一种来源考布他汀A‑4衍生物的抗肿瘤机制研究的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及考布他汀A-4衍生物CPU-TX-008对VEGF诱导的肿瘤血管内皮细胞迁移机制分析。

本发明涉及生物医药领域，具体涉及考布他汀A-4衍生物CPU-TX-008对VEGF诱导的肿瘤血管内皮细胞迁移机制分析。

背景技术：

血管生成是一种高度调节的过程，在成熟的哺乳动物有机体中，生理性的血管发生只在卵巢、子宫和胎盘中，在其他组织中血管内皮细胞的更新率相当低。对于多数肿瘤而言，由于它们增殖失控，现有血管系统难以满足正常的营养和氧分供应，代谢产物不断堆积，肿瘤细胞因此通过上调一些促血管内皮细胞迁移的因子：血管内皮生长因子(VEGF)、Src激酶、局部粘着斑激酶(FAK)以及桩蛋白(paxillin)等激活来促进内皮细胞迁移至肿瘤组织中形成血管。人们研究CA-4的结构发现，CA-4的结构与秋水仙碱比较相似，具有1个顺式乙烯桥连接的两个苯环的基本结构，并且在环上有一些甲氧基取代。CA-4的水溶性差，难以静脉给药，CPU-XT-008是将CA-4结构上的羟基用水溶性更强的氨基葡萄糖基团取代，结构显示，其不仅保持了CA-4较强的生物活性，水溶性也大大提高。本发明发现CPU-TX-008通过抑制HUVECs中的Src以及FAK蛋白的磷酸化来抑制细胞迁移，最终达到抑制肿瘤血管生长的目的。

CPU-TX-008是CA-4结构上的羟基用水溶性更强的氨基葡萄糖基团取代，药理结构显示，其不仅保持了CA-4较强的生物活性，水溶性也大大提高。但目前尚未有CPU-TX-008对人脐静脉血管内皮细胞迁移机制的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供CPU-TX-008作为治疗肿瘤药物抑制人脐静脉血管内皮细胞迁移的机制。

本发明公开了一种新的CA-4衍生物CPU-TX-008抑制VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)迁移信号通路。药理实验结果现实在10ng/ml的VRGF的作用下，0.1、1、10μmol/L CPU-XT-008可以显著抑制HUVECs的迁移，同时以Src的抑制剂PP2作为对照组，结果显示1μmol/L CPU-XT-008可以有效的抑制Src以及FAK蛋白的磷酸化。说明CPU-TX-008药物可以通过Src-FAK信号通路来抑制血管形成，从而达到治疗肿瘤的目的。

附图说明

图1为5组实验的细胞划痕实验结果图。

图2为5组实验的细胞划痕实验结果统计图。

图3为5组实验Western blottingd的Src蛋白结果。

图4为5组实验Western blottingd的p-Src蛋白结果。

图5为5组实验Western blottingd的p-FAK蛋白结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例

对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)给予药物CPU-XT-008，MTT法检测其的抗HUVECs增殖活性，并得出最佳作用浓度：

将HUVEC接种于96孔培养板，同步化后，将细胞分为空白组(无血清DMEM培养基)、模型组(10％新生牛血清DMEM培养基)、阳性对照组及给药组。阳性对照组为10μmol/L CA-4，给药组分别为0.01，0.1，1，10μmol/L CPU-XT-008，阳性对照组和给药组均用10％新生牛血清DMEM培养基，继续培养24h。每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，37℃孵育4h。吸出培养液后每孔加入DMSO 150μL溶解结晶，振荡混匀后于562nm处测定各孔吸收度。根据之前实验室已摸索成功的因子浓度进行诱导，分别为VEGF 10ng/ml、PP2 10ng/ml。

细胞划痕实验研究VEGF、CPU-XT-008、CA-4、PP2对HUVECs细胞迁移的影响：

将处于对数生长期的HUVECs制成细胞悬液后接种于6孔板并培养至形成单层细胞时，用无菌枪头在每个孔中长满的单层细胞上划过，使之形成宽1mm的划痕。PBS冲洗去掉脱落的细胞，加入含0.5％血清的DMEM培养液，分为空白组仅10％血清培养基、模型组10％血清加VEGF(10ng/ml)刺激因子、实验组1加VEGF(10ng/ml)刺激因子和阳性药CA-4(10μmol/L)、实验组2加VEGF(10ng/ml)和PP2(10μmol/L)、实验组3VEGF(10ng/ml)和CPU-XT-008(10μmol/L)。加入药物24h后在预先选定的4个位置上测量划痕宽度。计算平均迁移宽度，进行统计分析，见图1。

Western-Blotting法检测VEGF作用下，CPU-XT-008、CA-4、PP2对HUVECs的相关迁移蛋白Src、FAK蛋白水平的变化

将培养的人脐静脉内皮细胞用冷0.01mol/L PBS漂洗后加入150μl细胞裂解液，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度并定量，经10％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离蛋白，考马斯亮兰染色观察蛋白电泳情况，湿性电转法将蛋白转移到PVDF膜上，4％脱脂奶封闭，分别采用Src、p-Src、FAK、p-FAK抗体孵育过夜，辣根酶标记羊抗兔二抗，ECL化学发光法显影，Bio-Rad成像系统拍照。采用Image J软件系统进行分析，蛋白表达量用吸收度表示，结果用目标条带与内参条带的比值表示，见图3/4/5。