D‑氨基酸在抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的医用用途的制作方法

本发明公开一种D-氨基酸在抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的医用用途，属于生物工程
技术领域：
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背景技术：
：随着口腔医学的不断发展和种植技术的日臻成熟,种植义齿已成为牙列缺损及牙列缺失患者的治疗首选。临床资料显示，虽然近十余年的种植义齿存留率已达97.1%，但其生物学并发症并无明显降低。种植体周围黏膜炎及其继发的种植体周围炎可引起局部肿胀不适、骨吸收甚至种植体松动脱落，其导致种植失败的病例约占失败总数的30％以上。大量资料显示，种植体周围黏膜炎发生的始动因素为种植体颈部菌斑生物膜的形成，生物膜中细菌对抗生素的耐药性近乎于浮游状态细菌的500倍。与天然牙相似，当种植体周发生炎症时，其主要菌群从G+菌转变为G-菌，其中牙龈卟啉单胞菌是被公认为与种植体周围炎症发生发展甚至种植体最终脱落关系最为密切的细菌。目前，研究已证实了牙龈卟啉单胞菌（Porhyromonasgingivalis,P.g）在牙周炎、种植体周围炎等口腔疾病的发生、发展中发挥着重要的作用。临床上去除菌斑生物膜、控制种植体周围炎的方法主要有：机械处理、激光治疗、药物治疗和光动力治疗等。器械处理包括抛光杯、塑料、碳纤维或钛刮治器的使用以及超声洁治刮治和气压喷砂等。由于种植体表面粗糙多孔，机械治疗方法均不能彻底清除其表面的生物膜和细菌。另外，在使用器械操作时可能会引起钛表面的损伤或器械材料的残留，干扰机体细胞的再附着。激光治疗对种植体的长期影响尚不明确，实验显示不适当的波长可引起SLA或TPS钛表面的广泛熔化，这种热损伤可能会对种植体产生长期的潜在损害。葡萄糖酸氯己定被认为是抗微生物药物中的“金标准”，它虽能有效地降低细菌的活性，却不能破坏生物膜；长期抗生素的使用还会导致部分菌株耐药性的产生。光动力抗菌疗法是治疗种植体周围炎的一种前沿方法，其抗菌机理是光化学反应引起细菌胞浆膜的破坏，但实验显示该疗法并不能破坏生物膜的完整性，因此不能彻底清除细菌。经检索相关文献，临床上仍没有一种能够有效清除生物膜的技术或制剂，如何有效地清除种植体表面的生物膜成为预防和治疗种植体周围炎的技术关键。抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的药物及制剂的开发将有助于预防及治疗由牙龈卟啉单胞菌参与引起的口腔疾病。研究结果可能为临床上预防和治疗种植体周围炎新药的研制提供理论依据。组成地球生命体的氨基酸绝大部分是L-氨基酸，而近年来有研究发现D-氨基酸也存在于人体、动植物以及微生物的体内，但是关于D-氨基酸对于细菌生物膜形成的作用是未知的。技术实现要素：本发明公开一种D-氨基酸在抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的医用用途，利用D-氨基酸对于细菌生物膜的破坏作用，使D-氨基酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成具有抑制作用，可以应用于防治牙龈卟啉单胞菌引起的牙周炎、种植体周围炎等疾病。本发明通过外源性D-氨基酸作用于细菌生物膜形成期，进行细菌生物膜形成状态的观察，证明了D-氨基酸具有明显的抑制细菌生长及生物膜形成的作用。为了实现本发明的发明目的，本发明采用了如下的技术路线：利用有效D-氨基酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成进行实验，采取结晶紫及胞外多糖实验实验及扫描电子显微镜进行结果验证。牙龈卟啉单胞菌的鉴定：通过革兰染色观察细菌形态并通过16SrRNAPCR进行牙龈卟啉单胞菌特定引物序列的鉴定，上游引物：5‘-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3’，下游引物：5‘-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’。本实验中，实验组为梯度浓度的D-氨基酸与对数期的牙龈卟啉单胞菌菌液共培养，对照度为空白培养基与对数期的牙龈卟啉单胞菌菌液共培养。牙龈卟啉单胞菌的培养：将牙龈卟啉单胞菌接种到液体BHI培养基中，于恒温培养箱内进行厌氧培养，分别于培养的第24小时、28小时……72小时，每4小时利用分光光度计测定吸光度值（OD值），绘制生长曲线，结果显示48小时时，牙龈卟啉单胞菌生长进入对数生长期，72小时时达到高峰。D-氨基酸的配制：用电子分析天平秤取一定量的粉状D-氨基酸，溶于无菌去离子水后，用0.22um滤菌器过滤除菌，备用。通过结晶紫染色法测定牙龈卟啉单胞菌生物膜聚集量，结果显示高浓度D-氨基酸能明显抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的聚集。通过苯酚-硫酸法测定牙龈卟啉单胞菌生物膜分泌的胞外多糖，结果显示高浓度D-氨基酸能明显抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成。通过场发射扫描电子显微镜观察D-氨基酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的影响：各组扫描电子显微镜图片，如图1-5，结果显示，高浓度D-氨基酸具有很好的抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的作用，随着D-氨基酸浓度的降低这种作用效果也在下降。各种D-氨基酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的作用，见表1，也说明不是所有D-氨基酸都能抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成。表1.各种D-氨基酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的作用列表有效D-氨基酸无效D-氨基酸D-缬氨酸D-半胱氨酸D-苯丙氨酸D-色氨酸D-丙氨酸D-亮氨酸D-蛋氨酸D-甘氨酸D-谷氨酸D-精氨酸D-组氨酸D-赖氨酸D-天冬氨酸D-苏氨酸D-脯氨酸D-异亮氨酸D-丝氨酸D-酪氨酸本发明的积极效果在于：公开了D-氨基酸在抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的医用用途，利用D-氨基酸对于细菌生物膜的破坏作用，使D-氨基酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成具有抑制作用，可以应用于防治牙龈卟啉单胞菌引起的牙周炎、种植体周围炎等疾病。附图说明图1为本发明对照组电镜图片，可见生物膜厚且致密；图2为本发明高浓度组电镜图片，可见无生物膜形成，细菌散在单个分布；图3为本发明次高浓度组电镜图片，可见无生物膜形成，细菌间连接为链；图4为本发明低浓度组电镜图片，可见有较为松散的生物膜形成；图5为本发明最低浓度组电镜图片，可见生物膜明显，较致密。具体实施方式实施例1以D-氨基酸为主要活性成分可以制成药物学上抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的任何药物制剂。通过以下实验表明D-氨基酸在抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的医学效果：1.实验目的：本实验研究D-氨基酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的影响。2.实验材料：实验所用菌株为P.gATCC33277，牛脑心浸液（OXOID公司，英国）、恒温培养箱（苏州威尔实验用品有限公司，苏州）、厌养袋（日本三菱）、D-氨基酸（鼎国生物技术有限公司,北京）、紫外分光光度计（Bio-Rad，美国）。3.实验方法3.1细菌的培养和鉴定P.gATCC33277培养于含有维生素K(1µl/mL)、氯化学红素（5µg/mL）和5%羊血的牛脑心浸液培养基（固体BHI培养基）中，厌养培养5～7天后，于液体牛脑心浸液培养基（液体BHI培养基）增菌1～2天。革兰染色后镜下观察细菌形态，16SrRNAPCR方法鉴定P.gATCC33277，引物序列为：上游引物：5’-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3’，下游引物：5’-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’。3.2生长曲线的绘制将P.gATCC33277于固体BHI培养中厌养培养7天后，接种于液体BHI培养基中厌氧培养，分别于培养的第24小时、28小时……72小时，每4小时利用分光光度计测定吸光度值（OD值），绘制生长曲线。3.3生物膜聚集量的检测取培养至对数生长期的P.gATCC33277，以108CFU的菌液浓度分别加入D-氨基酸（浓度梯度），加入等量的液体BHI培养基作为对照组，取150µl培养夜加入96孔板中，厌养培养72小时。去除培养基及游离的P.gATCC33277，在96孔板中加入50µl结晶紫溶液20分钟，用PBS冲洗3次，干燥后加入无水乙醇，用紫外分光光度计检测其吸光度值（A490）。通过场发射扫描电子显微镜观察D-氨基酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的影响。3.4细菌分泌胞外多糖的检测取培养至对数生长期的P.gATCC33277，以108CFU的菌液浓度分别加入D-氨基酸（浓度梯度），加入等量的液体BHI培养基作为对照组，取150µl培养夜加入96孔板中，厌养培养72小时。去除培养基及游离的P.gATCC33277，PBS冲洗3次，在96孔板中加入40µl苯酚溶液，200µl硫酸溶液30分钟，用紫外分光光度计检测其吸光度值（A490）。3.5统计学方法采用SPSS23.0软件，用t检验的方法比较试验组与对照组P.gATCC33277生物膜形成的吸光光度值。4.实验结果4.1P.gATCC33277鉴定结果P.gATCC33277经过革兰染色后在镜下观察为淡红色短棒状。4.2生长曲线的绘制P.gATCC33277生长曲线结果显示48小时时，牙龈卟啉单胞菌生长进入对数生长期，72小时时达到高峰。4.3通过结晶紫染色法测定牙龈卟啉单胞菌生物膜聚集量，通过SPSS23.0软件进行结果分析，得出了有效D-氨基酸（D-缬氨酸、D-苯丙氨酸、D-丙氨酸、D-蛋氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-天冬氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸）和无效D-氨基酸（D-半胱氨酸、D-色氨酸、D-亮氨酸、D-甘氨酸、D-精氨酸、D-赖氨酸、D-苏氨酸、D-异亮氨酸、D-酪氨酸）。见表2，表3。表2无效D-氨基酸组注：与对照组（P.g组）相比较，显著性一栏结果<0.05为有显著性差异，即该组有效；否则为无显著性差异，即该组无效。表3有效D-氨基酸注：与对照组（P.g组）相比较，显著性一栏结果<0.05为有显著性差异，即该组有效；否则为无显著性差异，即该组无效。4.4通过苯酚-硫酸法测定牙龈卟啉单胞菌生物膜分泌的胞外多糖，结果显示高浓度D-氨基酸能明显抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成，随着D-氨基酸浓度的降低作用效果减弱。4.5通过场发射扫描电子显微镜观察D-氨基酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的影响：各组扫描电子显微镜图片见附图1~图5。结果显示，高浓度D-氨基酸具有很好的抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的作用，随着D-氨基酸浓度的降低这种作用效果明显减弱。结论：有效D-氨基酸为：D-缬氨酸、D-苯丙氨酸、D-丙氨酸、D-蛋氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-天冬氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸可以抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成。当前第1页1 2 3