治疗奶牛乳房炎的中药组合物及其贴膜剂的制备方法与流程

本发明涉及治疗奶牛乳房炎的药物，具体涉及一种治疗奶牛乳房炎的中药组合物及其贴膜剂的制备方法。
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：奶牛乳房炎的研究现状：奶牛乳房炎是病原微生物感染、环境、饲养管理等因素综合作用引起的奶牛乳腺炎症，中兽医称为乳痈。奶牛乳房炎常造成奶牛泌乳量下降、鲜奶质量降低、治疗费用增加、牛群更替成本增加、影响人体健康等危害。作为奶牛生产中最常见的一种疾病，奶牛乳房炎给奶牛业造成了巨大损失。我国奶牛子宫内膜乳房炎的发病率达20％～70％。我国对奶牛乳房炎的研究起于20世纪80年代初，现已取得了一定成绩。研究显示，引起奶牛乳房炎的主要致病菌以链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和霉形体为主。发病过程为：微生物入侵—乳腺内建立感染—乳房形成炎症。奶牛乳房炎治疗方法的研究现状：奶牛乳房炎常用的治疗措施有：全身治疗、局部治疗(乳房灌注、乳房软膏剂涂抹)和封闭治疗。全身性治疗主要有饲喂或灌服抗生素、中草药散剂或汤剂，或注射大剂量抗菌药物。全身用药时乳房局部的药物难以达到或维持有效浓度，且大量使用抗生素可导致血液和奶产品中抗生素残留量超标。局部治疗主要采用乳房灌注或乳房涂抹软膏剂。局部治疗虽有利于增加药物利用率，但仍有乳房灌注操作繁琐，对乳房形成刺激，软膏剂不易保持，损失药物的缺点。中医对奶牛乳房炎的研究简况：中兽医认为，奶牛乳房炎属乳痈范畴。多因肝气郁滞，乳汁瘀积，兼感风寒之邪结聚而发。治宜舒肝理气，活血清热，通乳散结。根据中医药学理论，选择合适的中药进行组方，不仅可收到理想的治疗效果，而且可以解决抗生素和激素残留、耐药菌株产生等问题。故根据中医辨证施治原则，分析药材现代药理研究，采用治疗乳痈的金银花、蒲公英、等中药材配合活血清热、通乳散结的药材，用于治疗奶牛乳房炎，分析严谨，思路新颖，具有明显优势，可制成疗效确切、能广泛应用于市场的新药，填补国内空白。技术实现要素：本发明目的在于提供一种用于治疗奶牛乳房炎的中药组合物，可以改善病牛的症状，无激素残留，无耐药菌株产生，提高用药安全性。本发明还提供该中药组合物的贴膜剂的制备方法，可以延长作用时间、增加药物利用率、避免药物损失、减少乳房刺激。本发明的解决方案是：一种治疗奶牛乳房炎的中药组合物，其特殊之处在于：包括以下重量份数的原料：金银花20～40份、蒲公英40～80份、紫花地丁40～80份、蜂房8～16份、漏芦16～30份、栝楼16～30份、黄芩15～25份、木通0～24份、丝瓜络0～30份、薄荷脑0～3份。本发明的中药组合物主治奶牛乳汁瘀滞，乳头破损，致乳汁排出不畅，余乳积存，致使乳络闭阻，乳汁瘀滞，日久败乳蓄积，化热而成痈肿。奶牛乳痈，多为频繁挤奶所致乳房受损、皮肤受损，加之环境影响，后继邪毒入侵，发乳房红肿硬痛，乳汁状态改变，并可能出现体温升高、反刍减少、沉郁等全身症状。治宜清热解毒、消痈散结，通乳排毒，消肿定痛。方以金银花为君，其性甘、寒善清热解毒，消炎退肿。《本草正》：“其性微寒，善于化毒。故治痈疽肿毒，疮癣，杨梅，风湿诸毒，诚为要药。毒未成者能散，毒已成者能溃。但其性缓，用须倍加或用酒煮服，或捣汁掺酒顿饮，或研烂拌酒厚敷。”主治痈肿疔疮及多种感染性疾病。蒲公英、紫花地丁、栝楼、漏芦均清热解毒、消痈散结，共为臣药。丝瓜络、木通通经下乳，黄芩清热燥湿、泻火解毒，蜂房祛风止痛，诸药疏经通络，消肿止痛，共为佐药。薄荷脑为使，辛凉走窜，即疏散风热，疏肝行气，又助药力直达病所。诸药合用，共奏清热解毒，消痈散结之功。优选的，治疗奶牛乳房炎的中药组合物原料中，木通12～24份、丝瓜络16～30份、薄荷脑1～3份。优选的，治疗奶牛乳房炎的中药组合物原料中，金银花30份、蒲公英60份、紫花地丁60份、蜂房12份、漏芦24份、栝楼24份、黄芩20份，木通18份、丝瓜络24份、薄荷脑2份。上述中药组合物的中药制剂，所述制剂类型为内用制剂或外用制剂；所述内用制剂包括颗粒剂、片剂、胶囊、丸剂、煎膏剂、糖浆剂、露剂；所述外用制剂包括贴膜剂、粉剂、溶液剂、软膏剂、糊剂、酊剂、凝胶剂。上述中药组合物的贴膜剂，其特殊之处在于：原料还包括防腐剂0～3重量份、聚乙烯醇178820～40重量份、羧甲基纤维素钠8～16重量份、保湿剂10～40体积份、促渗剂3～8体积份、聚乙烯醇17990～40重量份、吐温-800～5体积份，重量份的单位为g，体积份的单位为ml。具体的，上述保湿剂为甘油，防腐剂为苯甲酸钠，促渗剂为氮酮。优选的，上述苯甲酸钠1～3重量份、聚乙烯醇179920～40重量份、吐温-802～5体积份。优选的，上述苯甲酸钠1重量份、聚乙烯醇178830重量份、羧甲基纤维素钠12重量份、聚乙烯醇179930重量份、甘油30体积份、氮酮5体积份、吐温-803体积份。上述贴膜剂的制备方法，其特殊之处在于：包括按照时间顺序的以下步骤：(1)各中药原料分别称重；(2)将蒲公英、紫花地丁、蜂房、漏芦、栝楼、黄芩混合，有木通和丝瓜络时，一块混合加水煎煮；(3)过滤步骤2的煎煮液，将滤液静置后，取上清液；(4)步骤3得到的上清液浓缩至每毫升含药材0.8-1.2g，加入金银花，停止加热，自然冷却，过滤；(5)向步骤4的滤液中加入聚乙烯醇1788浸泡溶胀；(6)将羧甲基纤维素钠加入步骤5得到的溶液中，边加边搅拌，溶胀；(7)将加入聚乙烯醇1788、羧甲基纤维素钠的药液水浴加热，搅拌混匀；(8)向步骤7得到的溶液中加入防腐剂、保湿剂、吐温-80、促渗剂，水浴加热，搅拌混匀；原料中有薄荷脑时，再向水浴加热后的溶液中加入薄荷脑快速搅匀；(9)将步骤8得到的溶液平铺在涂抹过液体石蜡的水平板上，使每平方厘米含药材0.03-0.045g；(10)放置干燥，形成药膜；(13)将药膜揭下，敷于防粘纸上。优选的，上述贴膜剂的制备方法中，步骤10和13之间还保护步骤11和步骤12，步骤(11)将聚乙烯醇1799加水浸泡溶胀，加入保湿剂，水浴加热至均一透明胶体；步骤(12)将步骤11得到的透明胶体平铺至步骤10得到的干燥的药膜上，放置干燥。本发明的优点是：(1)本发明的中药组合物，具有良好的抑菌效果:抑菌试验表明本发明制备的中药组合物提取液具有优良的抑菌效果。①抑菌圈测定试验表明贴膜剂药材提取液对黄色葡萄球菌、大肠杆菌具有不同程度的抑制作用，对金黄色葡萄球菌高度敏感，对大肠杆菌中度敏感。②最低抑菌浓度试验表明提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有一定的抑制作用，中对金黄色葡萄菌的抑菌效果好于大肠杆菌，其MIC分别为8mg/mL、31mg/mL。③最低杀菌浓度试验结果显示，药材提取液对2种试验菌均有一定的杀菌效果，其中对金黄色葡萄菌的杀菌效果优于对大肠杆菌的杀菌效果。对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为31mg/mL，对大肠杆菌的最低杀菌浓度为125mg/mL。(2)本发明的中药组合物，具有良好的抗炎效果：抗炎试验结果表明本发明制备的中药组合物及中药制剂具有优良的抗炎效果。给药1h、2h后，与空白组比较，在左右耳片差值、肿胀率、肿胀抑制率方面，各给药组均有显著性减小。且贴膜剂与等剂量提取液比较，在左右耳片差值、肿胀率、肿胀抑制率方面，均有显著性减小。(3)本发明的中药组合物，与西药特别是抗生素类药物相比，残留量小，毒副作用小，可避免耐药性和药物残留的发生；各药材配伍发挥综合作用、可扶正祛邪，提高机体抗病能力：药物残留试验结果表明本发明制备的中药组合物及中药制剂药物残留量不影响乳液发酵，可克服抗生素残留影响；贴膜剂在给药及停药过程中病牛牛乳均发酵正常，外观均匀凝固，其乳酸菌发酵不受影响。急性毒性与皮肤刺激性试验表明本发明的中药组合物毒副作用小。(4)本发明制成的中药贴膜剂：能够在较长时间内保持相对恒定的血药浓度。贴膜剂直接作用于发病部位，贴膜剂的有效成分经皮肤吸收直接进入体内，可避免药物的“首过效应”及胃肠道反应，故而收效快，又在延长作用时间、增加药物利用率、避免药物损失、减少对乳房刺激等方面具有优于灌注剂和软膏剂的优势；具有使用方便的优点，减少工作时间与劳动量。(5)本发明中药贴膜剂的制备工艺：采用双层膜制备工艺，利用不同规格聚乙烯醇的物理性能差异，使含药的内层吸水溶胀迅速，利于贴敷于乳房表面，使外层的膜光洁致密，起到保护内层、防水及防污的作用。附图说明图1混合对照品HPLC色谱图(327.0nm)；图2混合对照品HPLC色谱图(280.0nm)；图3贴膜剂样品HPLC色谱图(327.0nm)；图4贴膜剂样品HPLC色谱图(280.0nm)；图5金银花阴性贴膜剂样品HPLC色谱图(327.0nm)；图6黄芩阴性贴膜剂样品HPLC色谱图(280.0nm)。具体实施方式实施例一：本发明的中药组合物原料见表A：表A：中药组合物原料实施例1.1-1.8中的中药原料可以做成内用制剂或外用制剂；所述内用制剂包括颗粒剂、片剂、胶囊、丸剂、煎膏剂、糖浆剂、露剂，内用制剂都需将原料煎煮；煎煮方法可以采用现有常规煎煮方法，包括但不限于以下方法：(1)各中药原料分别称重；(2)除金银花以外的中药原料混合，按10、8、6倍加水量煎煮3次，煎煮时间分别为1h、1h、0.5h；(3)以80-120目(优选100目)滤布过滤煎煮液，滤液静置过夜，上清液合并；(4)步骤3得到的上清液浓缩至每毫升含原药材0.8-1.2g，优选1g，加入金银花，停止加热，自然冷却，过滤；实施例1.1-1.8中的中药原料还可以做成外用制剂；所述外用制剂包括贴膜剂、溶液剂、软膏剂、糊剂、酊剂、凝胶剂，优选制成贴膜剂，在实施例1.1-1.8的中药原料的基础上加入表B中的辅料组分，可以制成贴膜剂。表B:本发明的中药组分制成贴膜剂所需的辅料组分辅料组分实施例2.1实施例2.2实施例2.3苯甲酸钠0g2g6g聚乙烯醇178840g60g80g羧甲基纤维素钠16g23.2g32g聚乙烯醇17990g60g80g甘油20ml60ml80ml吐温-800ml5ml10ml氮酮6ml10ml16ml制成贴膜剂的具体方法包括前述步骤1-4，还包括按照时间顺序进行的以下步骤：(5)步骤4的滤液加入聚乙烯醇1788，浸泡12小时左右；(6)将羧甲基纤维素钠加入，边加边搅拌，溶胀12小时左右；(7)将加入聚乙烯醇1788、羧甲基纤维素钠的药液水浴加热，搅拌混匀；(8)加入苯甲酸钠、甘油、吐温-80、氮酮，水浴加热，搅拌混匀；(9)原料中有薄荷脑时，加入薄荷脑快速搅匀，平铺至75％酒精消毒、涂抹液体石蜡的水平玻璃板上，使每平方厘米含药材0.03-0.045g，优选0.039g；(10)放置干燥，形成药膜；(13)将药膜揭下，敷于防粘纸上，裁剪为10×14cm2的片状药贴100片，自封口塑料袋包装。上述步骤制成的贴膜剂是单层膜，该单层膜含药，吸水溶胀迅速，具粘合力，可直接贴敷于乳房表面，但是在外力下不易保持。因此，在上述步骤10和步骤13之间，加入步骤11和12，此时，制成的贴膜剂是双层膜(在内层膜的基础上加了外层膜)。外层膜具有光洁致密的特点，起到保护内层、防水、防污的作用。(11)将聚乙烯醇1799加水浸泡过夜，加入甘油，水浴加热至均一透明胶体；(12)将步骤11得到的透明胶体平铺至步骤10得到的干燥的药膜上，放置干燥。以下通过实验证明本发明的有益效果。1、本发明中药组合物的抑菌效果试验。1.1材料1.1.1药材提取液的制备按照上述步骤1-4，制备实施例1.1-1.8的药材提取液，下面以1.2为例，验证抑菌效果。1.1.2对照品溶液的制备精密称取泰乐菌素、林可霉素、庆大霉素对照品(编号分别为K0160911、K0100708、W-Z-5-02，含量分别为1026、843、635μ/mg，中国兽医药品监察所)适量，灭菌水稀释为1000μ/mL；精密称取粘菌素对照品(编号K0270905，含量22156μ/mg，中国兽医药品监察所号)适量，灭菌水稀释为25000μ/mL。1.1.3菌液的制备1.1.3.1取生长于普通营养琼脂平板上的金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、大肠埃希菌CMCC(B)44102(中国兽医药品监察所)用接种环蘸取少量菌落，接种到5mL的MH肉汤中，37℃200r/min振荡培养4～6h；1.1.3.2取对数生长期的菌液，用灭菌生理盐水将浓度调至0.5标准麦氏比浊管，使其含菌量约1～2×108CFU/mL；1.1.3.3再将上述菌液用灭菌生理盐水进行1:1000稀释，此时菌液浓度约为1～2×105CFU/mL，稀释好的菌液应在15min内使用。1.2方法1.2.1抑菌圈的测定以打孔器制作直径6.5mm的滤纸圆片，160℃干烤灭菌。将试验菌液均匀接种于营养琼脂培养皿上，用灭菌镊子夹取滤纸片，排列贴附于琼脂表面，用微量移液器向滤纸片滴加药材提取液、对照品溶液20μL，做好标记，37℃培养24小时，用游标卡尺测抑菌圈的直径，以抑菌圈直径来评定药物的抑菌效果，每株菌种重复六次，取平均值。1.2.2最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度的(MBC)测定采用连续倍比试管稀释法。取MH肉汤培养基按说明配制，于121℃高压灭菌30min，取10支灭菌试管，各管分别加入MH肉汤1mL；用无菌枪头吸取ImL药材提取液于第1管中，混匀后吸取ImL于第2管中，依次稀释到第8管，第8管混匀后吸取ImL弃去，第9、10管不加药材提取液做对照；在第1管至第9管中分别加入己稀释好的菌液O.1mL，使每管的最终菌液浓度约为1～2×104CFU/mL，此时第1管至第8管的药物浓度分别为500、250、125、63、31、16、8、4mg/mL，第9管做阳性对照，在第10管中加入O.1mL灭菌生理盐水做阴性对照；将接种好的稀释管塞好塞子，置37℃培养箱中孵育16～20h，肉眼观察，不发生浑浊变化的最高药物稀释倍数为该药物的MIC值；用移液器从各个清晰无细菌生长的试管中吸取0.1mL培养液接种于普通营养琼脂平板，37℃培养箱中培养18～24h，以菌落数不超过5个的最低药物浓度为该药物的MBC值；每组药物均应做三次重复试验，取平均值。连续倍比试管稀释法试验操作详见表1。表1连续倍比试管稀释法注:“-”表示不加该种试剂。1.3试验结果1.3.1抑菌圈测定结果药材提取液对2种试验菌具有不同程度的抑制作用，对金黄色葡萄球菌高度敏感，对大肠杆菌中度敏感；各抗生素对照品对2种细菌也产生了不同的抑菌效果，结果见表2。表2抑菌圈测定结果(直径mm)药材提取液泰乐菌素林可霉素粘菌素庆大霉素金黄色葡萄球菌16.5819.7818.93/24.08大肠杆菌10.99//11.7518.30注：抑菌圈直径<10mm为耐药(-)，10～15mm为中度敏感(+)，15mm以上为高度敏感(++)；“/”为未出现抑菌圈。1.3.2贴膜剂药材提取液对试验菌株的MIC测定结果药材提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有一定的抑制作用。其中对金黄色葡萄菌的抑菌效果好于大肠杆菌。其MIC分别为8mg/mL、31mg/mL，结果见表3。表3贴膜剂药材提取液MIC测定结果注：“+”表示试管有菌生长，“-”表示试管无菌生长1.3.3药材提取液对试验菌株的最低杀菌浓度(MBC)测定结果最低杀菌浓度试验结果显示，药材提取液对2种试验菌均有一定的杀菌效果，其中对金黄色葡萄菌的杀菌效果优于对大肠杆菌的杀菌效果。对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度为31mg/mL，对大肠杆菌的最低杀菌浓度为125mg/mL，结果见表4。表4贴膜剂药材提取液MBC测定结果注：“-”表示试管无菌生长抑菌圈直径测定、MIC和MBC试验结果表明，本制剂对奶牛乳房炎的2种主要致病菌—金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有不同程度的抑制作用，较泰乐菌素、林可霉素、粘菌素抑菌范围广。结合其他实施例抑菌实验的结果，得出以下结论：实施例1.1-1.8均有明显的抗菌效果，实施例1.6的抗菌效果优于其他实施例，但经济效益低；实施例1.1-1.4的抗菌效果均略次于实施例1.6，实施例1.7的抗菌效果次于实施例1.1-1.4，实施例1.5的抗菌效果最差。2、本发明的贴膜剂对小鼠的抗炎作用。2.1试验方法SPF级KM小鼠，日龄25～30d，体质量18～22g，雌雄各半，购自山东绿叶制药有限公司，生产许可证号SCXK(鲁)20140002。取小鼠300只随机分为10组，1组为空白组，2～4组分别为提取液A、B、C组(提取液A、B、C组是将实施例1.3组方的中药提取液浓缩成不同的浓度，用药量为40μL，耳壳双面涂抹，给药量分别相当于原药材0.04g、0.02g、0.01g)，5～7组为实施例1.3的中药组分及实施例2.2的辅料组分制成的贴膜剂大、中、小面积组(耳壳双面黏贴，面积分别为0.7×0.7cm2×2片，0.5×0.5cm2×2片，0.35×0.35cm2×2片，给药量分别相当于原药材0.04g、0.02g、0.01g)，8组为地塞米松对照组(20μL，耳壳双面涂抹)，9～10组为实施例1.2的中药组分和实施例1.1的中药组分分别与实施例2.2的辅料组分制成的缺少药材贴膜剂组(贴剂A组为缺少薄荷脑药材组，贴剂B组为缺少薄荷脑、木通、丝瓜络组，制备方式与贴膜剂制备方式相同，但缺少相应药材。中面积给药，给药量相当于原药材0.017g)。各组小鼠均于右耳正反面均匀涂抹二甲苯40μL[1]，，左耳作为空白对照。致炎1h后，分别在各组小鼠右耳按试验设计给药。于给药1h后，每组处死15只小鼠；给药2h后，处死剩余15只小鼠。小鼠处死后，剪下双耳，耳缘对齐，用打孔器在同一部位摘取耳片，分别称量左右耳质量，计算小鼠左右耳片差值、肿胀率、肿胀抑制率[2]。左右耳片差值＝右耳质量-左耳质量肿胀率＝(右耳质量-左耳质量)/左耳质量肿胀抑制率＝(空白组肿胀率-肿胀率)/空白组肿胀率2.2统计学分析所有数据以表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，若方差齐，组间均值两两比较采用S-N-K法，若方差不齐，组间均值两两比较采用DunnettT3法。所有统计均由SPSS13.0统计软件完成，α＝0.05。2.3结果结果见表5。可知，给药1h后，与空白组比较，左右耳片差值、肿胀率、肿胀抑制率方面，各给药组、对照组均有显著性减小(P＜0.01)。与等剂量提取液比较，左右耳片差值方面，给药量0.01g贴膜剂有显著性减小(P＜0.05)，给药量0.04g、0.02g贴膜剂有显著性减小(P＜0.01)；肿胀率方面，给药量0.01g贴膜剂有显著性减小(P＜0.05)，给药量0.04g、0.02g贴膜剂有显著性减小(P＜0.01)；肿胀抑制率方面，给药量0.02g贴膜剂有显著性减小(P＜0.01)，给药量0.04g、0.01g贴膜剂有显著性减小(P＜0.05)。全方组与缺少薄荷药材组比较，左右耳片差值、肿胀率、肿胀抑制率方面，各给药组、对照组均有显著性减小(P＜0.05)；与缺少薄荷脑、木通、丝瓜络3味药材组比较，左右耳片差值、肿胀率、肿胀抑制率方面，各给药组、对照组均有显著性减小(P＜0.01)。缺少薄荷药材组与缺少薄荷脑、木通、丝瓜络3味药材组比较，左右耳片差值、肿胀率、肿胀抑制率方面，各给药组、对照组均有显著性减小(P＜0.05)。给药2h后，与空白组比较，左右耳片差值、肿胀率、肿胀抑制率方面，各给药组、对照组均有显著性减小(P＜0.01)。与等剂量提取液比较，左右耳片差值、肿胀率、肿胀抑制率方面，贴膜剂组均有显著性减小(P＜0.01)。全方组与缺少薄荷药材组比较，左右耳片差值、肿胀率、肿胀抑制率方面，各给药组、对照组均有显著性减小(P＜0.05)；与缺少薄荷脑、木通、丝瓜络3味药材组比较，左右耳片差值、肿胀率、肿胀抑制率方面，各给药组、对照组均有显著性减小(P＜0.01)。缺少薄荷药材组与缺少薄荷脑、木通、丝瓜络3味药材组比较，左右耳片差值、肿胀率、肿胀抑制率方面，各给药组、对照组均有显著性减小(P＜0.05)。表5小鼠耳肿胀试验结果(n＝15)注：与空白组比较：*P＜0.01；与同等剂量提取液比较：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与贴剂中面积组比较：△P＜0.05，△ΔP＜0.01；与贴剂B组比较：○P＜0.05。结论：同等用药剂量，贴膜剂的抗炎效果优于提取液的抗炎效果；同等原料用量的前提下，缺少薄荷脑的贴膜剂效果次于全方贴膜剂，缺少薄荷脑、木通、丝瓜络的贴膜剂效果次于缺少薄荷脑的贴膜剂。3、贴膜剂对健康家兔的急性毒性与皮肤刺激性试验。3.1透皮贴膜剂急性毒性试验贴膜剂组方以传统治疗乳痈的中药验方为基础，按照中医药理论，结合清热解毒中药，采用现代制药方式制备的外用中药复方制剂。组方中各药材药理学研究结果均显示药物作用温和。为验证新制剂技术对药理作用的影响，故采用家兔按临床给药途径进行急性毒性试验。3.1.1实验材料家兔，雌雄兼用，2.2-2.5kg，购自购自山东绿叶制药有限公司，生产许可证号SCXK(鲁)20140002。贴膜剂(自制，批号20140411，每平方厘米相当于原药材0.039g)。空白辅料膜(自制)。3.1.2.方法与结果取健康白色家兔20只，雌雄兼用，体重2.2-2.5kg，于给药前24h，将家兔背部两侧用剃毛器剃去被毛，去毛面积分别为5Ocm2。皮肤损伤组用手术刀在剃毛区皮肤上划出“井”切口，深度为2-3mm，以不损伤皮下组织并有渗血为止。第1组为空白对照组，敷空白辅料膜，药膜面积7cm×7cm×2片；第2组为实施例1.3的中药组分与实施例2.2的辅料组分制成的贴膜剂大剂量组(完整皮肤)，贴敷药膜面积为7cm×7cm×2片(相当于3.82g原药材)；第3组为贴膜剂小剂量组(完整皮肤)，贴敷药膜面积为5cm×5cm×2片(相当于1.95g原药材)。第4组，第5组分别为破损皮肤大、小剂量组，剂量设置同2、3组。取出贴膜剂，以温水涂抹含药层，使贴膜剂溶胀恢复粘性，贴于剃毛区，固定，保持24h后，除去贴膜剂，清理残留药物，观察动物1,24,48,72h至第7天的体重、饮食、大小便、活动、皮肤、毛发、眼、粘膜和呼吸等症状，并与对照组比较。结果见表6。表6贴膜剂对皮肤的急性毒性实验由结果可知，贴膜剂在急性毒性实验中，无论是完整皮肤还是破损皮肤，给药剂量为3.82g原药材每只时，家兔无一死亡和异常反应，证明贴膜剂对家兔无急性毒性。3.2贴膜剂的皮肤局部刺激试验3.2.1实验材料家兔，雌雄兼用，2.2-2.5kg，购自购自山东绿叶制药有限公司，生产许可证号SCXK(鲁)20140002。实施例1.3的中药组分与实施例2.2的辅料组分制成的贴膜剂(自制，批号20140411，每平方厘米相当于原药材0.039g)。空白辅料膜(自制)。3.2.2方法与结果取成年健康白色家兔16只，雌雄各半，体重2.2-2.5kg，将家兔背部脊柱两侧被毛剃除，剃毛面积每侧约为25cm2。随机分为4组，完整皮肤高、低剂量组与破损皮肤高、低剂量组。破损皮肤组用手术刀在左侧脱毛区皮肤上划出“井”切口，深度为2-3mm，以不伤皮下组织并有轻度渗血为止。采用同体左右两侧自身对比，右侧去毛区敷贴膜剂，面积为3cm×3cm(相当于原药材0.35g)，左侧去毛区敷空白辅料膜作为对照，面积为3cm×3cm。取出贴膜剂，以温水涂抹含药层，使贴膜剂溶胀恢复粘性，贴于剃毛区，固定。高剂量组每日早、晚各给药1次，低剂量组每日早上给药1次，每次给药保持时间4h，连续给药7日。每次贴敷结束后，除去药贴，清洁贴药部位，一小时后观察皮肤状况并评分。末次给药结束后，记录去除受试药物后24,48,72h的贴药部位皮肤状况并评分。评分标准见表7，评分结果见表8。表7皮肤刺激反应评分标准表8对家兔皮肤刺激分值表9皮肤刺激性强度评价标准由以上结果可见，无论高剂量还是低剂量，完整皮肤组受试兔均未出现红斑和水肿，分值均记分为0，按评分标准判断为未受刺激；破损皮肤组受试兔皮肤均未出现水肿，出现的轻微红斑不在一只受试兔上，且下次观察评分时均消褪，平均分值记为0.25，根据评分标准判定为无刺激性。在试验的一周内，16只受试兔精神良好，采食、尿液及粪便均正常，未见中毒或异常症状。说明透皮贴膜剂无皮肤刺激性。4、贴膜剂稳定性试验。采用加速试验进行贴膜剂稳定性考察。加速试验在超常条件下进行，通过加速中药、天然药物的化学或物理变化，探讨其稳定性，为中药、天然药物制剂的审评、工艺改进、包装、运输及贮存提供必要的资料。4.1仪器与材料4.1.1仪器：HPS—250生化培养箱(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)4.1.2材料：实施例1.3的中药组分与实施例2.2的辅料组分制成的贴膜剂3批(批号：20140306、20140412、20140505，自制)；包装材料：塑料袋，密封；Na2CrO4饱和溶液(30℃，RH64.8％)4.2方法：取3批制剂，在30℃±2℃、RH65％±5％的条件下放置6个月。在试验期间第0、1、2、3、6个月末取样，按稳定性重点考察项目检测。4.3结果：各时间点贴膜剂性状外观、主成分含量、微生物限度试验结果均符合质量标准要求，结果见表10。表10贴膜剂稳定性试验结果试验表明，在密封情况下，贴膜剂性状外观、主成分含量均无明显变化，微生物限度符合质量标准要求。5.贴膜剂治疗中牛奶药物残留对乳酸菌发酵的影响5.1材料与方法5.1.1试验药物实施例1.3的中药组分与实施例2.2的辅料组分制成的贴膜剂(自制，批号20140411，每平方厘米相当于原药材0.039g)，放置于4℃冰箱中，备用。注射用氯唑西林钠，上海康复特兽用化学制药有限公司生产，规格0.5g，批号20140301。5.1.2试验动物于烟台市莱山奶牛场选择同处于泌乳期、日均产奶量相当的泌乳奶牛，经CMT乳房炎诊断试剂检测呈强阳性的奶牛8头。5.1.3试验设计8头奶牛随机分成两组，一组用贴膜剂外贴给药，每天3次(每次挤奶后均贴敷)，另一组用氯唑西林钠灌注给药，每天上午、下午各一次，均连用4天。分别采集用药前和用药后第2天、第4天、第6天、第8天的乳样，经消毒灭菌后，按3％接种量接种保加利亚杆菌和嗜热链球菌呈1:1的混合物，42℃培养3.5h后观察酸乳样外观，并按照《GB5413.34-2010食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定》测定酸度。5.2结果与分析不同药物治疗对酸奶生产的影响如表11所示，氯唑西林钠治疗后第2天的乳样进行培养时，发酵受到严重抑制，不能产生足够的酸度使牛奶凝固，停药后抑制逐渐降低，酸度增加，至停药后第4天恢复至正常；而贴膜剂在给药及停药过程中均发酵正常，外观均匀凝固。表11不同药物治疗对酸奶生产的影响本发酵试验表明，与氯唑西林钠治疗相比，贴膜剂治疗奶牛乳腺炎的乳样，其乳酸菌发酵不受影响。6、实施例1.3的中药组分与实施例2.2的辅料组分制成的贴膜剂主成分含量6.1仪器、试药6.1.1仪器：Agilent1200型高效液相色谱仪(四元泵，柱温箱，在线脱气机，自动进样器，二极管阵列检测器，美国安捷伦公司)，AgilentZORBOXSB-C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm，美国安捷伦公司)，XS105十万分之一电子分析天平(瑞士梅特勒公司)，U-2010紫外可见分光光度计(日本日立公司)，DHL-1001型电热恒温干燥箱(龙口市先科仪器公司)，SK8200H超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。6.1.2试药：绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号：110753-201314，ID：AK2V-A9LL，含量96.6％)；黄芩苷(中国食品药品检定研究院，批号：110715-201318，ID：CT96-7QL7，含量93.3％)；乙腈(色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心)；水为三蒸水，其余试剂为分析纯。贴膜剂(自制，批号20140411，规格：每贴4.5g，含金银花原药材0.6g、黄芩原药材0.4g)，金银花、黄芩阴性贴膜剂样品(自制)。6.2方法与结果6.2.1溶液制备6.2.1.1混合对照品溶液：精密称取绿原酸36.08mg加甲醇溶解定容至100ml，黄芩苷38.42mg加甲醇溶解定容至50ml，得浓度为348.5μg/ml、716.9μg/ml的绿原酸、黄芩苷对照品溶液。将上述对照品溶液按1：1比例混合，得混合对照品溶液。混合对照品溶液中绿原酸、黄芩苷含量分别为：174.3μg/ml、358.5μg/ml。6.2.1.2供试品溶液及阴性样品溶液：将贴膜剂剪碎，称取4.5g，加蒸馏水40ml浸泡溶解，用镊子将不溶的保护层取出，蒸馏水冲洗，洗液合并至浸泡溶液中，将溶液转移至50ml容量瓶中，蒸馏水定容。精密量取浸泡液5ml至50ml离心管中，加无水乙醇30ml，摇匀，5000r/min离心10min，上清液转移至蒸发皿中，水浴蒸干。加甲醇20ml研匀，转移至25ml棕色容量瓶中，定容，超声提取20min，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。同法制备不含金银花与黄芩的阴性贴膜剂样品溶液。6.2.2色谱分析条件的优选经比较文献所采用的测定绿原酸、黄芩苷的方法[2、3、4、5]，发现有杂质峰不能与绿原酸良好分离。为能达到同时测定样品中绿原酸、黄芩苷两种成分的目的，采用梯度洗脱方式，以二极管阵列检测器进行检测。通过系统优化，确定色谱条件为：乙腈:0.2％磷酸水溶液20:80-60:40，30min线性梯度洗脱，流速：1.00ml/min，柱温：40.0℃，检测波长分别为绿原酸327.0nm,黄芩苷280.0nm，进样量10μl。在此条件下，样品分离效果好，其他成分对绿原酸、黄芩苷的测定无干扰(与相邻共存物之间的分离度大于2.6)，绿原酸、黄芩苷保留时间分别为3.5min、10.4min左右，理论塔板数均大于6000。混合对照品溶液与样品溶液色谱图见图1、图2、图3、图4。6.2.3空白对照实验按组方比例分别制得缺金银花(绿原酸)和缺黄芩(黄芩苷)的两种阴性样品，按6.2.1.2项下方法制备2种阴性样品溶液，按6.2.2项下色谱条件进样，记录色谱图，结果在绿原酸、黄芩苷对照品峰相对应处未出现色谱峰，见图5、图6。表明按本实验条件，处方中的其他成分不干扰绿原酸、黄芩苷的测定。6.2.4线性关系考察精密量取混合对照品溶液1.00ml、2.50ml、5.00ml、7.50ml、10.00ml至25ml容量瓶中，加入甲醇至刻度，混匀，制成分别含绿原酸为7.0、17.4、34.9、52.3、69.7μg/ml，黄芩苷为14.3、35.8、71.7、107.5、143.4μg/ml的标准溶液。按6.2.2项下优选出的色谱条件进样，记录液相色谱图、峰面积。结果见表12、表13。表12绿原酸线性关系试验结果表13黄芩苷线性关系试验结果对表12、表13数据进行线性回归，得绿原酸标准曲线为：Y＝725.1690X-0.8790，r＝0.9996；黄芩苷标准曲线为Y＝2098.2640X-24.8078，r＝0.9999。结果表明在此色谱条件下，绿原酸在0.14～1.39μg范围内，黄芩苷在0.29～2.87μg范围内线性关系良好。6.2.5精密度试验取绿原酸浓度为34.9μg/ml，黄芩苷浓度为71.7μg/ml的混合对照品溶液，按6.2.2项下色谱条件，连续进样5次，测定峰面积值，结果见表14。表14精密度试验结果结果表明，本方法精密度良好。6.2.6稳定性试验取供试液，室温下自然放置，分别于0、2、4、8、16小时，按6.2.2项下色谱条件进样，测定峰面积值，结果见表15。表15稳定性试验结果结果表明，样品溶液在16小时内稳定性良好。6.2.7重现性试验取同一批次样品6份,按6.2.1.2项下方法制备供试液，按6.2.2项下色谱条件进样测定，结果见表16。表中各成分含量为相当于每g制剂所含该成分的mg数。表16重现性试验结果结果表明此方法重现性良好。6.2.8加样回收试验称取已知含量的贴膜剂6份，每份约0.45g，精密加入绿原酸、黄芩苷混合对照品溶液(绿原酸浓度为174.3μg/ml，黄芩苷浓度为358.5μg/ml)10.00ml，浸泡混合均匀。按6.2.1.2项下方法制备供试液，按6.2.2项下色谱条件进样测定，计算回收率，结果见表17、表18。表17绿原酸加样回收试验结果表18黄芩苷加样回收试验结果结果表明，本法测定供试品中绿原酸、黄芩苷含量加样回收率良好。6.2.9绿原酸、黄芩苷含量测定结果按上述含量测定方法，测定不同批次贴膜剂中绿原酸和黄芩苷的含量，结果见表19。表中各成分含量为相当于每g制剂所含该成分的mg数。表19样品含量测定结果(mg·g-1,n＝3)7、临床试验研究为表明本发明的贴膜剂对奶牛乳房炎的治疗效果，本发明经144例临床应用，对临床型乳房炎治疗总治愈率达79.4％，总有效率为91.2％；对隐性乳房炎治疗总治愈率82.5％，总有效率92.5％。分别在烟台市各县市区奶牛养殖场进行了推广试验，从推广应用的情况看，该制剂具有使用方便，疗效可靠等优点，值得进一步扩大应用。7.1临床型乳房炎在烟台市莱山奶牛场、山东荷斯坦奶牛繁育中心有限公司选择临床型病例患病奶牛，共64头，依诊断标准区分为急性乳房炎型22头和亚急性乳房炎型42头，每型分别随机分为两组，一组以贴膜剂治疗，一组以氯唑西林钠乳房灌注治疗。临床型乳房炎诊断标准：(1)急性乳房炎。突然发病，乳房发红、肿胀、变硬、疼痛，乳汁显著异常和减少，出现全身症状。病牛体温升高，食欲减退，反刍减少，脉搏增速，脱水，全身衰弱、沉郁。(2)亚急性乳房炎。病牛一般没有全身症状，最明显的异常是乳汁中有絮片、凝块，并呈水样。乳房有轻微发热、肿胀和疼痛。使用方法：对病牛的患病乳区，先挤干奶，再将乳房洗净擦干。取出贴膜剂，以温水涂抹含药层，使贴膜剂溶胀恢复粘性。选择乳房被毛稀薄、表皮轻薄区域，将本品贴敷在患病乳区上，轻按保持数十秒，使贴膜剂与奶牛乳房表皮接合紧密。每个乳房两贴，保持至下次挤奶。挤奶后重复贴敷。每天3次(每次挤奶后均贴敷)，连用3～4天。使用注意:(1)本品为外用药，不可内服。(2)乳房坏疽、损伤性乳房出血忌用。(3)如有严重性的全身症状，应配合其它药物进行综合对症治疗。(4)对急性病例，发病初期，只能冷敷。对亚急性病例，在使用本品前进行热敷，可增强本品疗效。(5)使用前一定要将乳房洗净擦干，以免影响粘合效果并最终影响疗效。效果评价标准：(1)痊愈：凡治疗后病牛乳房红肿消退，乳汁恢复正常，产奶量恢复病前水平，精神食欲等恢复正常。(2)有效或好转：乳房红、肿、热、痛基本消失，乳汁尚有少量凝块，产奶量回升。(3)无效:病牛乳房症状无好转或转为慢性炎症。治疗效果:在对重症病例治疗过程中，治愈率只有75.0％(9/12)，而对轻症病例治愈率为81.8％(18/22)，总治愈率和总有效率分别为79.4％(27/34)和91.2％(31/34)；与此相对比，氯唑西林钠灌注对照组，对重症病例和轻症病例治愈率可分别为80％(8/10)和85.0％(17/20)，总治愈率和总有效率分别为83.3％(25/30)和90.0％(28/30))。结果见表20。表20“贴膜剂”对临床型乳房炎临床治疗结果从表中可以看出，贴膜剂对临床乳房炎具有显著的治疗效果，与同是局部给药的氯唑西林钠灌注治疗对照相比，治愈率略低，有效率略高，差异不显著。但中药贴膜剂不存在抗生素残留、耐药性问题，对后期牛奶收购影响较小。该结果也提示我们，对严重的临床型病例可配合使用青霉素等抗生素，绝对排除抗生素也是不合理的。7.2隐性乳房炎在烟台市莱山奶牛场、山东荷斯坦奶牛繁育中心有限公司选择临床型病例患病奶牛，共80头。随机分为两组，一组以贴膜剂治疗；另一组作为对照，不加处置。隐性乳房炎诊断标准：用CMT乳房炎诊断试剂检测阳性程度在“++”以上为隐性乳房炎病例。使用方法：对病牛的患病乳区，先挤干奶，再将乳房洗净擦干。取出贴膜剂，以温水涂抹含药层，使贴膜剂溶胀恢复粘性。选择乳房被毛稀薄、表皮轻薄区域，将本品贴敷在患病乳区上，轻按保持数十秒，使贴膜剂与奶牛乳房表皮接合紧密。每个乳房两贴，保持至下次挤奶。挤奶后重复贴敷。每天3次(每次挤奶后均贴敷)，连用6～8天。效果评价标准：(1)痊愈：经治疗后，用CMT检测，凡从“+++”(强阳性)转为“-”、“±”(阴性或可疑)判为治愈；(2)有效或好转：“+++”～“+”为好转；(3)凡“+++”“++”在治疗后不变的为无效。治疗效果:分别测定治疗当日、治疗第6天和治疗第8天的测定结果。治疗6天后，治愈率达65.0％(26/40)，有效率达82.5％(33/40)；至治疗8天后治愈率和有效率分别达82.5％(33/40)和92.5％(37/40)。对照组未见一头好转。结果见表21。表21“贴膜剂”对隐性乳房炎临床治疗结果从表可以看出，贴膜剂对隐性乳房炎也有较好的治疗效果，治疗8天后，总治愈率达到了82.5％(33/40)，总有效率为92.5％(37/40)。根据该结果，在使用贴膜剂治疗隐性乳房炎时，宜治疗6～8天，可获满意疗效。当前第1页1 2 3