞富集和获得对化疗的耐药性。irak1的药物抑制剂，包括传统的东方药物衍生物，能够通过抑制p38-mcl1途径引发大量凋亡来逆转化疗耐药性(chemoresistance)。因此，本发明提供了irak1可以用作限制难治性tnbc进展和改善当前化疗功效的治疗靶点的证据。本发明还旨在验证磷酸化irak1(p-irak1)与临床结果的关联，并评估其作为对紫杉醇耐药tnbc中交替的非交叉耐药试剂(alternatenon-crossresistantagents)和irak1抑制的应答标记的潜力。我们已经描述了irak1在乳腺肿瘤生长和转移中的作用。此处，我们还验证了两个独立的tnbc队列中肿瘤p-irak1水平与结果之间的相关性。p-irak1阳性结果的阈值将被确定。我们特别关注新辅助化疗后残留肿瘤中p-irak1水平是否预测紫杉醇耐药和复发。这将首先在档案样品中进行评估，然后在前瞻性收集的来自使用基于紫杉烷的化疗治疗tnbc肿瘤的妇女中的样品。我们还观察了初步结果，提示了p-irak1在tnbc中的治疗作用。观察到获得性紫杉醇耐药性中irak1信号传导的激活，我们将进一步探讨p-irak1过表达(紫杉醇耐药)肿瘤对交替非交叉耐药试剂顺铂和吉西他滨以及新型irak1抑制剂帕克替尼(pacritinib)的反应。在代表tnbc亚型的一系列tnbc细胞系中进行功效研究，然后在小鼠异种移植物中进行，以确定不同亚型之间的反应是否变化，并且对三种药物中的任一种的反应是否可以根据p-irak1进行分层水平。这对于定义每种药剂最佳使用的临床情况很重要。最后，这些发现在tnbcpdx模型中得到验证。紫杉醇耐药性异种移植物将由紫杉醇新辅助化疗后残留肿瘤(从手术标本获得)产生或体内用紫杉醇治疗的初治tnbc产生。这些实验将提供关于紫杉醇耐药肿瘤如何在临床环境中对顺铂、吉西他滨和帕克替尼产生反应的重要数据。本发明潜在地改善了新辅助化疗后残留tnbc患者的结局。已有证据表明，针对残留肿瘤将会提高生存率。此处，我们的方案遵循类似于iii期ea1131试验的概念，但主要优点是可以用ihc检测p-irak1，使其更便宜且更广泛地适用。单基因标记不一定不如多基因分析；时至今日，er、pr和her2是常规临床实践中广泛使用的唯一生物标志物。此外，irak1抑制剂作为一种新型治疗剂具有潜力，在不符合一线紫杉烷治疗方案的tnbc肿瘤中尤其有价值。此外，p-irak1也可用于指导辅助和转移条件中化疗的选择。在手术前评估肿瘤以预测化疗响应规避了在辅助情况(adjuvantsetting)中不监测任何总体疾病的问题。在经常接受重度治疗并且不可避免地获得耐药性和进展的转移性肿瘤中，p-irak1可以确定顺铂、吉西他滨乃至帕克替尼是否是可行的替代方案。为了使本发明能被充分理解并易于付诸实践，现在将仅通过非限制性实例来描述本发明的优选实施方案，该描述参照所附的说明性附图。简要附图说明在附图中：图1.乳腺癌中irak1过表达(a)tcga分析显示irak家族成员在不同亚型的乳腺癌和正常组织中的表达水平。正常，n＝22；基底细胞样型，n＝98；管状a型(luminala)，n＝232；管状b型(luminalb)，n＝129；her2，n＝58。(*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001，n.s，不显著，图基多重比较检验(tukey's多重比较检验)。(b)不同亚型乳腺癌中irak1蛋白表达的ihc分析。所示为irak1表达(左)的代表性ihc图像和定量(右)。(c)来自km绘图仪数据集的乳腺癌患者的无复发生存率、总生存率和无远处转移生存率的kaplan-meier分析。基于中位irak1mrna表达将患者分层为“低”和“高”irak1表达。图2.irak1敲低和药物抑制削弱tnbc细胞的侵袭性生长表型(a)一组乳腺癌细胞系中irak1和irak4表达的qrt-pcr分析。(b)irak1和irak4表达的蛋白印迹分析(westernblotanalysis)。以下显示相对于mcf10a的irak1表达的密度量化。(c)针对所示tnbc细胞系中磷酸化(t209)的免疫沉淀irak1的蛋白质印迹分析。(d)蛋白质印迹显示在有或没有多西环素(dox)处理的情况下可诱导的irak1(shirak1)或非特异性shrna(ns)的敲低效率。(e&f)用或不用dox(0.5μg/ml)处理的指定tnbc细胞以3d基质胶(3dmatrigel)和乳腺球(mammosphere)生长7天。比例尺，100μm。(g)散点图显示在携带细胞非特异性shrna载体对照(n＝6)或shirak1(n＝6)的雌性nod/scid小鼠中mb436和mda231异种移植肿瘤生长36天。(h)蛋白印迹显示免疫沉淀的总irak1中irak-inh(5μm)对p-irak1(t209)的作用。(i)irak-inh(5μm)对3d基质胶生长和乳腺球形成的影响，误差条代表平均值±sem，n＝3。*p<0.05，ns，不显著。图3.乳腺球形成需要irak1依赖性细胞因子分泌(a)使用或不使用dox(0.5μg/ml)处理进行irak1敲低的mb436shirak1细胞的乳腺球形成。cm，来自经模拟处理(mock-treated)的mb436shirak1细胞的条件培养基。量化(顶部)和代表性图像(底部)。比例尺，100微米。(b)在存在dox的情况下表达载体对照或shirak1的mb436细胞的生长培养基中细胞因子分泌的细胞因子抗体阵列分析(cytokineantibdodyarryprofiling)(左)。与载体对照细胞相比，shirak1细胞中il6、il8和cxcl1变化的量化(右)。(c)在存在dox的情况下，在所示mb436细胞中的nf-κb萤光素酶报告基因(reporter)活性。(d)显示在含或不含dox或来自经模拟处理的细胞的条件培养基的mb436shirak1细胞中il-6、il-8和cxcl1的分泌的elisa测定。(e)如所标明的，在dox或重组细胞因子单独或组合存在下的乳腺球形成测定。(f)elisa测定显示在所示表达载体对照或shirak1的tnbc细胞中il-8和cxcl1的分泌。(g)单独用dox或与来自mda231shirak1细胞的条件培养基(cm)一起处理的mb436shirak1细胞的乳腺球形成。(h)irak-inh(5μm)处理对所示tnbc细胞的细胞因子分泌的影响。误差线表示平均值±sem，n＝3。*p<0.05。图4.tnbc转移显示出增加的irak1表达/活性和irak1依赖性(a)显示由具有不同临床等级(等级1，n＝29；等级2，n＝136；等级3，n＝35)的200个乳腺癌肿瘤组成的施密特乳房群组(schmidtbreastcohort)(gse11121)中irak1mrna水平的散布图(左)，以及在具有不同临床等级(等级1，n＝14；等级2，n＝104；等级3，n＝28)的150个乳房肿瘤核心中的iram1ihc染色结果(右)。(b)来自两名患者的匹配的正常、原发和转移性肿瘤中irak1蛋白表达的代表性ihc图像(左)。显示在tma-imh364中irak1蛋白表达的散点图，包括9对配对的原发和匹配的转移性肿瘤，并用黑线表示(右)。(c)在单层、球形和3d基质胶条件下培养的mda231亲本和mda231-lm2细胞的相差显微镜图像。比例尺，100μm。(d)蛋白质印迹显示所示蛋白质的表达。(e)蛋白质印迹显示在不存在或存在il-1β(10ng/ml)的情况下24小时所示蛋白质的表达。(f)qpcr分析显示在(e)中处理的细胞中所示细胞因子的相对表达。(g)表达载体、shirak1或与用于挽救的异位irak1一起的mda231和mda231-lm2细胞的乳腺球形成测定。(h)使用或不使用irak-inh(5μm)处理7天的乳腺球和3d基质胶凝胶中的代表性相差图像(phasecontrastimage)。(i)用5μmirak-inh处理的mda231-lm2细胞的乳腺球生长，添加和不添加来自经模拟处理的mda231-lm2细胞的条件培养基(cm)。(j)(i)中所示细胞因子水平的elisa定量。(k)表达载体或异位irak1的mcf10a和hmel细胞的3d基质胶生长。比例尺，100μm。(l)(k)中细胞的乳腺球测定。(m)用重组il-1b(10ng/ml)处理3天的(k)中细胞的侵袭测定。*p<0.05，**p<0.01。图5.irak1既是必需的，又足以促进体内tnbc的生长和转移(a)代表性生物发光成像(bli)显示nod/scid小鼠中所示mda231-lm2细胞的乳房脂肪垫(mfp)异种移植肿瘤的生长(左)。散点图显示在第27天的肿瘤体积。(b)在(a)中收获的异种移植肿瘤上所示蛋白质的代表性ihc染色。(c)bli曲线显示(a)中的或用irak-inh(4mg/kg，qd，ip)处理14天的mda231-lm2细胞的肺转移发展。在第21天手术切除原发性肿瘤。在原发肿瘤切除前7天开始irak-inh治疗。(d)nod/scid小鼠的代表性bli图像和bli曲线显示来自尾静脉注射所示mda231-lm2细胞的d0至d29的肺转移。(e)全肺染色显示注射后6周代表性小鼠的转移性结节(上)和肺转移的离体bli(下)。(f)(e)中肺组织中所示蛋白质的ihc染色。(g)来自(e)的小鼠的kaplan-meier存活曲线。n＝8。p值表示对数秩(mantel-cox)测试。图6.irak1信号传导在获得性化疗耐药中的作用。(a)蛋白质印迹显示用5nm紫杉醇(ptx)处理24小时和48小时的mda231细胞中免疫沉淀irak1的p-irak1。(b)用5nmptx处理指定时间的细胞中所示细胞因子mrna的qrt-pcr分析。(c)在ptx(10nm)单层预处理96小时后表达载体或shirak1的mda231细胞的乳腺球形成测定。然后洗涤经ptx处理的细胞，接种活细胞进行乳腺球测定。(d)两对配对的临床原发性和化疗后复发性乳腺肿瘤中的p-irak1(s376)的ihc分析。(e)蛋白质印迹显示在mda231和sum159亲本和紫杉醇耐药性亚系(pr)中所示蛋白质。(f)如所示用预定的亚毒性剂量的紫杉醇(ptx)处理的亲本和耐药性亚系的细胞活力，5μmirak-inh或组合。(g)由使用紫杉醇，以及与或不与irak1、p38、jnk或ikkβ/nf-κb的所示小分子抑制剂(ps1145和bay117082)一起处理的sum159-pr(顶部)和mda231-pr(底部)细胞中的sub-g1细胞的facs分析所确定的细胞凋亡。(h)蛋白质印迹显示在(g)中处理的细胞sum159-pr细胞中所示分子信号传导事件。(i)概述了irak1在驱动tnbc中的转移和化疗耐药性中的作用。误差线表示平均值±sem，n＝3。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。图7.irak1敲除损害tnbc细胞的侵袭性生长(a)使用gobo数据库在51个乳腺癌细胞系中irak1和irak4mrna的表达谱(expressionprofile)。(b)蛋白质印迹显示表达非特异性载体对照(ns)或shirak1序列1和2(sh1和sh2)的bt549细胞中irak1的表达。(c)表达对照(ns)或shirak1的tnbc中gfp阳性细胞随时间的百分比。(d)在第26天所示bt549细胞的显微镜图像。(e)用dox处理诱导irak1敲低的tnbc细胞中初级和次级乳腺球形成的量化。(f)响应于il-1β处理3天的tnbc细胞的侵袭测定。误差线表示平均值±sem，n＝3。*p<0.05。图8.irak1抑制剂处理对tnbc的作用(a和b)用5μmirak-inh处理一周的3d基质胶和乳腺球生长的量化。(c)3d基质胶生长测定法的代表性相差显微镜图像，显示irak-inh(5μm)处理一周后非癌mcf10a和hmle细胞系的形态。(d)对mb436和mda231细胞系进行il-1β和irak-inh(5μm)处理后在所示时间点的总irak1和p-irak1的蛋白质印迹分析。图9.tnbc转移细胞显示增加的irak1信号传导和irak1依赖性。(a)vandevijver乳房群组(左)和施密特乳房群组(schmidtbreastcohort)的分层分析将乳腺癌患者中irak1水平与5年转移发生率相关联。(b)mda231和mda231-lm2细胞中所示细胞因子mrna的q-pcr分析。(c)在mda231和mda231-lm2细胞的条件培养基中所示细胞因子水平的elisa测定。(d)表达ns或shirak1的mda231-lm2细胞的3d基质胶和乳腺球生长。(e和f)在rela敲除后mda231和mda231-lm2细胞的3d基质胶和乳腺球形成测定。图10.转移性mda231-lm2细胞生长需要irak1激酶活性(a)表达载体、异位irak1(ectopicirak1)和激酶失活突变体irak1的mda231-lm2细胞的单层、3d基质胶和乳腺球生长。(b)(a)中mda231-lm2细胞中所示细胞因子的elisa测定。图11.异位irak1足以驱动非癌性乳腺上皮细胞的侵袭性生长。(a)过表达空载体或异位irak1的mcf10a细胞的细胞增殖。(b)软琼脂测定。(c)il6、il8和cxcl1mrna的qrt-pcr分析。**p<0.05，误差线代表平均值±sem，n＝3。图12.获得性化疗耐药中的irak1信号传导(a)用紫杉醇(ptx)和长春新碱(vcr)处理3天的mda231细胞中所示细胞因子mrna的qrt-pcr分析。(b)条形图显示mda231和sum159细胞亲本和紫杉醇耐药品系(pr)中紫杉醇的ec50。(c)用ptx、irak-inh或二者处理的sub-g1中细胞的facs分析所确定的细胞凋亡。(d)用vcr、irak-inh或二者处理的ptx耐药性细胞的凋亡。(e)所治疗的mda231-pr细胞中所示细胞因子的elisa测定。误差线表示平均值±sem，n＝3。图13.人参皂甙ck化合物对tnbc的作用(a)蛋白质印迹显示ck(25μm)对mda231-lm2细胞的p-irak1的作用。(b)ck对mda231和mda231-lm2细胞的乳腺球生长的作用。(c)细胞活力测定显示在mda231和mda231-pr细胞中ck与ptx组合的作用。(d)在(c)中处理的细胞的凋亡。图14(a)和(b).新辅助化疗后5年无复发生存和总体生存的kaplanmeier生存曲线和经病理学反应分层。图15(a).ihc分析显示，在同一患者中，预处理样品(左)、化疗后残留肿瘤(中)和复发肿瘤(右)中阳性p-irak1染色增加。图15(b).在8例发生复发的er阴性肿瘤患者中p-irak1h评分的图形表示。治疗前和化疗后样品的h评分(p＝0.04)(左)；预处理样品和复发肿瘤的h评分(p＝0.05)(右)。c.另外8例无复发的er阴性肿瘤患者的p-irak1h评分的图形表示(p＝0.05)。图16.用紫杉醇(ptx)、多柔比星(doxorubicin，adr)，顺铂处理的mda231细胞中免疫沉淀的irak1的p-irak1的蛋白质印迹。(a).ptx(5nm)后p-irak1的诱导。(b).用ptx而不用adr(2μm)或顺铂(5μm)处理时p-irak1的诱导。图17.(a).ic50曲线显示在亲本和紫杉醇处理的mda-mb-231(mda231-pr)细胞中用紫杉醇(ptx)、长春新碱(vcr)、吉西他滨(gemcitabine)、多柔比星(adr)、顺铂、5-氟尿嘧啶(5-fu)和帕克替尼(pacritinib)处理后的细胞活力。(b).相对灵敏度的图形表示。(c).列出的ic50(m)结果显示使用ptx、adr和vcr的ic50曲线显著右移，表明耐药性。图18.用ptx和irak-inh(5μm)单独和组合处理的亲本和紫杉醇耐药性mda231细胞的细胞活力。实施例实施例1irak1是参与炎症响应的il-1/tlr信号传导途径的活化激酶，异常信号传导与癌症有关。此处，我们展示irak1在乳腺癌转移和复发中的意义。与管腔细胞系(luminalline)相比，irak1在tnbc中表达更高(p<0.01)，过表达相关且总体生存期短(对基底细胞样(basal-like)bl1、bl2和间充质样m、msl亚型进行评估)。irak1抑制减少增殖，3d基质胶生长和乳腺球形成。相反，更具侵袭性的亚系mda231-lm2中的irak1上调增强了肺转移并降低了小鼠模型的存活率。特别感兴趣的是我们观察到irak1信号传导参与了紫杉醇耐药性。irak1的抑制抑制了p38-mcl-1途径并下调了抗凋亡蛋白mcl-1，在对紫杉醇耐药的p-irak1过表达的md231细胞中产生大量凋亡。irak1活化似乎是紫杉醇特异性的，并且与其他非交叉耐药药物不同。irak1还激活nf-κb诱导的细胞因子产生，其继而富集aldh阳性细胞群并增强了乳腺球形成。这些被irak1抑制减弱。此外，我们还观察到在紫杉醇治疗后复发的7个肿瘤的6个中被上调的irak1的活性磷酸化形式，p-irak1(p<0.01)。过表达p-irak1的细胞虽然不再对增加剂量的紫杉醇有反应(显示出耐药性)，但对顺铂、吉西他滨和帕克替尼仍然敏感。因此，我们推测p-irak1可以甄别出紫杉醇耐药tnbc，它将从这些药物的进一步治疗中受益。顺铂和吉西他滨目前不是一线药物。正如geparsixto研究(thelancetoncology2014:15(7):747-756)中所见，临床前数据支持在tnbc中使用铂类药物(platin)，但临床医师对显著的毒性持谨慎态度。限制对p-irak1过表达的tnbc使用顺铂，其中预计会有良好的反应，可能会证明毒性。吉西他滨经常在转移性癌症中紫杉烷失败后使用。从概念上讲，当对一线药剂的反应不理想时使用替代非交叉耐药药剂与iii期ea1131试验相似，并且与日本create-x研究相比是更有针对性的方法。但是，在iii期ea1131中分层需要基因分析，而使用ihc可检测到p-irak1。材料和方法生存分析和分子亚型关联分析根据tcga研究网络(http://cancergenome.nih.gov/)产生的数据进行基于irak1-4基因表达的癌症亚型特异性irak1基因表达分析。kaplan-meier生存分析用于分析临床结果。使用gobo算法的固有设置在归一化交叉群组和平台(http://co.bmc.lu.se/gobo/)之后，在包括1789位患者的总共10个乳腺癌组群(chinbreast(genomicandtranscriptionalaberrationslinkedtobreastcancerpathophysiologies.cancercell10:529-541.)、gse11121、gse12093、gse1456、gse2034、gse2603、gse3494、gse5327、gse6532和gse7390)中对患者的无复发生存(rfs)、总体生存(os)和远处转移生存(dmfs)进行元分析(metaanalysis)(geneexpression-basedoutcomeforbreastcanceronline.plosone6:e17911)。然后基于低(0-50％)和高(50-100％)irak1基因表达将患者分成两组。在根据作者的原始文献基于转移事件的患者分层后，在oncomine数据集上进行了vandevijver乳房群组(agene-expressionsignatureasapredictorofsurvivalinbreastcancer.nengljmed347:1999-2009)和施密特乳房群组(gse11121)(thehumoralimmunesystemhasakeyprognosticimpactinnode-negativebreastcancer.cancerres68:5405-5413)分析的irak1基因表达分析。细胞系和试剂除了mda231-lm2(来自dr.yibinkang，princtonuniversity的礼物)(5)外，所有细胞系都从atcc(manassas，va)获得。使mda231、bt549、mcf7、t47d、bt474、mb361、mb415、mb436、hs578t和mb157乳腺癌细胞系在补充有10％胎牛血清(fbs)的dulbecco改良的eagle培养基(dmem)中生长。将skbr3细胞维持在mccoy's5a培养基中。多西环素(doxycycline)购自clontech。将hcc1806和hcc1937维持在补充有10％fbs的rpmi培养基中。hmec和mcf10a正常乳腺上皮细胞系购自atcc(manassas，va)，并且在补充有5％马血清、20ng/mlegf、0.5mg/ml氢化可的松、100ng/ml霍乱毒素，10μg/ml胰岛素和青霉素/链霉素(invitrogen)的dmem/f12中培养。所有培养基补充有5000u/ml青霉素/链霉素(invitrogen)。所有细胞都保持在37℃和5％co2下。将细胞以0.5μg/ml的终浓度处理48-72小时以诱导irak1的敲低。为了建立紫杉醇获得性耐药tnbc(paclitaxelacquiredresistanttnbc)细胞系，使用sum159pt和mda231细胞。sum159pt对紫杉醇的内在ec50为3.88nm，并且从5nm开始处理。一旦细胞从处理中恢复并再次显示正常生长速率，浓度增加2倍。在这些处理周期中，只有具有高固有耐药性的细胞或对药物产生获得性耐药性的细胞存活。进一步重复该循环直至稳定的耐药性细胞系(sum159pr或mda231pr)。sum159pr细胞稳定地保持在1μm紫杉醇的完全培养基中和mda231在75nm紫杉醇的完全培养基中，使得它们的耐药性比其亲本细胞系至少高～1000倍。重组il-1β、il-6、il-8和cxcl1购自peprotech(rockyhill，nj)。紫杉醇(catno：t7402)、长春新碱(catno：v8879)、多柔比星(catno：d1515)和irak抑制剂(catno：i5409)购自sigma-aldrich(stlouis，mo)。scio469(p38抑制剂，catno:1671)，ps1145(ikk抑制剂，catno:1568)，bay-11-7082(ikk抑制剂和抗炎剂，catno:2132)和aeg3482(jnk抑制剂，catno:1291)购自axonmedchem(reston，va)。化合物k是人参皂甙rb1的代谢产物，购自chengdumustbio-technologyco.(chengdu，china)。免疫组织化学(ihc)许多报道的生物标志物需要用于检测的基因检测。虽然福尔马林固定石蜡包埋组织中的ihc在临床实践中更为常见，但许多研究人员更喜欢基因检测，因为这些检测方法具有定量性，且不易因标准化和解释问题而导致结果变化。但是，基因检测需要专门的设备和培训，而且很多人负担不起。在我们的患者中oncotypedx检测的摄取量低很好地表明了这一点。尽管oncotypedx将使得一些女性避免化疗，但只有20％的我们的患者选择了它。大多数人根本无法负担检测；作为比较，oncotypedx的费用为5,000新元，her2neufish的费用为300新元，er/pr/her2染色的费用为100新元。ihc检测到的生物标志物(er/pr/her2)仍然是最实惠和最经济的。自动化免疫染色机已经从技术因素中减少了很多变化。严格遵守方案和质量控制可以减少由于次优固定、抗原提取不足、不同抗体克隆、不同抗体稀释度和不同评分系统引起的变化(variability)。ihc的结果足够可靠，可用于治疗决策。在本发明中，乳腺癌组织微阵列载玻片(breastcancertissuemicroarrayslide)br1505和imh-364分别购自usabiomax(rockville，md)和novusbiologicals(littleton，co)。用购自santacruzbiotechnology(dallas，tx，cat:sc7883)的irak1抗体(克隆h-273)探测总irak1表达。irak1敲低和过表达构建体利用来自gipz慢病毒shrna系统(thermoscientific，ma)的两种不同序列(v3lhs_635467和v3lhs_635469)在各种tnbc细胞系中组成型敲低irak1。为了诱导性敲低irak1，如所述使用来自靶向irak1的3-utr区域的tripz多西环素(dox)-诱导型慢病毒shrna系统的shrna(v2ths-132369)(来自drdanielt.starczynowski,universityofcincinnati的礼物)。在补充有嘌呤霉素(1μg/ml)的完全培养基中维持组成型和诱导型shirak1稳定细胞以选择阳性克隆。以0.5μg/ml的终浓度使用多西环素(clontech，ca)48-72小时以诱导irak1的敲低。用于敲低irak1的shrna的特定靶向序列总结于下表中。为了产生irak1过表达质粒(irak1oe)，通过pcr从正常乳房组织对照扩增irak1的c-dna(转录物1，登录号:nm_001569.3)，并将其插入基于gfp的表达载体pbabemnires(pmn载体，来自lzpenn,universityoftoronto,canada的礼物)。quikchange多位点定向诱变试剂盒(安捷伦)使用由制造商推荐的工具quikchangeprimerdesign计算得到并含有所需突变的引物，用于将残基k239改变为丝氨酸(k239s)以使irak1的激酶活性失活。定量聚合酶链式反应(qpcr)通过使用qiazol(lifetechnologies，carlsbad，ca)分离总rna并用rneasymini试剂盒(qiagen，valencia，ca)纯化。使用highcapacitycdnaarchive试剂盒和kapasybrfastqpcr试剂盒(kapabiosystems，wilmington，ma)进行逆转录和定量pcr试验。为了定量mrna水平，将18s水平用作内部对照。所有反应均在96孔板格式的appliedbiosystemsprism7500fastreal-timepcr系统中分析。实时引物序列如下所列：基因正向引物5'→3'反向引物5'→3'18scgaacgtctgccctatcaacttacccgtggtcaccatggtairak1tcagctttggggtggtagtgtagatctgcatggcgatgggirak2tctcacccccaaacttgctccctcggccaacactattccairak3gcctggcagagagactttcaaggactcaacactgctccatagirak4agcttgcagcaatggttgactgtgccaagaaagtggtggail-1βgccaatcttcattgctcaagtgtggtcggagattcgtagctggil-6agttcctgcagaaaaaggcaaagaaagctgcgcagaatgagatil-8accggaaggaaccatctcacggcaaaactgcaccttcacaccxcl1ccagctcttccgctcctccacggacgctcctgctg蛋白质印迹和抗体如前所述进行蛋白质印迹(8)。irak1(catno:#4359)、irak4(catno:4363)、切割的parp(catno:#9541)、p38mapk(catno:#9212)、磷酸化p38mapk(t180/y182)(catno:#9211)、磷酸化nf-κbp65(s536)(catno:#3031)购自cellsignaling(danvers，ma)。磷酸-irak1(t209)抗体购自assaybiotech(sunnyvale，ca，catno:a1074)和磷酸-irak1(s376)抗体来自genetex(irvine，ca，catno:gtx50994)。mcl-1抗体购自santacruzbiotechnology(santacruz，ca，catno:sc-819)。肌动蛋白购自sigma-aldrich(stlouis，mo，catno:a5441)。用chemidoctmmp成像系统(bio-rad，hercules，ca)进行条带的检测，并且用imagelab软件(版本4.1，bio-rad，hercules，ca)对条带进行进一步的密度测定分析。免疫共沉淀(co-ip)如先前所述进行co-ip(9)。用ne-per试剂盒(piercebiotechnology)提取全细胞裂解物，并使用2μg全-irak1抗体(santacruzbiotech，santacruz，ca，catno:sc-7883)进行免疫沉淀。使用蛋白a-琼脂糖珠(roche)捕获沉淀的蛋白质复合物并用洗涤缓冲液(50mmtris-hcl，150mmnacl，0.1％triton)充分洗涤。将沉淀的蛋白质与3mmdtt一起溶于sds样品缓冲液中，并进行免疫印迹分析。使用磷酸-irak1(t209)(assaybiotechnology，sunnyvale，ca，catno:a1074)进行检测。elisa测定和细胞因子抗体阵列使用elisa测定试剂盒(bosterbio，pleasanton，ca)评估il-6、il-8和cxcl1水平。在培养10天后收集乳腺球(mammosphere)形成测定的上清液。根据制造商的方案在量化细胞因子的量之前对上清液进行1:50稀释。对于细胞因子抗体阵列，在培养10天后从ns或shirak1mb436乳腺球收集的上清液直接使用而无需进一步稀释。使用raybioc系列人细胞因子抗体阵列c1000(c-serieshumancytokineantibodyarrayc1000，raybiotech，inc.，norcross，gs，catno:#aah-cyt-1000-2)对上清液中的120种人类细胞因子和趋化因子进行半定量检测。根据制造商的说明。用chemidoctmmp成像系统(chemidoctmmpimagingsystems，bio-rad，hercules，ca)进行点的检测，并且使用imagej软件通过光密度分析对点的强度进行量化。提取未加工的数字光密度测定数据，并在将每种细胞因子的信号针对每种细胞因子阵列中的阳性对照信号标准化之前进行背景扣除。细胞增殖测定和流式细胞术(碘化丙锭染色)对于细胞增殖测定，首先通过以96孔格式检查广泛接种密度的生长以鉴定允许7天增殖的条件，对于所有细胞系根据经验确定最佳细胞接种。然后在sirna或药物处理之前24小时以最佳接种密度接种细胞三次。将平板在37℃，5％co2下温育7天。然后用celltiter-glo(ctg)(promega，madison，wi)裂解细胞，并在第0、1、3、5和7天用酶标仪检测化学发光信号。另外，在药物或sirna添加(t0)时收获未处理的细胞板以定量细胞的起始数量。7天治疗后获得的ctg值以t0值的百分比表示，并与治疗时间作图。通过dna含量定量进行细胞周期分析以量化反映细胞死亡程度的亚g1群体。简而言之，将细胞用70％乙醇固定并用碘化丙啶(50μg/ml)染色进行染色。通过facscalibur(bdbioscience)分析染色的细胞并通过使用cellquest软件(bdbioscience)进行定量。3d基质胶分析在37℃下用7.6mg/ml减少了生长因子的基质胶(falcon，cat:354230，falcon)预涂8孔腔室载玻片(falcon，cat:354656，falcon)达30分钟。对于mda231为大约5×103个，对于mb436和mb468为1×104个，对于具有所示处理的bt549为1.5×104个细胞用含有10％(体积/体积)fbs和150μg/ml基质胶的dmem接种到每个孔中。每3天补充培养基，在10-14天的持续时间内通过每3天成像监测细胞生长。乳腺球形成测定活性生长细胞用0.05％胰蛋白酶处理10分钟，然后通过0.4μm细胞过滤器以获得单细胞悬浮液。将细胞(mda231：1×104；mb436：3×104；mb468：4×104细胞/孔，bt549：3×104，mda231-lm2：3×104)接种在6孔超低附着板(corning，corning，ny，cat:cls3471)中的补充有新鲜氢化可的松(0.5μg/ml)和肝素(1:500)mammocult培养基(stemcelltechnologies，vancouver，bc，canada)中。在计数和拍照之前，将肿瘤球培养7天。使用gelcounttm设备和相关软件(oxfordoptronix，abingdon，uk)完成成像和定量。对于肿瘤球连续传代的形成测定，通过温和离心收集球体，分离成单细胞用于每14天传代肿瘤球并计数。在用int染色后，使用gelcount菌落计数器在7-12天后对肿瘤球进行照相和定量。贴壁非依赖性集落(anchorage-independentcolony)形成测定实验在涂布有含0.6％琼脂的dmem底层的6孔板中进行，细胞以10,000细胞/孔的密度接种在含有0.3％琼脂、10％胎牛血清的dmem中14天。将集落用氯化碘硝基四唑(int，sigma，st.louis，mo)过夜染色。根据制造商的说明使用gelcount(oxfordoptronix)分析集落的数量和大小。transwell侵袭检测根据制造商建议的方案，使用孔径8μm的24孔fluorobloktranswell插入物(falcon，dallas，tx)进行transwell侵袭测定。简言之，插入物在37℃下以600μg/ml的浓度用减少了生长因子的基质胶(bdbiosciences，cat:354230falcon)预包被6小时。然后将5×104个细胞接种到含有0.25％fbs的dmem作为血清饥饿培养基中的每个插入物中。在小室外添加补充有0.5％fbs和100ng/mlegf的dmem作为化学引诱剂。通过使用3.7％甲醛温育48小时后将侵入的细胞固定并用25μg/ml碘化丙啶(sigma-alrich)染色。以每个插入物10个场(10fieldsperinserts)进行扫描，用cellomicsarrayscan计数侵袭细胞的数量。aldefluor测定allefluor测定使用制造商推荐的方案(aldefluor试剂盒，stemcelltechnologies；catno:#01700)进行。简言之，将100万个单细胞悬浮液离心并重悬于试剂盒中提供的aldefluor测定缓冲液中。在0.15mmaldh底物存在下，将每种样品细胞与或不与aldh特异性抑制剂15mm二乙基氨基苯甲醛一起温育。在37℃温育25分钟后，使用facscalibur流式细胞仪系统(bdbiosciences)的异硫氰酸荧光素通道检测aldefluor染色。二乙氨基苯甲醛抑制剂对照样品用作分选标准(sortinggate)反映每个细胞系的背景荧光水平。双重萤光素酶报告基因分析nf-κb特异性报告基因质粒pgl4.32及其阴性对照pgl4.15购自promega(madison，wi)。转染48小时后收获细胞，并根据制造商的方案用双荧光素酶系统(promega，madison，wi)分析。为了分析萤光素酶活性，将pgl4.32/pgl.15的萤火虫信号归一化为相应样品中prl-null的海肾信号(renillasignal)。将pgl4.32/prl-空比进一步归一化为pgl4.15/prl-空比以获得针对所示细胞处理的基本转录活性的改变进行校正的归一化值。动物研究对于皮下异种移植模型，将7.5×106mb436细胞和携带多西环素诱导型shirak1的5×106mda231(每个细胞系n＝12)与基质胶(bdbiosciences，新加坡，cat:354234)以1:1比率在50μl总体积中混合。通过口服灌胃施用多西环素(doxycycline，100mg/kg，b.d)(clonetech，mountainview，ca)以在shirak1组中诱导irak1敲低(n＝6)，而对照组给予pbs(n＝6)。每周用游标卡尺测量肿瘤，并用以下公式计算肿瘤体积：v＝w×w×l/2。对于正交异性乳房脂肪垫模型，将1×106个携带pmn载体、shirak1和irak1挽救(rescue)(每组n＝8)的mda231-lm2细胞与基质胶(bdbiosciences，singapore，catno:354234)以1:1比例在20μl总体积中混合。细胞在第0天植入6-8周龄雌性nod-scid小鼠的乳房脂肪中。通过腹膜内(i.p)注射，从第20天至第37天每天施用irak-inh(4mg/kg，n＝6)。通过游标卡尺每周测量原发性乳房肿瘤，并且在第27天手术收取原发性肿瘤之前用以下公式计算肿瘤体积：v＝w×w×l/2。测量收取的肿瘤的质量和尺寸。通过生物发光成像(bioluminescenceimaging)每周监测肺转移发展。对于全肺的离体成像，首先通过吸入二氧化碳处死小鼠，并立即收取肺。在用ivis成像系统(xenogen，alameda，ca)成像之前，将肺单独浸入150μg/mlpromegavivoglotm荧光素(madison，wi)的pbs溶液中5分钟。对于尾静脉异种移植模型，在6-8周龄的雌性nod-scid小鼠中，通过侧尾静脉注射携带pmn载体和irak过表达(每组n＝10)的1×105个mda231-lm2细胞。通过生物发光成像每周监测肺转移发展。对于生物发光成像，将150mg/kgpromegavivoglotm荧光素的pbs溶液腹膜内(i.p)给予小鼠并用ivis成像系统(xenogen，alameda，ca)成像直至注射后6周。使用livingimage3.1记录光子值。组间和处理间的差异通过anova然后进行student’st检验(***p<0.001；ns.s.，不显著)来确定。误差线表示平均值±sem。使用kaplan-meier分析产生动物存活曲线，并且如先前在procnatlacadsciusa110:11121-11126中所述使用graphpadprism软件(版本6.0)通过log-rank(mantel-cox)测试计算统计参数。患者衍生的异种移植(pdx)小鼠模型也可以用从新诊断患有tnbc的患者获得的新鲜肿瘤产生。我们的目标是从手术和活检中收集治疗初治的肿瘤，以及新辅助化疗后治疗的肿瘤。在一个实施方案中，可以产生10个成功的tnbcpdx模型并计划200个nsg小鼠(假设30％摄取，并且考虑到随后的传代)。从核心活组织检查(2个核心)或手术(2个5mm立方体)收集的新鲜肿瘤组织可以在新鲜培养基中转移至实验室，用补充有抗生素-抗真菌药(invitrogen，cat15240-062)的磷酸盐缓冲盐水洗涤，置于冰上切碎成2mm立方体，并在无菌条件下原位移植入8-12周龄nsg小鼠(nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj，jacksonlaboratorywest，sacramento，ca，usa)的乳房脂肪垫中。成功的异种移植通常会在3至6个月后出现。已建立的异种移植物从小鼠传至小鼠以扩大数量。将一部分异种移植物保存为新鲜冷冻材料用于表征，并且将一部分固定并处理用于与原始肿瘤的组织学相关。异种移植肿瘤的免疫组织化学染色(ihc)将收取的组织固定在10％福尔马林溶液(ht501128，sigma-alrich)中。将组织脱水并包埋在石蜡中。将石蜡包埋的组织切片(5μm厚)切割，去石蜡并再水化，并使用ph6柠檬酸钠回收抗原。然后将切片在室温下在0.06％过氧化氢中温育以阻断内源性过氧化物酶。将载玻片与来自santacruzbiotech(santacruz，ca)的抗irak1(catno.:sc-7883)、抗波形蛋白(catno.:sc-6260)和来自abcam的抗il6(cambridge，ma，catno:ab1543670)温育过夜，然后用抗小鼠igg/兔igg(cat.no.pk-6200)温育60分钟，并且用抗生物素蛋白dh(avidindh)和生物素化辣根过氧化物酶h处理60分钟。immpacttmdab过氧化物酶底物(catno:sk-4105)用作发色团。使用苏木精qs(h-3404)用作对照。tma和临床样品的免疫组织化学染色(ihc)乳腺癌组织微阵列载玻片br1505和imh-364分别购自usbiomax(rockville，md)和novusbiologicals(littleton，co)。原发性和复发性肿瘤的石蜡包埋切片获自新加坡tantockseng医院和johnwayne癌症研究所(ca，usa)。组织微阵列和临床样品的染色和图像分析由新加坡科学技术研究机构分子和细胞生物学研究所(a*star)的组织病理学部门进行。简言之，将石蜡包埋的组织切片和tma脱石蜡，再水合，用蛋白酶k溶液回收抗原；然后将切片在室温下在3％h2o2中温育以阻断内源性过氧化物酶。在以1:100稀释两种抗体后，将载玻片在来自santacruzbiotech(santacruz，ca，catno:sc-7883)的总irak1抗体或来自genetex(irvine，ca，catno:gtx50994)的磷酸-irak1(s376)抗体中温育45分钟，随后用抗小鼠标记聚合物(dako，ca)温育30分钟。通过包含同种型特异性igg作为阴性对照确定免疫染色的特异性。检测系统是dab+底物-色原体溶液(dab+substrate-chromogensolution)(dako，ca)。切片用苏木精复染。使用leicascn400载玻片扫描仪(leicamicrosystems，germany)以20×扫描载玻片。图像被导出到slidepathdigitalimagehub(leicamicrosystems,germany)进行查看。使用slidepathtissueia软件(leicamicrosystems，germany)的measurestainedcells算法分析组织微阵列核心。然后将总细胞h评分进一步归一化，并且在用下列公式转换后表示为z评分，z＝所有肿瘤的(每个肿瘤平均h评分的总细胞h评分)/sd。数据使用microsoftexcel进行整理。扫描和图像分析由新加坡imcb先进分子病理学实验室(advancedmolecularpathologylaboratory,imcb,singapore)完成。统计分析除非另有说明，所有体外实验重复至少三次，数据以平均值±sem报道。为了使每个患者队列的表达归一化，通过计算每个独立数据集的z-分数来归一化表达值，通过使用student'st检验的双尾students'(two-tailedstudents')或使用graphpadprism6软件用于评估多组比较的单因素anova(one-wayanova)来评估差异。使用kaplan-meier分析绘制动物研究存活曲线，并使用graphpadprism通过log-rank(mantel-cox)测试计算统计参数。在所有统计测试中，除非另有说明，否则得出的p≤0.05均被认为是显著的结果初步研究我们对从2006年1月1日至2013年12月31日接受新辅助化疗的159例连续非转移性肿瘤患者进行了回顾性分析。多数患者(84％)残留有侵袭性疾病(pcr低于文献报道，因为许多患者患有iii期疾病)。er阴性肿瘤的反应率较高(14％vs5％)。生存与病理反应相关(图14)。表1.159名接受新辅助化疗的患者的详情。*在接受手术的141名患者中(16名拒绝手术，2名外国人回国接受手术)我们评估了8例接受新辅助化疗(包括紫杉醇的方案)及随后发生复发性疾病的er阴性肿瘤患者。在6例中，化疗后残留肿瘤中的p-irak1染色更为强烈(p＝0.04)(图15a和b)，这与更短的中位复发时间(15.6个月vs29.0个月)和降低的总体生存率(45.5个月vs65.9个月)相关。与原始肿瘤相比，在复发肿瘤中也观察到更高的p-irak1水平(图2b)。另一方面，在没有复发的患者中，p-irak1水平倾向于在化疗后减少(图15c)。总之，这些支持了我们的假设，即p-irak1诱导与紫杉醇耐药性相关并预测复发。[这8名患者是159名患者研究的一部分吗？]在暴露于紫杉醇48小时后，在亲本mda-mb-231细胞中观察到p-irak1的显著诱导，其表达低水平的irak1(图16a)。这在非交叉耐药试剂多柔比星(adr)和顺铂(图16b)中没有见到，由此表明irak1激活对获得性紫杉醇耐药性是特异的。细胞因子il1b、il6和il8在用紫杉醇治疗后诱导，导致aldh阳性细胞群的扩增和增强的乳腺球形成。irak1敲低后这些作用明显受损，表明irak1在获得性紫杉醇耐药中的作用。接下来，我们比较了亲代和紫杉醇处理的mda231细胞(推测为紫杉醇耐药)对乳腺癌方案中普通药物和irak1抑制剂帕克替尼的敏感性。过度表达p-irak1的经紫杉醇处理的mda231细胞明显对紫杉醇有耐药性，对多柔比星和长春新碱也有较低程度的耐药(图17)。然后将紫杉醇耐药细胞暴露于：1)紫杉醇，2)顺铂，3)吉西他滨，和4)紫杉醇和帕克替尼(在上述优化的剂量下)。将比较试剂(如上所述)对p-irak1的诱导和细胞存活力，以确定对任何一种试剂的应答是否可以通过tnbc亚型或p-irak1水平进行分层。这对于允许临床医生在给定的临床情况下选择最合适的药剂很重要。紫杉醇耐药细胞对顺铂、吉西他滨和帕克替尼敏感。有趣的是，对5-氟尿嘧啶的反应在亲本和紫杉醇耐药细胞中都很差。irak1抑制剂irak-inh本身对紫杉醇耐药mda231细胞没有影响，但与紫杉醇联合产生戏剧性的细胞死亡(图18)。我们证明这主要是通过抑制p38-mcl-1信号传导来介导的。nf-κb诱导的il-6、il-8和cxcl1细胞因子的产生也受到影响，但不直接诱导细胞凋亡。irak-inh和紫杉醇的协同作用表明irak1抑制可能克服紫杉醇耐药。irak1，而不是其他irak基因，在乳腺癌的一个子集中过表达，并且预示着不良预后在寻找可能在乳腺癌中异常表达的nf-κb相关炎性基因网络的上游分子调节剂时，我们查询了癌症基因组图集(thecancergenomealtas，tcga)数据库并鉴定出与正常乳腺上皮组织相比，不同亚型的乳腺肿瘤中白细胞介素1受体相关激酶1(irak1)的上调(图1a，p<0.0001，tukey's多重比较检验)。然而，其他三位irak家庭成员没有表现出这样的变化(图1a)。值得注意的是，与其他亚型的乳腺肿瘤相比，基底乳腺肿瘤(basalbreasttumor)中的irak1表达特别高(图1a，p<0.0001，tukey's多重比较检验)。两组组织微阵列(tma)(br1505和imh364)的免疫组织化学(ihc)分析由两组独立的具有不同分子亚型的乳腺浸润性导管癌样本组成，证实了相比正常组织，所有乳腺癌亚型中irak1蛋白表达的上调，特别是在tnbc中(图1b)。为了探索irak1在临床结果中的作用，我们使用gobo数据库进行元分析(meta-analyse)来研究irak1表达与疾病进展和患者生存之间的关系。结果显示高irak1表达与减少的无复发生存，总生存和无远处转移生存相关(分别为p＝2.1×106，p＝0.0047，p＝0.017，图1c)，表明irak1在乳腺癌中的预后价值。综上所述，这些发现表明在乳腺癌中，特别是在tnbc中irak1失调的潜在作用。这些发现确实暗示了irak1在任何情况下在乳腺肿瘤发生中的潜在作用。irak1的遗传和药理学失活有效地消除了高表达irak1的tnbc细胞的侵袭性生长为了检查乳腺癌临床样品中的上述发现是否可以在体外乳腺癌细胞系中类似地发现，我们分析了一组14个管腔来源和基底来源(luminalandbasalorigin)的乳腺癌细胞系以及两个非癌性乳房上皮细胞系mcf10a和hmec。rt-pcr分析显示与mcf10a和hmec相比，irak1mrna在80％的乳腺癌细胞系中上调，其中相比管腔细胞系，irak1表达明显在基底细胞系中更富集(图2a)。为了比较，具有激酶活性的另一irak家族成员irak4没有显示出一致的在管腔细胞系和基底细胞系之间的变化(图2a)。包含55个乳腺癌细胞系的表达数据的gobo数据库分析(www.gobo.com)也获得了类似的结果(图7a)。蛋白质印迹分析证实了rt-pcr结果，并且再次显示了相比管腔细胞系，基底细胞系中irak1蛋白质表达水平更高，而这在irak4中没有观察到(图2b)。我们进一步表明与irak1-低表达的mda-mb-231细胞(下文中称为mda231细胞)相比，具有更高水平的irak1的三个基底/tnbc细胞系bt549、mb436和mb468也显示更高水平的磷酸化irak1(t209)，这表明irak1表达水平与其活性相关(图1f)。为了研究irak1在tnbc中的功能性作用，我们使用独立表达绿色荧光蛋白(gfp)的两种独立小发夹rna(shrna)构建体在表达高或低irak1水平的tnbc细胞系中敲低irak1表达。在高表达irak1的bt549和mb436细胞中，irak1敲低仅在第7天对细胞增殖产生适度影响，但延长培养至第20天导致gfp阳性细胞逐渐消耗，但这在irak1-低表达mda231细胞中未见(图7b-d)。这表明irak1在赋予tnbc细胞增殖优势方面具有作用，尽管在单层培养中没有看到。我们接下来试图确定irak1敲低对tnbc侵袭性生长表型，如3d基质胶生长和乳腺球形成的影响。为了便于研究，我们使用了多西环素(dox)诱导型shrna系统，其中添加多西环素导致irak1消耗(图2d)。敲低irak1导致在irak1高表达细胞(bt549、mb436和mb-468)中对无血清悬浮培养物中3d基质胶生长和乳腺球形成的强烈抑制，但是在表达低水平irak1的mda231细胞中无效(图2e、图2f和图7e)。此外，mb436和bt549细胞中il-1β-引起的基质胶细胞侵袭在irak1敲低后也显著受损(图7f)。相反，mda231细胞不响应il-1β处理，因此对irak1敲低不敏感(图7f)。这些体外效应也在体内看到，例如在mb436中，但在mda231中未见，携带irak1shrna的异种移植肿瘤在nod/scid小鼠中表现出大大减少的生长(图2g)。总之，我们的研究结果证实了irak1在体外tnbc细胞的侵袭性生长和体内致瘤性中的不可或缺的作用。最后，我们求证irak1的药理学抑制是否重演irak1基因敲低表型。irak-inh是市售的irak1/4抑制剂，最近已显示它在骨髓增生异常综合征中具有针对irak1的有效活性20。正如所料，irak-inh处理有效地消除了tnbc细胞中的p-irak1(图2h)，导致显著抑制了bt549、mb436和mb468细胞的3d基质胶和乳腺球生长，但mda231细胞没有受到影响(图2i和图8a-2b)。它对非癌mcf10a和hmle细胞也没有影响(图8c)。mda231细胞缺乏对irak-inh的敏感性可能表明这些细胞中il-1βirak1信号传导不足。事实上，用重组il-1β处理诱导了irak-inh敏感的mb436细胞中的p-irak1的快速诱导，其被irak-inh处理消除，而相同的处理在mda231细胞中未引起类似的响应(图sd)。总之，这些数据表明，irak-inh具有活性对抗表达高水平的irak1并且擅于il-1/irak1信号传导的tnbc。irak1定向激活nf-κb和相关细胞因子的产生是tnbc乳腺球生长所需的功能。鉴于之前的研究显示nf-κb依赖性细胞因子产生在支持乳腺癌csc中的作用14,24,25，我们推断在irak1敲低后减少的乳腺球生长可能由细胞因子产生减少引起，因此应该通过未处理细胞的条件培养基来解救(rescue)。实际上，将对照mb436球体细胞(spherecell)的上清液添加至irak1耗尽的mb436细胞恢复了球体生长能力，这支持了irak1调节的细胞因子产生对于支持tnbc细胞的csc生长可能是关键的。为了鉴定对于irak1调节的csc生长至关重要的细胞因子，我们使用了raybio人类细胞因子抗体阵列，并对具有和不具有irak1敲低的mb436细胞的条件性球体生长培养基进行定量细胞因子分析。我们鉴定了一些细胞因子，在irak1敲低后显示出产生的减少。其中，先前显示对乳腺癌csc重要的il-6、il-8和cxcl112,13,26作为在irak1敲低后最为丰富地被检测到并下调的前三种nf-κb相关细胞因子出现，(图3b)。一致地，敲低irak1导致nf-κb报告基因活性的显著抑制(图3c)。酶联免疫吸附测定法(elisa)证实，irak1敲低减少了mb436细胞的上清液中il-6、il-8和cxcl1的分泌，这在加入模拟处理细胞(mock-treatedcell)的条件培养基后恢复(图3d)。我们进一步显示，单独添加重组il-6、il-8或cxcl1不能恢复球体生长，而它们的组合足以实现这一点(图3e)。这些发现鉴定了irak1调节的细胞因子分泌在维持csc生长中的重要作用。值得注意的是，irak1消耗显著降低bt549和mb436中的细胞因子分泌，但在mda231中程度低得多(图3f)。我们推测irak1敲低后mda231细胞中剩余的细胞因子水平仍足以促进乳腺球形成。事实上，从mda231shirak1细胞收获的条件培养基足以完全挽救对mb436shirak1细胞的乳腺球形成的抑制(图3g)。因此，与具有高水平irak1的其他tnbc细胞不同，mda231细胞中nf-κb相关细胞因子的产生基本上更少地依赖于irak1，这可以解释mda231细胞对irak1消耗缺乏敏感性。与上述表型一致，我们看到irak-inh处理导致irak-inh敏感性tnbc细胞中il-8和cxcl1分泌的强烈降低，但是在irak1-inh耐药性mda231细胞中的程度小得多(图3h)。乳腺癌转移表现出irak1的表达增加和对irak1信号传导的生长依赖性增加鉴于irak1在侵袭性生长和乳腺球形成中的强烈作用，我们接下来评估了irak1表达与乳腺癌进展相关的临床相关性。我们发现irak1在低分化高级别(3级)肿瘤中的表达水平要比相对较好分化的1-2级肿瘤高得多，如通过oncomine分析和使用tmabr1505的免疫组织化学验证所显示的(图4a)。此外，如tmaimh-364中9个原发转移对中的6个所示(图4b)，irak1表达显示出从正常的邻近组织到匹配的原发和转移组织的逐渐增加，表明irak1表达与转移进展的关联。与此一致的是，两个独立的乳腺癌队列的oncomine分析显示出irak1表达与术后5年转移事件呈正相关(图9a)。为了概括上述体外临床观察，我们比较了mda231及其衍生的肺转移亚系mda231-lm227。尽管两个细胞系在单层生长中没有表现出明显的差异，但与mda231细胞相比，mda231-lm2细胞显示出更多侵袭性的表型，如3d基质胶和乳腺球生长所示(图4c)。有趣的是，与亲本mda231细胞相比，转移性mda231-lm2细胞显示总irak1和p-irak1以及p-p65nf-κb的水平增加(图4d)。它们还表现出增加的il-6、il-8和cxcl1的转录和分泌(图9b和9c)。值得注意的是，ilia和il1b以及编码il-1受体的il1r也在mda231-lm2细胞中表现出增加的表达(图9b)，表明增强的自分泌反馈环激活il-1/irak1信号传导。此外，与对il-1β处理无响应的亲代mda231细胞相比，mda231-lm2细胞现在通过显示强大的p-irak1和细胞因子诱导(图4e和4f)而对重组il-1β处理产生响应。这些结果表明转移性mda231-lm2细胞中il-1/irak1信号活性的获得(gain)。因此，靶向irak1的3'-utr的irak1shrna能够有效地抑制mda231-lm2细胞的3d基质胶生长和乳腺球生长(图9d)，并且这种抑制很容易被异位irak1挽救(图4g)。一致地，irak1-inh表现出irak1敲低的作用，仅导致mda231-lm2细胞中3d基质胶和乳腺球生长受损(图4h)。此外，将模拟处理的mda231-lm2细胞的细胞培养物上清液应用于irak1-inh处理的mda231-lm2细胞的培养物导致乳腺球生长的完全挽救(图4i)，其响应恢复的细胞因子水平(图44j)。重要的是，与选择性影响mda231-lm2细胞但不影响mda231细胞的irak1敲低不同，rela敲低消除了两种细胞系的侵袭性生长(图9e和9f)。这表明尽管nf-κb对于亲代和转移mda231都是重要的，但它已经对mda231-lm2细胞中的irak1获得优先依赖性，导致对irak1干扰的选择性敏感性。此外，以上下文相关的方式暗示出激酶功能和支架功能都参与irak1信号传导28，我们试图确定irak1的激酶活性是否是mda231-lm2细胞侵袭性生长所必需的。如图5k所示，异位野生型irak1在mda231-lm2细胞中的表达对单层生长没有明显影响，但增强了侵袭性生长表型。相反，在atp结合袋(k239s)中携带点突变的激酶死亡irak1(kinase-deadirak1)的异位表达诱导了对3d基质胶和乳腺球生长的强抑制作用，尽管对单层生长没有影响(图10a)。一致地，野生型irak1增加il-6、il-8和cxcl1的分泌，而irak1k239s产生相反的效果(图4b)。这些结果证实了irak1激酶活性在tnbc侵袭性表型中不可或缺的作用。最后，我们求证irak1在功能上是否足以实现积极的增长。我们研究了体外异位(ecotopic)irak1表达对非癌性乳房上皮细胞mcf10a和hmle细胞的影响。尽管mcf10a细胞中的异位irak1表达对细胞增殖只有适度的影响(图11a)，但它显著增强了软琼脂的生长(图11b)，表明其具有致癌转化的能力。异位irak1还增强了mcf10a和hmle细胞(图10l和slm)中的3d基质胶和乳腺球生长，并且诱导了il6、il8和cxcl1mrna的表达(图4c)。此外，异位irak1的表达极大地增强了mcf10a和hmle细胞中il-1β诱导的侵袭(图4n)。这些发现表明irak1在功能上足以使哺乳动物上皮细胞发生恶性转化和侵袭性生长。体内irak1的抑制抑制乳腺癌的生长和转移为了研究体内irak1是否对tnbc进展是必需的，我们评估了irak1敲低对nod/scid小鼠中的tnbc异种移植物乳房脂肪肿瘤生长和随后的肺转移进展的影响。为此，我们使用表达靶向irak1的3'-utr的irak1shrna的mda231-lm2细胞，以允许通过异位irak1进行功能性拯救。结果显示，与对照相比，携带表达irak1shrna的肿瘤的小鼠中原发性肿瘤生长显著降低，并且在携带表达irak1shrna和异位irak1的肿瘤的小鼠中完全挽救了该敲低作用(图5a)。尽管细胞增殖标志物ki67保持不变，但收获的肿瘤的免疫组织化学分析表明与对照肿瘤相比，irak1耗尽的肿瘤中il-8的表达降低(图5b)。为了评估肺转移，在21天后移除乳房脂肪肿瘤，并通过肺成像分析评估肺转移。还通过在肿瘤移除14天前7天施用药物来评估irak-inh对转移的作用。如图5c所示，irak1敲低和irak1-inh治疗均显著减少肺转移，并且通过异位irak1挽救敲低作用。这些发现表明irak1是tnbc肿瘤生长和转移进展所需的，irak1的药理学抑制能够消除转移进展。为了评估iral1过表达对转移的影响，使用nod/scid小鼠静脉内注射表达对照或异位irak1的mda231-lm2细胞。结果显示，通过体内和体外肺成像和全肺染色确定与载体对照相比，异位irak1导致肺定植和转移性结节的快速形成(图5d和5e)。受影响的肺的免疫组织化学分析表明在表达异位irak1的肿瘤中il-6的表达增加(图5f)。结果，与对照小鼠相比，携带异位irak1的小鼠遭受加速死亡(图5g)。总之，通过研究功能的损失和获得我们的结果证明了irak1在驱动乳腺癌生长和转移中的关键作用。化疗处理激活irak1信号传导，导致获得性化疗耐药性csc被认为对化疗后复发至关重要29。化疗能够通过诱导炎性细胞因子诱导csc再生，这一点已经越来越明显30-32。我们接下来调查了irak1信号是否参与化疗响应并有助于csc富集。将sum159和mda231细胞暴露于5nm紫杉醇48小时导致p-irak1的显著诱导(图6a和数据未显示)。它还诱导了mda231细胞中il1b、il6和il8mrna的表达，其在irak1敲低后显著受损(图6b)。这种作用不限于紫杉醇，因为在用长春新碱处理的细胞中也观察到类似的发现，其也用于晚期乳腺癌(图12a)。与csc形成中炎性细胞因子的作用一致，用10nm紫杉醇预处理4天的mda231细胞导致剩余活细胞的乳腺球形成能力增加，并且该效果在irak1敲低后受损(图6c)。这些结果表明irak1信号传导参与化疗响应并有助于化疗诱导的csc富集。与这种体外观察一致，5例原发性和匹配的化疗复发性乳腺肿瘤样品的ihc分析显示复发性肿瘤中的p-irak1表达与3例患者中匹配的原发性肿瘤相比增加，表明化疗诱导p-irak1的临床相关性(图6d)。已显示了irak1在tnbc中紫杉醇应答中的作用后，我们接下来试图确定irak1激活是否有助于tnbc获得对紫杉醇的耐药性。为此，我们使用mda231和sum159细胞系(表达低水平的irak1)并通过在三个月内逐步暴露于增加浓度的紫杉醇产生紫杉醇耐药细胞系(图12b)。正如预期的那样，所得到的紫杉醇耐药细胞系(pr)均显示增加的p-irak1和p-p65nf-κb(图6e)，表明获得紫杉醇耐药后tnbc细胞中irak1-nf-κb信号传导活性的获得。有趣的是，当与相应的亚毒性浓度的紫杉醇联合时，irak-inh诱导两种紫杉醇耐药细胞系中伴有大量细胞凋亡(图12c)的细胞存活率急剧下降，但在亲代细胞中不会(图6f)。紫杉醇耐药细胞也表现出对长春新碱处理的耐药性，并且irak-inh与长春新碱的组合对凋亡诱导也具有类似的作用(图12d)。这些结果表明，irak1的治疗靶向能够通过诱导大量细胞凋亡来规避化疗耐药性。我们接下来研究了irak-inh致敏紫杉醇诱导细胞凋亡的分子基础。虽然irak1-inh加紫杉醇导致紫杉醇耐药细胞中il-6、il-8和cxcl1的分泌减少(图12e)，但用两种ikkβ/nf-κb抑制剂ps1145和bay117082处理未能使紫杉醇对凋亡敏感图6g)。这表明除了nf-κb途径之外，还有与irak1参与的细胞凋亡诱导的调节有关的其他紫杉醇耐药性机制。p38/jnkmapk是irak1信号传导的其他下游效应子，已经表明会参与细胞凋亡调节33-35。与ikkβ/nf-κb抑制剂不同，我们发现p38抑制剂能够对irak-inh进行拟表型(phenocopy)，以敏化紫杉醇耐药细胞中的紫杉醇诱导细胞凋亡，尽管这种效应对jnk抑制剂并不明显(图6g)。与这些发现一致，irak-inh和p38抑制剂，而不是两种ikkβ/nf-κb抑制剂(ps1145和bay117082)能够与紫杉醇合作以降低p-p38和mcl-1表达，并且伴随着指示细胞凋亡的parp切割增加(图6h)。已知mcl-1被p38/jnk磷酸化和稳定以促进存活36。此外，mcl-1最近显示对于tnbc细胞的存活是至关重要的37。因此，这些发现与以前的报道一起提出irak1-inh致敏紫杉醇诱导细胞凋亡的一种机制是通过作用于抑制p38，其继而减少mcl-1，虽然我们并未完全排除nf-κb通路(pathway)参与这种情况。总之，这些发现表明irak1下游的nf-κb和p38-mcl-1信号传导可归因于化疗耐药性的逐渐发展。虽然前者可能主要涉及csc再增殖和自我更新，但后者与促进逃避化疗引发的细胞凋亡的生存机制有关。根据这些观察结果，我们推断与单独抑制nf-κb相比，irak1的治疗靶向可能是消除两者的更有效的策略，提倡为晚期tnbc的主要目标(图6i)。有趣的是，传统的东方药物人参产品人参皂甙rb1及其代谢物化合物k(ck)最近已被报道具有抑制irak1的能力，从而减少体外和体内的炎症响应38。因此，我们评估了两种人参皂甙抑制tnbc侵袭性生长和紫杉醇耐药性的能力。结果显示，是ck化合物而不是rb1能够模拟irak-inh以抑制mda231-lm2细胞中的p-irak1(图13)，消除mda231-lm2乳腺球生长(图13b)，并且与紫杉醇耐药性斗争(图13c和13d)。因此，从转译(translation)的角度来看，这表明人参产品可能应用于具有高水平irak1的晚期tnbc患者的转移和化疗耐药性，这可能值得进一步临床探索。讨论晚期乳腺癌经历远处转移复发的治疗方案有限。在本研究中，我们揭示了tnbc中先前未进行表征的调节(regulatory)机制，这种机制驱动侵入性生长、转移和化疗耐药。这项研究的一个主要发现是将irak1鉴定为可行的激酶靶标，其失活可以提供有效的治疗方法来解决当前未满足的临床需要。irak1是主要参与炎症响应的il-1/tlr信号传导通路的活化激酶。尽管il1信号和tlr-myd88与人类癌症有关，但先前并未将irak1变化(irak1alteration)本身与人恶性肿瘤联系起来，直至最近20,22,23。我们发现irak1在乳腺癌的一个子集，主要在tnbc中过表达，并且其表达与转移和存活不佳有关。与irak1在tnbc中的功能性作用相一致，只有表达更高水平irak1的tnbc细胞表现出对irak1耗尽或药物抑制的相当易感性，表明irak1还可以用作未来irak1靶向治疗的预测标记。irak1影响tnbc进展的能力似乎涉及nf-κb信号传导的调节，这通过irak1抑制后nf-κb报告基因(nf-κbreporter)活性降低和nf-κb靶标表达来证明。已知csc中的nf-κb活化维持干性(stemness)39,40。此外，nf-κb相关的细胞因子，如il-6、il-8和cxcl1，在tnbc肿瘤发生中起主要作用，包括生长、转移、化疗耐药以及癌症干细胞表型11,12,24。与匹配的原发性肿瘤相比，我们检测到转移性临床肿瘤样品中irak1表达增加很多。有趣的是，这于体外在mda231中重现，其表达低水平的irak1，但是当它们变成转移时表现出irak1的表达和活性增加，并且因此对irak1抑制变得更加敏感。这些发现表明转移性tnbc获得irak1依赖性，因此突出了irak1治疗靶向对转移性疾病的潜在效用。事实上，我们显示irak1-inn有效地阻止了体内的转移进展并延长了携带tnbc转移的小鼠的存活。尽管本研究集中于irak1驱动的细胞因子网络在癌细胞自主方式中的作用，但通过肿瘤浸润免疫细胞-肿瘤细胞相互作用的il-1介导的irak1活化可以进一步增强irak1体内致癌活性。因此，我们预计irak1的治疗靶向可能通过消除癌症内在和促进癌症的免疫应答而在体内特别有效，尽管解决这个方面在免疫缺陷小鼠中将在技术上是具有挑战性的。由于在患者中的严重毒性，用诸如ikkβ/rela抑制剂等治疗性干预措施直接靶向nf-κb信号传导已被证明是一种挑战18，因此抑制irak1作为靶向tnbc中nf-κb的替代方法对治疗处理具有重要意义。重要的是，irak1基因敲除小鼠显示正常表型，这与缺乏rela或ikk复合物的其他亚基(其由于肝细胞凋亡而具有胚胎致死性)的小鼠相反18,41。鉴于nf-κb及其对tnbc进展中irak1的依赖性的重要作用，我们推断irak1的治疗靶向可能能够实现癌症选择性，因此与nf-κb本身相比，其为用于减少tnbc或其他高irak1和nf-κb驱动的癌症的更易接近且更少危害的靶标。我们还确定了对tnbc中irak1的激酶活性的要求。已经表明，依赖于细胞类型和背景，irak1/4可以通过支架功能而不是通过激酶活性来增强炎症信号28。例如，虽然irak1/4激酶活性对于人类浆细胞样树突状细胞(pdc)活化是必需的，它在正常人b细胞、t细胞、树突状细胞和单核细胞中是不必要的28。此处，我们确认irak1激酶活性对于tnbc细胞的侵袭性是必需的，因为irak1的激酶失活突变体明显抑制tnbc细胞的侵袭性生长和乳腺球形成。这具有显著的治疗意义，因为irak1激酶活性的靶向抑制可允许特异性消除癌细胞中的irak1激酶活性，而不影响irak1在正常免疫应答中的支架作用(scaffoldingrole)。这项研究的另一个主要发现是鉴定irak1激活作为获得性化疗耐药的关键驱动事件。越来越多的证据已经开始阐明化疗诱导的炎性细胞因子或趋化因子表达在csc再增殖和可能的肿瘤复发中的关键作用12,22,30,31,42。在tnbc中，包括紫杉醇的化疗先前已经显示通过激活包括stat3、tgfβ和hif1的各种途径来诱导细胞因子分泌，例如il-6和il-832,42,43。此处，我们显示irak1信号传导也被化疗剂激活，包括广泛使用的那些紫杉醇、多柔比星和长春新碱，其有助于化疗诱导的细胞因子表达。因此，化疗诱导的乳腺球富集在irak1抑制后大大减弱。根据这些发现，我们显示具有获得性紫杉醇耐药性的tnbc细胞表现出增强的irak1活性，并且通过诱导大量细胞凋亡，抑制irak1能够对抗紫杉醇耐药性。值得注意的是，我们的模型中irak1抑制剂增强紫杉醇诱导的细胞凋亡的功效与其抑制p38mapk活性而不是nf-κb的能力有关。实际上，p38抑制剂类似地使紫杉醇能够诱导紫杉醇耐药细胞中的细胞凋亡，并且irak1抑制剂和p38抑制剂都诱导了抗凋亡蛋白mcl-1的下调。相比之下，ikkβ/nf-κb抑制剂与紫杉醇联合不足以诱导类似的凋亡响应。这一发现似乎与最近报道p38在支持tnbc细胞转移生长中的关键作用一致44。此外，根据细胞的环境(cellularcontext)，mcl-1可被p38磷酸化和稳定化以促进抗凋亡作用36，并且最近已被确定为支持tnbc细胞活力的关键存活因子37。因此，我们假设获得irak1-p38-mcl-1对获得性紫杉醇耐药性的依赖可能构成抵抗化疗诱导的细胞凋亡的关键机制。显然，nf-κb相关的细胞因子诱导和p38信号传导都涉及紫杉醇耐药。然而，它们对获得的耐药过程的贡献存在主要的功能差异。虽然前者被认为主要涉及csc扩张，但更需要后者维持生存能力。从转译的角度来看，irak1的治疗靶向可能是难治性tnbc的有效治疗选择，因为其足以阻断nf-κb和p38信号传导。鉴于细胞毒性化疗仍然是tnbc的护理标准，我们的发现为开发更有效且类似药物的小分子irak1激酶抑制剂用于靶向转移性和复发性tnbc肿瘤以改善化疗的功效提供了合理的依据。鉴于这种观点，我们发现天然产物人参皂甙复合物(ck)能够对irak-inh进行拟表型以抑制tnbc转移性生长并对抗化疗耐药性，这一发现令人感兴趣，因为它可以在表达高水平的irak1化疗难治性tnbc的临床试验中很容易地进行测试。总之，本发明代表了一种系统性方法来评估p-irak1作为将改善tnbc治疗和结果的临床相关生物标志物。除了验证p-irak1的预后能力(预测复发风险)之外，研究结果将增加tnbc的治疗选择。潜在地，p-irak1可鉴定紫杉醇耐药tnbc用于进一步用顺铂或吉西他滨治疗以降低复发的高风险。本发明重新定义了顺铂和吉西他滨的益处并且可以使它们更有效地被使用。需要进行大型前瞻性研究的进一步验证，但由于顺铂和吉西他滨都已用于乳腺癌，临床上的转译可望在不久的将来进行。本发明还提供关于irak1作为新型治疗靶标的潜力的数据。尽管在前面的描述中已经描述了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员将会理解，在不脱离本发明的情况下，可以对设计或构造的细节进行许多变化或修改。参考文献1.rakha,e.a.&ellis,i.o.triple-negative/basal-likebreastcancer:review.pathology41,40-47(2009).2.cleator,s.,heller,w.&coombes,r.c.triple-negativebreastcancer:therapeuticoptions.lancetoncol8,235-244(2007).3.dawood,s.triple-negativebreastcancer:epidemiologyandmanagementoptions.drugs70,2247-2258(2010).4.foulkes,w.d.,smith,i.e.&reis-filho,j.s.triple-negativebreastcancer.nengljmed363,1938-1948(2010).5.clevers,h.atthecrossroadsofinflammationandcancer.cell118,671-674(2004).6.rakoff-nahoum,s.&medzhitov,r.toll-likereceptorsandcancer.natrevcancer9,57-63(2009).7.coussens,l.m.&werb,z.inflammationandcancer.nature420,860-867(2002).8.basseres,d.s.&baldwin,a.s.nuclearfactor-kappabandinhibitorofkappabkinasepathwaysinoncogenicinitiationandprogression.oncogene25,6817-6830(2006).9.jost,p.j.&ruland,j.aberrantnf-kappabsignalinginlymphoma:mechanisms,consequences,andtherapeuticimplications.blood109,2700-2707(2007).10.perkins,n.d.thediverseandcomplexrolesofnf-kappabsubunitsincancer.natrevcancer12,121-132(2012).11.hartman,z.c.,etal.growthoftriple-negativebreastcancercellsreliesuponcoordinateautocrineexpressionoftheproinflammatorycytokinesil-6andil-8.cancerres73,3470-3480(2013).12.acharyya,s.,etal.acxcl1paracrinenetworklinkscancerchemoresistanceandmetastasis.cell150,165-178(2012).13.yamamoto,m.,etal.nf-kappabnon-cell-autonomouslyregulatescancerstemcellpopulationsinthebasal-likebreastcancersubtype.natcommun4,2299(2013).14.ginestier,c.,etal.cxcr1blockadeselectivelytargetshumanbreastcancerstemcellsinvitroandinxenografts.jclininvest120,485-497(2010).15.baud,v.&karin,m.isnf-kappabagoodtargetforcancertherapy？hopesandpitfalls.natrevdrugdiscov8,33-40(2009).16.dutta,j.,fan,y.,gupta,n.,fan,g.&gelinas,c.currentinsightsintotheregulationofprogrammedcelldeathbynf-kappab.oncogene25,6800-6816(2006).17.luo,j.l.,kamata,h.&karin,m.ikk/nf-kappabsignaling:balancinglifeanddeath--anewapproachtocancertherapy.jclininvest115,2625-2632(2005).18.didonato,j.a.,mercurio,f.&karin,m.nf-kappabandthelinkbetweeninflammationandcancer.immunolrev246,379-400(2012).19.tornatore,l.,etal.cancer-selectivetargetingofthenf-kappabsurvivalpathwaywithgadd45beta/mkk7inhibitors.cancercell26,495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