丹皮酚在制备用于预防、治疗TOPK活性异常增高疾病的药物中的应用的制作方法

本发明属于药物新的药理作用和疾病防治领域。具体涉及丹皮酚(Paeonol)抑制T-LAK细胞起源的蛋白激酶(TOPK)的生物活性，以及丹皮酚通过调节TOPK活性异常增高预防和/或治疗炎症和肿瘤的应用，包括紫外线(UV)诱发的光线性皮肤病，如日晒伤和慢性光化性皮肤病。

背景技术：

临床流行病学调查显示，人体长期暴露在太阳光紫外线(SUV)下可产生皮肤炎症和皮肤肿瘤，严重威胁人类健康。太阳光中的紫外线辐射根据波长的大小可以分为三类，波长为315～400nm的长波紫外线(UVA)，波长为280～315nm的中波紫外线(UVB)，和波长为200～280nm的短波紫外线(UVC)。但是经过臭氧层时，几乎全部的UVC，多达90％的UVB和10％的UVA都被吸收(Bode AM，and Dong Z.Mitogen-activated protein kinase activation in UV-induced signal transduction.2003；Sci.STKE：RE2.doi：10.1126/stke.2003.167.re2)。长时间的UVA暴露，会产生过氧化物，造成DNA的损伤，UVB则可引起皮肤细胞DNA光加合物丁烷嘧啶二聚体的形成，影响皮肤细胞损伤后的修复，引起DNA的突变，导致皮肤癌的发生(Kielbassa C，Roza L，and Epe B.Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light.Carcinogenesis.1997；18：811-816.doi：10.1093/carcin/18.4.811)。因此，UVA和UVB被认为是引起皮肤光损伤以及皮肤癌的主要因素。到达地球表面的紫外线主要是UVA(占到达地表SUV总量的95％)和少量的UVB(占到达地表SUV总量的5％)。虽然，人们对于UVA及UVB作用机理做了大量研究，但是，人们对紫外线诱导的病理变化理解还不够充分。紫外线辐射可导致氧化应激，引起一系列的皮肤炎症，诸如光线性皮肤病、银屑病，甚至是皮肤癌(Svobodova A，Walterova D，and Vostalova J.Ultraviolet light induced alteration to the skin.Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub.2006；150：25-38)。因此，如若可以抑制引起光损伤的炎症信号通路，就可以有效的防治紫外线辐射导致的皮肤光损伤。p38、JNK通路是细胞转录和翻译的主要通路(Kaminska B.MAPK signaling pathways as molecular targets for anti-inflammatory therapy--from molecular mechanisms to therapeutic benefits.Biochim.Biophys.Acta.2005；1754：253-262.doi：10.1016/j.bbapap.2005.08.017；Schindler JF，Monahan JB，Smith WG.p38pathway kinases as anti-inflammatory drug targets.J Dent Res.2007；86：800-811.doi：10.1177/154405910708600902；Huang P，Han J，Hui L.MAPK signaling in inflammation-associated cancer development.Protein Cell.2010；1：218-226.doi：10.1007/s13238-010-0019-9)，紫外线辐照可激活此通路，导致皮肤炎症的发生(Hwang BM，Noh EM，Kim JS，Kim JM，You YO，Hwang JK，Kwon KB，Lee YR.Curcumin inhibits UVB-induced matrix metalloproteinase-1/3 expression by suppressing the MAPK-p38/JNK pathways in human dermal fibroblasts.Exp Dermatol.2013；22：371-374.doi：10.1111/exd.12137)。

TOPK，又名PBK，即PDZ连接激酶及淋巴因子激活的杀伤性T淋巴细胞源性蛋白激酶，是一种丝-苏氨酸激酶(Abe Y，Matsumoto S，Kito K，et al.Cloning and expression of a novel MAPKK-like protein kinase，lymphokine-activated killer T-cell-originated protein kinase，specificallyexpressed in the testis and activated lymphoid cells.J Biol Chem 2000；275：21525-21531；Gaudet S，Branton D，Lue RA.Characterization of PDZ-binding kinase，a mitotickinase.Proc NatlAcad Sci 2000；97：5167-5172)，属于MAPKK(Mitogen-ativated protein kinase kinase)分子家族的新成员。它是p38和JNKs的上游激酶(Abe Y，Matsumoto S，Kito K，Ueda N.Cloning and expression of a novel MAPKK-like protein kinase，lymphokine-activated killer T-cell-originated protein kinase，specifically expressed in the testis and activated lymphoid cells.J Biol Chem.2000；275：21525-21531.doi：10.1074/jbc.M909629199；Oh SM，Zhu F，Cho YY，Lee KW，Kang BS，Kim HG，Zykova T，Bode AM，Dong Z.T-lymphokine-activated killer cell-originated protein kinase functions as a positive regulator of c-Jun-NH2-kinase 1 signaling and H-Ras-induced cell transformation.Cancer Res.2007；67：5186-5194.doi：10.1158/0008-5472)。TOPK可促进肿瘤细胞的有丝分裂，导致DNA的损伤，肿瘤细胞的转移以及机体炎症的发生(Gaudet S，Branton D，and Lue RA.Characterization of PDZ-binding kinase，a mitotic kinase.Proc Natl Acad Sci USA.2000；97：5167-5172.doi：10.1073/pnas.090102397)。有研究表明，TOPK可参与紫外线诱导的DNA损伤，激活P38，磷酸化JNK(Liu K，Yu D，Cho YY，Bode AM，Ma W，Yao K，Li S，Li J，Bowden GT，Dong Z，Dong Z.Sunlight UV-induced skin cancer relies upon activation of the p38αsignaling pathway.Cancer Res.2013；73：2181-2188.doi：10.1158/0008-5472)。TOPK可以磷酸化Ser139位点的H2AX，而磷酸化的H2AX则是检测DNA损伤的生物标志(Zykova TA，Zhu F，Lu C，Higgins L，Tatsumi Y，Abe Y，Bode AM，Dong Z.Lymphokine-activated killer T-cell-originated protein kinase phosphorylation of histone H2AX prevents arsenite-induced apoptosis in RPMI7951 melanoma cells.Clin Cancer Res.2006；12：6884-6893.doi：10.1158/1078-0432；Kuo LJ，Yang LX.Gamma-H2AX-a novel biomarker for DNA double-strand breaks.In Vivo.2008；22：305-309)。因此，通过找到一种药物阻断TOPK途径，可以为防治紫外线引起的DNA损伤及皮肤炎症和肿瘤的防治提供了新的可能。

目前，人们只发现了两种TOPK抑制剂，HI032和OTS514(Kim DJ，Li Y，Reddy K，Lee MH，Kim MO，Cho YY，Lee SY，Kim JE，Bode A，Dong Z.Novel TOPK inhibitor HI-TOPK-032 effectively suppresses colon cancer growth.Cancer Res.2012；15：3060-3068.doi：10.1158/0008-5472；Matsuo Y，Park JH，Miyamoto T，Yamamoto S，Hisad S，Alachkar H，Nakamura Y.TOPK inhibitor induces complete tumor regression in xenograft models of human cancer through inhibition of cytokinesis.Sci.Transl.Med.2014；6：259ra145.doi：10.1126/scitranslmed.3010277)。但是这些药物副作用明显，不能被有效的临床应用。在本发明中，我们应用基于结构的虚拟筛选来筛选FDA批准的药物。头孢拉定作为被FDA批准第一代广谱抗生素，可以用来阻断TOPK通路，抑制UV诱导的皮肤光损伤反应。

丹皮酚(Paeonol)，亦称芍药醇，是从传统中草药中分离的药物活性成分，如牡丹皮(Lau，C.H.，Chan，C.M.，Chan，Y.W.，Lau，T.W.，Lam，F.C.，Lau，C.B.S.，2007.Pharmacological investigatiohs of the anti-diabetic effect of Cortex Moutan and its active component paeonol.Phytomedicine 14，778-784)，白芍药(Nizamutdinova，I.，Oh，H.M.，Min，Y.N.，Park，S.H.，Lee，M.J.，Chang，K.C.，Kim，H.J.，2007.Paeonol suppresses intercellular adhesion molecule-1 expression in tumor necrosis factor-a-stimulated human umbilical vein endothelial cells by blocking p38，ERK and nuclear factor-κB signaling pathways.International Immunopharmacology 7，343-350)和薯蓣根(Miyazawa，M.，Shimamura，H.，Nakamura，S.，Kameoka，H.，1996.Antimutagenic activity of b-Eudesmol and paeonol from Dioscorea japonica.Journal of Agricultural and Food Chemistry 44，1647-1650)，已在中国传统医药领域使用数千年。丹皮酚具有广泛的生物学作用，而且MTS试验表明其不具有细胞毒性，包括抗炎、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化作用(Sun，G.P.，Wang，H.，Xu，S.P.，Shen，Y.X.，Wu，Q.，Chen，Z.D.，et al.(2008).Anti-tumor effects of paeonol in a HepA-hepatoma bearing mouse model via induction of tumor cell apoptosis and stimulation of IL-2 and TNFalpha production.Eur.J.Pharmacol.584，246-252.doi：10.1016/j.ejphar.2008.02.016；Jin，X.，Wang，J.，Xia，Z.-M.，Shang，C.-H.，Chao，Q.-L.，Liu，Y.-R.，et al.(2016).Anti-inflammatory and Anti-oxidative activities of paeonol and its metabolites through blocking MAPK/ERK/p38 signaling Pathway.Inflammation 39，434-446.doi：10.1007/s10753-015-0265-3)。丹皮酚是治疗各种疾病包括阿尔茨海默病(Zhou A，Wu H，Pan J，Wang X，Li J，Wu Z，Hui A.Synthesis and evaluation of paeonol derivatiyes as potential multifunctional agents for the treatment of Alzheimer’s disease.Molecules.2015 Jan14；20(1)：1304-18.doi：10.3390/molecules 20011304)、动脉粥样硬化的传统药物和食品添加剂(Zhou J，Zhou L，Hou D，Tang J，Sun J，Bondy SC.Paeonol increases levels of cortical cytochrome oxidase and vascular actin and improves behavior in a rat model of Alzheimer’s？disease.Brain Res.2011May 4；1388：141-7.doi：10.1016/j.brainres.2011.02.064.Epub 2011 Mar 4；Li，H.，Dai，M.，Jia，W.，2009.Paeonol attenuates high-fat-diet-induced atherosclerosis in rabbits by anti-inflammatory activity.Planta Medica 75，7-11)。最近报道，丹皮酚抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎性细胞因子和抑制小鼠模型气道炎症和气道高反应性(N.Chen，D.Liu，L.W.Soromouetal.Paeonol suppresses lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokines in macrophage cells and protects mice from lethal endotoxin shock.Fundamental&Clinical Pharmacology，vol.28，no.3，pp.268-276，2014.；Q.Du，G.Feng，L.Shen，J.Cui，andJ.Cai.Paeonol attenuates airway inflammation and hyper-responsiveness in a murine model of ovalbumin-induced asthma.Canadian Journal of Physiology and Pharmacology，vol.88，no.10，pp.1010-1016，2010)。我们据此推测，丹皮酚是一种可用于治疗太阳紫外线引起的皮肤炎症的一种潜在药物。在这项发明中，我们发现，丹皮酚能够通过结合并调节TOPK活性，抑制紫外线诱发的皮肤炎症的动物及细胞模型，因此丹皮酚是紫外线诱发的皮肤炎症的有效预防和治疗药物。

技术实现要素：

本发明的目的是：

1.发现丹皮酚可直接与TOPK相结合。

2.发现丹皮酚抑制TOPK活性，降低TOPK及下游信号传导通路中p38、JNK和HA2X的磷酸化水平及炎症因子IL-6和TNF-α的分泌。

3.发现UV导致的光线性皮肤病中TOPK及下游激酶及炎症因子表达增高。

4.确定丹皮酚通过作用于TOPK，预防和/或治疗UV诱导的炎症反应，同时认为丹皮酚是一种可用来治疗由SUV诱导的炎症性皮肤病的新型药物。

本发明是这样实现的

1.丹皮酚结合TOPK并抑制其活性。

丹皮酚被鉴定为一个已知的1-(2-羟基-4-甲氧苯基)乙酮。用MTS法测定丹皮酚的毒性，HaCat和c141 JB6细胞分别用不同浓度的丹皮酚(0，50，100，200，400μm)进行处理及不同时间(24，48，72h)。结果表明，丹皮酚对JB6 c141和HaCat细胞均没有明显的细胞毒性。

通过微量热泳动实验(Microscale thermophoresis，MST)，可以高灵敏量化蛋白质-蛋白质相互作用或小分子蛋白质的相互作用。用MST实验测试丹皮酚和TOPK之间的亲和力。在本发明观察中，丹皮酚具有相当低的平衡解离常数(Kd)7670+/-690nm，表明与TOPK有很强的亲和力。体外蛋白激酶测定表明，随着丹皮酚的浓度从12.5um增加到50um，被活性TOPK催化的γ-H2AX水平逐渐降低。这些数据表明，丹皮酚能与TOPK结合并抑制其活性，而且无明显的细胞毒性。

2.丹皮酚抑制SUV诱导的p38和JNK的激活过程。

JB6细胞在使用20kJ/m²的SUV照射下对丹皮酚预处理12小时，厚度从25um到100um，同时检测p38磷酸化或JNKs水平。结果表明，水平逐渐降低。其次，在20kJ/m²的SUV照射下经100um丹皮酚培养的JB6细胞随培养时间从3小时增加到12小时，p38磷酸化或JNKs的水平也逐渐下降。HaCaT细胞中得到了相似的结果。这些数据表明，丹皮酚能抑制SUV体外诱导的JNK或p38的激活。丹皮酚成时间和剂量依耐性下调SUV诱导的下游的TOPK信号通路，同时抑制JB6 c141和HaCaT细胞内细胞因子的分泌。

3.丹皮酚降低TOPK相关的DNA损伤的标志物组蛋白H2AX

TOPK是p38的上游蛋白激酶。在本发明观察中，JB6细胞在使用20kJ/m²的SUV照射下对丹皮酚预处理12小时，厚度从25um到100um，MSKl的磷酸化水平、H2AX或TOPK逐渐减少。其次，在20kJ/m²的SUV照射下经100um丹皮酚培养的JB6细胞随培养时间从3小时增加到12小时，p38磷酸化或TOPK的水平也逐渐下降。类似的结果在HaCat的细胞中也可观察到。

4.丹皮酚降低炎症因子TNF-α和IL-6分泌

在本发明观察中，在JB6或HaCat细胞内，被20kJ/M²的SUV照射刺激TNF-α或IL-6的分泌过程被100um的丹皮酚抑制。表明丹皮酚能抑制SUV诱导的DNA损伤，通过抑制TOPK活性，同时丹皮酚抑制了体内细胞因子的分泌。

5.丹皮酚抑制SUV诱导的动物皮肤炎症反应

在小鼠皮肤组织采用HE染色观察中发现，经100KJ/m²的SUV照射后，表皮角化过度后，炎性细胞浸润，多灶性间质水肿。这些都是皮肤炎症的迹象。其次，与对照组相比，小鼠组织经照射后，TOPK，p38磷酸化水平、JNK、γH2AX均增加。第三，小鼠皮肤组织经照射后，分泌的细胞因子IL-6和TNF-α的浓度均增加，而且在小鼠皮肤照射前涂抹丹皮酚(60mg/kg)可有效抑制这一炎症反应。

本发明具有如下优点：

1.本发明首次发现丹皮酚可直接与TOPK相结合。

2.首次发现丹皮酚抑制TOPK活性，降低TOPK及下游信号传导通路中p38、JNK和HA2X的磷酸化水平及炎症因子IL-6和TNF-α的分泌。

3.首次确定丹皮酚预防和/或治疗UV诱发TOPK活性异常增高导致的光线性皮肤病。

4.根据以上发明优点推测，丹皮酚可以预防和/或治疗UV诱发TOPK活性异常增高导致的其他炎症(银屑病、红斑狼疮等)和肿瘤(皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌等)。

附图说明

图1：在人类日光性中TOPK水平，p38磷酸化水平和JNKs水平均增加。A.日光性皮炎与正常皮肤组织HE染色下病理改变的对比B.C.D.应用免疫组织化学方法检测人类日光性皮炎和正常皮肤组织中TOPK，磷酸化p38磷酸化JNK水平。

图2：在JB6 c141和HaCat细胞中SUV照射诱导p38和JNK的磷酸化水平与照射剂量和时间的相关性。A.在JB6 c141细胞中SUV激活p38磷酸化或JNKs水平与SUV照射剂量的相关性。B.在在JB6 c141细胞中SUV激活p38磷酸化或JNKs水平与SUV照射时间的相关性。C.D.与用处理JB6 c141细胞方式处理HaCat细胞。细胞裂解液(25μG)选择10％SDS-PAGE。用蛋白印迹法检测蛋白条带。数据显示的是至少三次具有代表性实验的研究成果。

图3：丹皮酚结合并抑制TOPK活性。A丹皮酚的化学结构。B.丹皮酚对HaCat细胞JB6c141细胞无细胞毒性。用浓度50、100、200和400um丹皮酚处理HaCaT细胞和JB6细胞24h，48h和72h。细胞活力测定采用MTS法，步骤依据说明书进行。定量资料采用均数±标准差表示，数据来自三个独立实验。C.丹皮酚和TOPK间的亲和力均采用MST法检测。用KD值7670+/-690nm显示约束力曲线。D.在体外，丹皮酚以剂量依赖的方式抑制TOPK活性。Gst-h2ax蛋白，活性TOPK，及ATP被用于进行体外激酶的测定。

图4：丹皮酚抑制SUV诱导的p38和JNK的活化。A和B.经丹皮酚预处理后的JB6c141细胞中依赖SUV照射剂量和时间诱导的p38磷酸化明显减少C和D.对HaCat细胞采用了相同的方法进行处理。数据显示的是至少三次具有代表性实验的研究成果。

图5：在JB6 c141和HaCaT细胞中，丹皮酚呈剂量和时间依赖性的抑制SUV诱导的TOPK下游信号通路，同时抑制一系列炎性细胞因子的分泌。A和B在JB6 c141细胞中SUV照射引起的Mskl磷酸化，H2AX，TOPK水平明显与丹皮酚预处理呈剂量和时间依赖的方式减少。细胞预先用丹皮酚处理，然后用SUV进行照射。C和D.HaCat细胞中用与JB6细胞相同的方式进行处理。数据显示的是至少三次具有代表性实验的研究成果。E.丹皮酚抑制SUV诱导的一系列炎性细胞因子IL-6和TNF-α的分泌。(###)表示与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，星号(***)表示与单用SUV处理组相比有显著差异(P＜0.05)相比，

图6：在体外丹皮酚抑制SUV诱导的炎症反应。A.在老鼠皮肤中丹皮酚可抑制SUV诱导的炎症反应，p38的磷酸化水平和JNKs，TOPK水平，以及γ-H2AX水平。B.丹皮酚治疗后小鼠皮肤中炎性细胞因子IL-6和TNF-α的分泌明显降低。定量数据都用均数±标准差表示。(###)表示与对照组比较有显著性差异(P＜0.001)。*表示与SUV刺激组比较有显著性差异(***P＜0.01，**P＜0.05).

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细地说明。需要说明的是，本发明的实施例仅限于对本发明进行说明，而没有限制作用。实施例中所涉及的有关试验方法和其它各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。

实施例一 本发明实施中包含的材料与方法

1、SUV设备、试剂和抗体

日光紫外线的设备购自Q-Lab公司(Cleveland，OH)。用紫外辐射计测量UVA和UVB的百分比，分别为92.5％和7.5％。丹皮酚(Paeonol)(纯度＞99％)是购自成都瑞丰四生物科技有限公司(成都，中国)。PGEX-GST H2AX人类质体购自addgene公司，活性TOPK购自Millippore(Billerica，MA，USA)。TNF-α和IL-6的ELISA试剂盒从达科为生物技术有限公司(深圳，中国)购买。总TOPK、总JNKs、总p38、H2AX抗体，磷酸化的TOPK(Thr9)、磷酸化的JNKs(Thr183/Tyr185)，磷酸化的p38(Thr180/Tyr182)，和磷酸化H2AX(Ser139)购自Cell Signaling Technology(USA)。β-actin抗体和辣根过氧化酶(HRP)的二抗购自Santa Cruz(USA)和Earth Ox life sciences company(San Francisco US)。

2、细胞培养

人类皮肤角朊细胞HaCat细胞和小鼠表皮JB6c141细胞均来自American Type Culture Collection(ATCC，USA)，对它们进行体外培养，使用由ATCC提供的方法。HaCaT细胞培养在DMEM培养基，含10％胎牛血清(FBS)而JB6c141细胞用MEM培养基培养，含5％胎牛血清(FBS)。这些细胞均在37℃下含加湿空气和5％CO2的孵化器中进行培养。

3、MTS法检测细胞存活率。细胞接种于96孔板(1000/孔)过夜，然后用不同浓度的丹皮酚(0，50，100，200，400μm)和不同时间(24，48，或72小时)。用MTS检测试剂盒测定细胞存活率(Promega公司，麦迪逊，WI)根据制造商的指示，在490nm处的吸光度读取数据。

4、Western blot

HaCaT细胞或JB6c141首次接种于6cm的接种板中。经过24小时的培养和12小时的饥饿，同时接受SUV的照射刺激。细胞接受不同剂量的SUV(0，10，20，30，40，50，60kJ/m²)照射或在不同延迟时间(0，5，15，30，60分钟)后进行收样。为了研究丹皮酚的影响，第一步让细胞在无血清培养基中饥饿12小时，然后在接受SUV照射前经丹皮酚(25，50，3，6，100mm)进行处理3，6，or 12小时。收样后，在细胞裂解缓冲液中进行破坏，超声45秒，12000转下离心10分钟，用Bradford法测定细胞蛋白浓度。样品(20-30μG)首先用5×SD的适当比例缓冲液进行稀释，然后加热到95℃10分钟。样品经SDS-PAGE分离，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。膜用5％脱脂牛奶或5％的BSA TBST进行阻断。接下来，他们在4℃环境下与一个特定的初级抗体一起孵育一夜。利用ECL系统(Bio-Rad，美国)对蛋白条带进行可视化测定。所有结果均来自至少三个独立实验。

5、Gst-h2ax融合蛋白的表达和纯化

大肠杆菌被用来表达人Gst-h2ax融合蛋白。当细菌生长在37℃恒温培养混合器中同时接收在600nm0.8-0.9的吸光度，紧接着他们在37℃环境中用1mM的异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)再诱导1-2小时，然后通过离心收样。经过反复冻融，细胞颗粒悬浮在磷酸盐缓冲液(PBS)。细胞裂解液在最大强度的冰冻环境下进行声处理20分钟，在转速3000rpm下离心10分钟。然后他取上清液在4℃谷胱甘肽琼脂糖珠培养基(GE，美国)上培养过夜。PBS洗涤，用50毫米的谷胱甘肽反复冲洗3次。

6、微量热泳动实验(MST)

丹皮酚固体可溶于ddH₂O，然后用浓度为4mM缓冲液进行稀释，作为工作液I，检测缓冲液是包含10(v/v)％DMSO。工作液I，所含浓度最高，以确保其亲和力。将其与检测缓冲液按照1∶2的比例进行混合稀释，分成12份，放在不同容器内。将相同浓度相同体积的200nm重组TOPK加入到每份工作液中。使用微型热泳动测试解离常数Kd值。

7、体外激酶测定

体外激酶的测定包括：Gst-h2ax蛋白，活性TOPK，和ATP。在1个含100μm ATP的蛋白激酶缓冲液可以检测到反应。在30℃孵育30分钟后的反应是有5×SDS组缓冲液停上混合，被SDS-PAGE分离。磷酸化组蛋白H2AX，总H2AX，总TOPK分别被检测。

8、动物研究

30只雄性Balb/c小鼠(6周大)购于湖北疾病预防控制中心(湖北，中国)。饲养于12小时为周期的光/暗环境里，温度可控，饲养1周，于实验24小时前剃毛。将小鼠随机分为3组：对照组(n＝10)，对照加SUV组(n＝10)，丹皮酚(60mg/kg)加SUV组(n＝10)。在对照组小鼠安乐死之前3小时于背部皮肤上抹上丙酮。对照加SUV组给予涂抹丙酮3小时后用100kJ/m²suv光进行照射。在丹皮酚加SUV组给予用60mg/kg丹皮酚处理丙酮然后用100kJ/m²suv灯光进行照射。SUV照射后24小时后处死小鼠，并取背部皮肤组织。一半的组织，立即进行4％多聚甲醛苏木精-伊红(HE)染色和免疫组织化学(IHC)。其余均被冷冻在-80℃的冰箱待进行酶联免疫分析。所有动物实验均按照华中科技大学同济医学院实验动物中心的规定完成。

9、免疫组织化学

抗原修复是将人类和小鼠的皮肤切片(5μm)放入枸橼酸钠缓冲液，10分钟后用微波进行脱蜡和水化。然后再用3％过氧化氢处理的切片，10分钟。下一步，在室温下部分用5％山羊血清被封锁1小时。然后各部分在4℃下滴入相应的初级抗体孵育一宿。利用生物素-链亲和素和DAB系统进行显色反应。所有的切片应用苏木精进行反染色。应用医学图像分析系统(MIA)对图像进行免疫组化分析。

10、统计分析

所有的定量数据都用均数±标准差表示。进行t检验或单因素方差分析。P＜0.05被认为差异有统计学意义。

实施例二 丹皮酚结合TOPK并抑制其活性。

基于全面的光谱分析和之前公布的数据，丹皮酚被鉴定为一个已知的1-(2-羟基-4-甲氧苯基)乙酮(图3A)。用MTS法测定丹皮酚的毒性，HaCat和c141 JB6细胞分别用不同浓度的丹皮酚(0，50，100，200，400μm)进行处理及不同时间(24，48，72h)。结果表明，丹皮酚对JB6 c141和HaCat细胞均没有明显的细胞毒性(图3b)。

验证丹皮酚能否与TOPK结合。MST法是一种光学的方法，其特点是非液相，而且样品消耗低。它可以高灵敏的量化蛋白质-蛋白质相互作用或小分子蛋白质的相互作用。用MST实验测试丹皮酚和TOPK之间的亲和力。在这项研究中，丹皮酚具有相当低的平衡解离常数(Kd)7670+/-690nm，表明与TOPK有很强的亲和力(图3c)。体外蛋白激酶测定表明，随着丹皮酚的浓度从12.5um增加到50um，被活性TOPK催化的γ-H2AX水平逐渐降低(图3d)。这些数据表明，丹皮酚能与TOPK结合并抑制其活性，而且无明显的细胞毒性。

实施例三 丹皮酚抑制SUV诱导的p38和JNK的激活过程。

JB6细胞在使用20kJ/m²的SUV照射下对丹皮酚预处理12小时，厚度从25um到100um，同时检测p38磷酸化或JNKs水平。结果表明，水平逐渐降低(图4A)。其次，在20kJ/m²的SUV照射下经100um丹皮酚培养的JB6细胞随培养时间从3小时增加到12小时，p38磷酸化或JNKs的水平也逐渐下降(图4B)。HaCaT细胞中得到了相似的结果(图4c、4d)。这些数据表明，丹皮酚能抑制SUV体外诱导的JNK或p38的激活。丹皮酚成时间和剂量依耐性下调SUV诱导的下游的TOPK信号通路，同时抑制JB6 c141和HaCaT细胞内细胞因子的分泌。

实施例四 丹皮酚降低TOPK相关的DNA损伤的标志物组蛋白H2AX

组蛋白H2AX是DNA损伤的标志物质，也是TOPK作用物之一，可以在ser-139(γ-H2AX)被TOPK磷酸化，γ-H2AX是DNA双链断裂的生物标志物。Mskl是p38蛋白激酶的下游底物和DNA损伤相关。TOPK是p38的上游蛋白激酶。在本发明观察中，JB6细胞在使用20kJ/m²的SUV照射下对丹皮酚预处理12小时，厚度从25um到100um，MSKl的磷酸化水平、H2AX或TOPK逐渐减少(图5A)。其次，在20kJ/m²的SUV照射下经100um丹皮酚培养的JB6细胞随培养时间从3小时增加到12小时，p38磷酸化或TOPK的水平也逐渐下降(图5b)。类似的结果在HaCat的细胞中也可观察到(图5c、5d)。

实施例五 丹皮酚降低炎症因子TNF-α和IL-6分泌

在本发明观察中，在JB6或HaCat细胞内，被20kJ/M²的SUV照射刺激TNF-α或IL-6的分泌过程被100um的丹皮酚抑制(图5e)。这些结果表明，丹皮酚能抑制SUV诱导的DNA损伤，通过抑制TOPK活性，同时丹皮酚抑制了体内细胞因子的分泌。因此，体外和体内实验中，丹皮酚均可以抑制SUV诱导的炎症反应。

实施例六 丹皮酚抑制SUV诱导的动物皮肤炎症反应

在小鼠皮肤组织采用HE染色观察中发现，经100KJ/m²的SUV照射后，表皮角化过度后，炎性细胞浸润，多灶性间质水肿。这些都是皮肤炎症的迹象。其次，与对照组相比，小鼠组织经照射后，TOPK，p38磷酸化水平、JNK、γH2AX均增加(图6a)。第三，小鼠皮肤组织经照射后，分泌的细胞因子IL-6和TNF-α的浓度均增加，而且在小鼠皮肤照射前涂抹丹皮酚(60mg/kg)可有效抑制这一炎症反应(图6b)。这些数据表明，丹皮酚能抑制SUV引起的皮肤炎症和DNA的损伤。

通过以上实施例，结合TOPK的生理、病理生理学方面的分子生物学功能，可以看出，除了在本发明中丹皮酚通过结合并抑制TOPK活性预防和/或治疗TOPK活性异常增高的皮肤炎症，如UV诱发的光线性皮肤病(日晒伤和慢性光化性皮炎)之外，推测丹皮酚也可以通过结合并抑制TOPK的活性预防和/或治疗TOPK活性异常增高的其他皮肤炎症和肿瘤，如各型银屑病、红斑狼疮、日光角化症、黑色素瘤、皮肤鳞癌等，以及人体其他系统器官组织TOPK活性异常增高的炎症和肿瘤。同时，推测丹皮酚更大的用药剂量，可能产生更好的效果。