竹节香附素A在制备抗人骨肉瘤的药物中的应用的制作方法

本发明涉及抗肿瘤药物领域，具体涉及竹节香附素A在制备抗人骨肉瘤的药物中的应用。

背景技术：

骨肉瘤又称为骨瘤，是青少年及儿童中最常见的原发性恶性肿瘤之一，也是最常见于骨组织的原发性恶性肿瘤。患者常伴随截肢、肺转移、死亡等后果，其对放疗不敏感，化疗和手术治疗为其主要的治疗手段，而单纯手术治愈率仅15%～20%。虽然配合化疗药物使用可以有效的提升患者的生存周期，但是骨瘤的高转移病人的治愈率仍然只有30%。其中肿瘤浸润及转移是恶性肿瘤导致患者死亡的主要原因之一。通过调控细胞凋亡，降低骨肉瘤的转移，从而提高骨肉瘤治疗效果，是降低骨肉瘤死亡率，改善患者远期预后的重要途径。现有技术中，缺少能够有效抗人骨肉瘤的药物。

竹节香附素A是一种三萜皂苷，是从毛莨科银莲花属植物多被银莲花(Anemone Raddeana Regel)的干燥根茎提取出的主要活性成分，具有祛风湿的功效。

技术实现要素：

本发明的目的是提供竹节香附素A在制备抗人骨肉瘤的药物中的应用。

本发明提供竹节香附素A在制备抗人骨肉瘤的药物中的应用。

本发明还提供抗人骨肉瘤的药物组合物，其活性成分为竹节香附素A。

细胞增殖实验，Hoechst 染色及Annexin V-FITC/PI流式细胞仪检测结果显示竹节香附素A高于1μmol/L的浓度可以诱导骨肉瘤细胞MG-63凋亡，并呈现剂量依赖性和时间依耐性。

Western Blot及免疫荧光实验结果证实，竹节香附素A通过诱导ROS（活性氧簇），激活JNK（c-Jun氨基末端激酶）的磷酸化，促发线粒体凋亡通路，有效抑制人骨肉瘤细胞MG-63的增殖。

竹节香附素A（0.25-1μmol/L）浓度范围内能够有效地抑制人骨肉瘤细胞的划痕伤口愈合，Transwell小室中的迁徙和侵袭。

本发明提供竹节香附素A在制备抗人骨肉瘤的药物中的应用。通过大量实验发现，竹节香附素A可通过上调ROS，调节线粒体中相关基因的表达，如抑制抗凋亡基因Bcl-2和促进促凋亡基因Bax的蛋白表达，激活Caspase级联反应，诱导MG-63细胞凋亡。竹节香附素A还通过激活JNK通路诱导MG-63细胞凋亡。低浓度的竹节香附素A可以抑制骨肉瘤MG-63细胞划痕愈合，可以显著抑制骨肉瘤MG-63细胞Transwell穿膜能力和穿过Matrigel胶的侵袭能力，从而抑制MG-63细胞的转移。综上所述，竹节香附素A可以应用于制备抗人骨肉瘤的药物。

附图说明

图1显示不同浓度竹节香附素A对MG-63细胞抑制作用，C表示竹节香附素A的浓度；其中图1（A）中竹节香附素A对MG-63细胞的作用时间为24h，图1（B）中竹节香附素A对MG-63细胞的作用时间为48h。

图2 是Annexin V/PI双染色法检测得到的细胞凋亡率图，RA表示竹节香附素A；其中图2（A）是药物作用24小时后的细胞凋亡率图，图2（B）是药物作用48小时后的细胞凋亡率图，图2（A）、图2（B）上方的浓度是各细胞处理过程中竹节香附素A的浓度。

图3稀释了不同浓度竹节香附素A对MG-63细胞内ROS水平的影响，图下方的浓度为各细胞处理过程中竹节香附素A的浓度。Raddeanin A表示竹节香附素A。

图4 竹节香附素A对MG-63细胞中Bcl-2，Bax，caspase-3和PARP蛋白表达的影响，每一行条带左边或右边显示了蛋白的名称，图的上方显示了各细胞处理过程中竹节香附素A的浓度。Raddeanin A的意思是竹节香附素A。第5、6行条带分别为胞浆和线粒体中细胞色素C的表达。

图5 竹节香附素A对MG-63细胞中JNK蛋白表达的影响，其中每个胶条左边显示了蛋白条带的名称，上方显示了各细胞处理过程中竹节香附素A的浓度。

图6 竹节香附素A对MG-63细胞划痕愈合能力的影响，图片左边的时间表示各细胞采用竹节香附素A处理的时间，图片下方显示了各细胞处理过程中竹节香附素A的浓度。

图7 Transwell实验检测竹节香附素A对MG-63细胞迁移能力的影响，小图下方的浓度为各细胞处理过程中竹节香附素A的浓度。

图8 Matrigel实验检测竹节香附素A对MG-63细胞侵袭能力的影响，各小图下方的浓度表示各细胞处理过程中竹节香附素A的浓度。

具体实施方式

人骨肉瘤细胞MG-63购自美国典型培养物保藏中心（ATCC细胞库），该细胞培养的常规培养方法：采用基础培养液进行培养，置于37℃、5%CO₂孵箱中培养。基础培养液是含10%胎牛血清的MEM培养液。

在本发明中，如果无特殊说明，是通过将竹节香附素A溶于含有0.1% DMSO的基础培液中，然后加入到人骨肉瘤细胞MG-63中进行干预的。

实施例1 竹节香附素A对人骨肉瘤细胞MG-63的细胞存活率的影响

人骨肉瘤细胞MG-63（缩写为MG-63细胞）接种于96孔板中，常规方法培养24h后，去除培养液，给予不同剂量的竹节香附素A（上海源叶生物科技有限公司）分别干预24和48h，对照组中加入含有0.1% DMSO的基础培液。随后每孔中加入5mg/mL的MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐）溶液15μL，置二氧化碳培养箱中温孵4h，吸去MTT溶液，加入DMSO(150μL/孔)溶解结晶，静置30min后取出，置于酶标仪测定490nm波长处的吸光度。

给药组细胞存活率用以下公式计算：存活率=给药组吸光度／对照组吸光度*100％。

MTT法检测结果见图1，竹节香附素A对MG-63细胞的抑制呈现出显著的剂量依赖性和时间依耐性，竹节香附素A干预24小时和48小时的IC₅₀值分别为2.293μmol/L和1.749μmol/L。上述结果说明，竹节香附素A能够有效促进人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡。

另外，还采用Hoechst 染色方法考察了竹节香附素A对骨肉瘤细胞MG-63凋亡情况的影响，结果显示竹节香附素A高于1μmol/L的浓度可以诱导骨肉瘤细胞MG-63凋亡，并呈现剂量依赖性和时间依耐性。

实施例2 Annexin V/PI双染法检测细胞的凋亡率

采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（中国凯基）检测不同剂量的竹节香附素A干预24小时对MG-63细胞凋亡率的影响。该试剂盒包括Binding buffer、AnnexinV-FITC和Propidiμm Iodide染色液。

MG-63细胞接种于6孔板中，常规方法培养24h后，去除培养液，给予不同剂量（1、2、4μM）的竹节香附素A干预24小时，本发明中剂量是指采用药物干预时，体系中竹节香附素A的终浓度。对照组中加入含有0.1% DMSO的基础培液。干预后，将MG-63细胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化，1200r/min离心10min，收集细胞。加入500μl的Binding buffer, 重悬细胞, 随后加5μL AnnexinV-FITC混匀后，再加入5μL Propidiμm Iodide染色液, 室温下混合，避光孵育15 min。Annexin V-FITC/PI流式细胞仪检测细胞凋亡率。

PI和Annexin V荧光补偿校正后的细胞双染结果如图２所示：随竹节香附素A浓度的增加，MG-63细胞的凋亡现象呈现出梯度递增。对照组中细胞24h、48h的凋亡率（早期凋亡与晚期凋亡的总和）分别为3.0%.和6.3%。在竹节香附素A浓度为1、2和4μM时，MG-63细胞24h的凋亡率（早期凋亡与晚期凋亡的总和）分别为19.3%、33.9%和42.6%；MG-63细胞48h的凋亡率（早期凋亡与晚期凋亡的总和）分别为21.2%、52.4%和61.2%。与对照组相比，差异有统计学意义。上述试验结果说明竹节香附素A能够有效促进人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡，且存在着浓度依赖性和时间依赖性。

实施例3 竹节香附素A诱导ROS生成促发线粒体凋亡通路

1.竹节香附素A对MG-63细胞内ROS（活性氧簇）水平的影响

MG-63细胞接种于24孔板中，常规方法培养24h，去除培养液，给予不同剂量（1、2、4μM）的竹节香附素A干预3小时，另外采用1mmol/L的NAC（ROS清除剂）与2μmol/L的竹节香附素A同时干预3小时，阴性对照组中加入含0.1% DMSO的基础培养液；药物作用3小时后，加入荧光染料DCFH-DA（美国sigma公司），在37℃培养箱中避光孵育20min。取出培养板，吸去荧光染液，4℃预冷的PBS溶液清洗细胞3次，4%的多聚甲醛溶液固定30min，PBS溶液清洗3次，最后在荧光显微镜下观察绿色荧光的强度。ROS的检测结果：从图3可以看出，用竹节香附素A处理MG-63细胞3小时后，竹节香附素A以剂量依赖性地方式增加细胞内的ROS（活性氧簇）水平，4μM的竹节香附素A显著增加了细胞内的ROS水平；而经过NAC和竹节香附素A同时干预，可以抑制竹节香附素A导致的MG-63细胞内ROS水平的升高。

2.竹节香附素A对ROS相关蛋白表达情况的影响

蛋白质提取：MG-63细胞接种于24孔板中，常规方法培养24h后，去除培养液，给予不同剂量（1、2、4μM）的竹节香附素A干预24h，阴性对照组加入含0.1% DMSO的基础培养液；24小时后用预冷的PBS溶液洗涤细胞，加入500μl RIPA裂解液（中国碧云天生物技术公司），反复吹打混匀，置于冰上裂解30分钟；4℃、12000rpm条件下离心15分钟，将离心后的上清分装至1.5mL的离心管，部分用于实验，其余的于-20℃保存。然后采用 BCA蛋白浓度测定试剂盒（中国凯基）检测不同剂量竹节香附素A干预24h后细胞中的蛋白含量。

Western blot实验：采用SDS-PAGE电泳分离上述提取到的蛋白质，然后分别采用Bax、Bcl-2、Cleaved PARP、Cleaved caspase-3和β-action蛋白的一抗及相应的二抗进行孵育（美国CST公司）鉴定上述蛋白的表达情况。具体方法如下：配制10%分离胶和4%浓缩胶，每孔上样20μg蛋白，在120V下电泳65min。SDS-PAGE电泳结束后，将蛋白转移到PVDF膜后，将PVDF膜用5%脱脂奶粉溶液封闭2小时，然后与1:1000稀释的一抗（兔Bax、Bcl-2、Cleaved PARP、Cleaved caspase-3、Cytochrome C和β-action抗体，美国CST公司）4℃孵育过夜。然后用含有0.1% Tween20的PBS溶液洗膜3次，每次10min，再与1:1000稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，美国CST公司) 室温孵育2小时。用含有0.1% Tween20的PBS溶液洗膜3次，每次10min。ECL法显影，Clinx Science化学发光成像仪成像，Clinx Chemi Image Analysis图像分析软件进行数据处理。Western blot结果显示（图4），MG-63细胞经竹节香附素A作用24h后，细胞内的Bcl-2蛋白随着竹节香附素A浓度的增加出现了明显的降解，与之对应的是Bax蛋白显著上调，说明竹节香附素A能有效地诱导MG-63细胞凋亡。随着竹节香附素A浓度的逐渐增加，MG-63细胞株内的Cleaved caspase-3和Cleaved PARP活性都随之增加，表明其引起caspase系列的凋亡反应级联放大，最终促进细胞凋亡（图 4）。

因此，本实施例证明了竹节香附素A通过诱导ROS进一步激活线粒体凋亡通路，诱导人骨肉瘤细胞MG-63凋亡。

实施例4 竹节香附素A激活JNK通路诱导MG-63细胞凋亡

竹节香附素A激活JNK通路的验证：MG-63细胞接种于96孔板中，常规方法培养24h后，去除培养液，给予不同剂量（1、2或4μM）的竹节香附素A干预24h，阴性对照组加入含0.1% DMSO的基础培养液。然后按照实施例3中方法提取蛋白质，采用Western blot实验检测JNK通路中ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-P38、JNK、p-JNK蛋白的表达情况，以β-action为内参。兔ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-P38、JNK、p-JNK和β-action蛋白抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG均购自美国CST公司。结果如图5所示，竹节香附素A可显著促进JNK蛋白的磷酸化，对总蛋白没有影响。

MG-63细胞接种于96孔板中，常规方法培养24h后，去除培养液，同时给予4μM竹节香附素A和10μM JNK的特异性抑制剂SP600125干预24h，然后按照实施例1中MTT法检测竹节香附素A和SP600125的加入对MG-63细胞存活率的影响。MTT结果显示：10μM的JNK特异性抑制剂SP600125，可以有效抑制竹节香附素A（4μM）促发的MG-63细胞凋亡。因此，本实施例证明了竹节香附素A通过激活JNK通路诱导MG-63细胞凋亡。

实施例5 竹节香附素A对MG-63细胞划痕愈合能力的影响

取对数生长期MG-63细胞接种于12孔板中，常规方法培养24h至细胞基本融合。用200μL微量移液头在12孔板内垂直划痕，PBS溶液冲洗2次后, 给予不同剂量（0.25µM、0.5µM或1µM）的竹节香附素A干预24小时，阴性对照组中加入含0.1% DMSO的基础培养液。分别用倒置相差显微镜观察。每个视野内，随机选择3个区域，并计算100×视野内迁移划痕空隙的长度。

结果如图6所示：划痕实验显示，竹节香附素A干预24小时后，与对照组相比，给药组MG-63细胞迁移距离减小，且呈现浓度依赖性。0.5µM、1µM竹节香附素A处理后，细胞的迁移距离显著小于阴性对照组。

实施例6 竹节香附素A对MG-63细胞迁移能力的影响

选择对数生长期MG-63细胞，胰蛋白酶消化，无血清MEM培养液重悬，细胞计数；将Transwell小室置于24孔板中，小室上层加入200μL含有不同剂量竹节香附素A(0.25µM、0.5µM和1µM)的细胞悬液（溶剂为含有0.1%DMSO的MEM培养液），每孔接种5×10⁴个细胞；阴性对照中加入200μL含有0.1%DMSO的MEM培养液的细胞悬液，每孔同样接种5×10⁴个细胞；Transwell小室下层加入600μＬ基础培养液（含10%胎牛血清）。37℃培养24h，吸弃上下层培养液，PBS溶液清洗3次；加入1ml甲醇固定30min，PBS溶液清洗3次；加入1ml吉姆萨染液染色30min，PBS溶液清洗3次；用棉签将Transwell小室上层细胞拭去；将Transwell小室膜剪下，中性树胶封闭于载玻片上；显微镜下计数穿过的细胞数目。结果（图7）显示，与对照组相比较，竹节香附素A可明显抑制骨肉瘤MG-63的穿膜能力，0.5µM和1µM的竹节香附素A的抑制效果非常显著。

实施例7 竹节香附素A对MG-63细胞侵袭能力的影响

在Transwell小室上层中加入一层Matrigel凝胶，下室加入600μL基础培养液。然后在上室中加入200μL含有不同剂量竹节香附素A (0.25µM、0.5µM、1µM)的细胞悬液（溶剂为含有0.1%DMSO的MEM培养液），每孔接种5×10⁴个细胞；阴性对照中加入200μL含有0.1%DMSO的MEM培养液的细胞悬液，每孔同样接种5×10⁴个细胞；置于37 ℃、5% CO₂及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养24h，取出小室，染色计数。如图8所示：与对照组比较，各给药处理组细胞24h穿过Matrigel胶的数量均显著降低，且呈现浓度依赖性。

从实施例1-7中，可以看出竹节香附素A可通过上调ROS，调节线粒体中相关基因的表达，如抑制抗凋亡基因Bcl-2和促进促凋亡基因Bax的表达，激活Caspase级联反应，诱导MG-63细胞凋亡。竹节香附素A还通过激活JNK通路诱导MG-63细胞凋亡。低浓度的竹节香附素A可以抑制骨肉瘤MG-63细胞划痕愈合，可以显著抑制Transwell穿膜能力和穿过Matrigel胶的侵袭能力，从而抑制MG-63细胞的转移。综上所述，竹节香附素A可以应用于制备抗人骨肉瘤的药物。