一种基于皮肤角质层自发荧光无创预测紫外光诱导的皮肤损伤的方法与流程

本发明涉及一种根据角质层特定分子自荧光的测量与分析方法，用于活体无创预测紫外光诱导的皮肤损伤。

背景技术：

阳光中的紫外线是人的皮肤受到紫外线辐射损伤的主要原因。紫外线辐射对于皮肤会产生多种病理作用，例如皮肤红肿，脱皮，炎症，溃烂，以及多种皮肤疾病等，并会产生大量活性氧化物，造成皮下细胞的DNA损伤，加速皮肤衰老。事实上，人体皮肤衰老90％的原因是由于紫外线照射。而紫外线诱导的最严重的疾病是皮肤癌。已有研究证明，90％以上的皮肤癌是由阳光中的紫外线照射引起的。皮肤癌患者占所有癌症患者中的40％。全世界每年有300多万新发皮肤癌病例。而皮肤癌基金会也指出，五分之一的美国人在一生中的某个阶段会得皮肤癌。随着人类工业化的进展，大气层中负责阻挡紫外线的臭氧层在不断变薄。(臭氧层能吸收99％太阳释放出来的紫外线)有专家曾预测，臭氧层厚度减少1％，紫外线辐射强度增加2％。

随着人民生活水平的提高，人们越来越重视于皮肤的保护。因此，对于皮肤紫外线损伤的检测对于人们提高皮肤的健康水平、防止皮肤癌等重大皮肤疾病的产生，都具有着重大的社会经济意义和临床价值。

而在我国，由于人口压力巨大，诊断和就医困难，紫外皮肤损伤尚未得到足够的重视，往往很多皮肤受创患者只有受到特别强的皮损后才会门诊就医，而使得近年来，我国乃至于全世界紫外创伤导致的皮肤病和皮肤癌患者数量逐渐增多。因此，有效的皮肤紫外损伤检测方法，以及低成本便携式的紫外损伤检测设备，对于相关皮肤疾病、皮肤癌的诊断和治疗意义重大。

现在临床上皮肤紫外线损伤的诊断以皮肤科医生目测为主，对医生的经验依赖性强，且只能对较严重的皮肤损伤进行评估，无法实现对紫外线造成的积累性皮肤损伤，特别是皮肤癌变的早期诊断。现有的皮肤损伤检测仪器，只能通过紫外光在组织传播过程中的吸收不同，对皮下进行反射成像实现一个非常粗略的估计。原理是:紫外灯照射皮肤，检测皮肤反射回的光线。由于正常皮肤组织和受损区域(主要为黑色素沉积区域)对光线的吸收系数不同，将反射或散射回来的光线进行成像，从而可以对皮肤内黑色素、水分、脂质的含量做一个非常粗略的估计。由于激光在组织中的传播对于散射非常敏感，而且根据瑞利散射和弥散射原理，光子散射量与波长的四次方成反比，对于紫外光这种超短波长而言，其在皮肤组织的传播受到散射的干扰已经非常显著，同时紫外光在正常细胞中的吸收也非常强烈，因此，这种反射成像会受到非常多因素的干扰，准确率和重复性都非常低。对于同样一个人而言，在不同组织，或同样组织中的不同肌肉状态下的测量，可能测得的结果差异已经与紫外受损造成的差异相当。因此，这类仪器清晰度、灵敏度差，无法检测紫外线造成的早期皮肤损伤，对皮肤损伤及进一步的皮肤疾病的早期检测和预防毫无指导意义，在临床上几乎没有应用。而特别地，对于皮肤科门诊，往往只能使用光实验对皮肤的紫外敏感性做一个定性评估，其方法是，在一个非见光皮肤区域，如背部的一块皮肤上进行紫外光照射，然后通过这块皮肤出现的红斑面积来评价患者的皮肤紫外敏感性，既不准确，也无法进行损伤的直接检测。

技术实现要素：

为解决目前对紫外光诱导的皮肤损伤的有效预测问题，本发明的目的在于提出一种对紫外光诱导的皮肤损伤的预测方法，构建一种基于介于角质层特定分子的自荧光测量分析的方法，用于预测紫外线诱导的皮肤损伤。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于皮肤角质层自发荧光的活体无创预测紫外线诱导皮肤损伤的方法，是通过角质层自发荧光预测紫外线诱导的皮肤损伤，是以蓝紫光波段的激发光，波长为440-560nm，激发出皮肤表皮角质层波长为450-580nm的自发荧光，该自发荧光与紫外线造成的未来皮肤损伤程度成正比，通过分析该波长为450-580nm的自发荧光，可以对紫外线造成的皮肤损伤进行早期预测。

进一步的，所述方法的激发光光谱范围波长为440-560nm激发的角质层的波长为450-580nm的自发荧光作为检测的标志物。优选为470nm到545nm。

进一步的，所述方法采用接收光波长为450-580nm之间。优选为450nm到550nm。

进一步的，所述方法的激发光的照射激发位置为表皮角质层。优选为表皮角质层中的角质化细胞。

本发明还提供了一种基于皮肤角质层自发荧光的活体无创预测紫外线诱导皮肤损伤的方法的应用。

附图说明

图1 UVC照射皮肤24小时后，C57小鼠角质层绿色荧光量随紫外辐射剂量的增加而显著增加。图例为20微米

图2 UVC照射皮肤3天后，C57小鼠皮肤H&E染色代表图。

图3紫外光照射皮肤24小时后，皮肤自荧光光谱图。

具体实施方式

基于角质层自荧光的活体无创检测紫外线诱导皮肤损伤的实验内容主要包括以下几个方面：

一、实验方法

1、动物操作

我们的研究是使用雄性C57小鼠，重量在15-25g(UVC)之间，实验动物饲养在上海交通大学MED-X研究院进行动物实验，紫外线照射实验在上海交通大学MED-X研究院进行。所有的操作流程均符合上海交通大学实验室动物保护和使用守则。辐射完成后，小鼠在动物房中进行饲养，条件为22-24℃，12小时的明/暗循环，并可自由进食取水。一天内，用激光共聚焦显微镜无创成像。

2、皮肤组织用激光共聚焦显微镜成像。

3、皮肤组织的储存

皮肤取出后，取出适量组织浸泡于4％多聚甲醛，用于制作石蜡切片。剩余组织用铝箔纸包裹好，使用液氮冷冻，之后转移到-80℃冰箱长期保存。

4、皮肤组织石蜡切片

将皮肤组织浸泡4％多聚甲醛溶液24h，然后依照石蜡切片的制作方法依次浸自来水、蒸馏水、梯度酒精、二甲苯、石蜡，制作成石蜡切片。

5、皮肤石蜡切片的HE染色

将石蜡切片浸二甲苯脱蜡，然后依次浸于梯度酒精、蒸馏水，苏木素染色10分钟，自来水流水冲洗30min，蒸馏水浸泡30s，95％乙醇10s，伊红复染30s，70％酒精洗涤2次，依次浸梯度酒精、二甲苯，中性树脂封片。实验步骤参考碧云天公司苏木素&伊红染色试剂盒。

二、实验结果和讨论

图1：C57小鼠耳部经UVC照射不同时间后，24小时内耳部皮肤角质层的自发荧光强度(488nm激发，500-530nm接收)随照射时间的延长而增强。比例尺为20微米，其结构与角质层中的角质化细胞相符。

图2：C57小鼠耳部皮肤经UVC照射不同时间后，3天后耳部表皮细胞个数减少。损伤程度与角质层自发荧光呈正相关。

图3：C57小鼠耳部皮肤接受不同波段紫外光照射，24小时内，角质层自荧光的变化。显示增加波长范围在450-580nm。

本发明公开了基于角质层自荧光的活体无创预测紫外线诱导皮肤损伤的方法。在受损皮肤受到波长在440-560nm波段以内或附近的激发光照射时，在表皮角质层产生450-580nm波段的自荧光会有显著的特征性的变化：当激发光位于440-560nm波段时，受损皮肤的角质层自荧光会显著性增加。因此这种绿色自发荧光是皮肤损伤的一个指针，可以预测皮肤受到的紫外线损伤的程度。依据于本发明可能设计制造出可以通过检测该皮肤角质层自发荧光以预测紫外诱导的皮肤损伤的检测设备，以对紫外线造成的皮肤损伤进行无创、快速的预测。