一种岩生忍冬鞣质提取方法与流程

本发明属于鞣质提取技术领域，尤其涉及一种岩生忍冬鞣质提取方法及其抗菌活性。

背景技术：

岩生忍冬(Lonicera rupicola Hook.f.et.Thomson)为忍冬科忍冬属常绿藤木植物，主要分布于甘肃、宁夏南部、四川西部、云南西北部、西藏(林芝、错那)，在四川主要分布在海拔2.1-4.3km的灌木丛中。药用其叶和花蕾，具温胃止痛的功效。鞣质又称植物单宁或植物多酚，是一类广泛存在于植物体类的多元酚化合物，具有多种生理活性，如止血、抑制微生物、抗过敏、抗肿瘤、抑制脂质过氧化、抗突变、抗衰老、抗白内障、抗乙肝病毒，其主要表现为抗肿瘤作用，其抗脂质过氧化清除自由基作用等，鞣质除少数为结晶外，大多为灰白色无定形粉末，并多具有吸湿性。近年来，鞣质的研究、开发利用引起了国内外学者更广泛的关注。目前，鞣质的应用范围在不断扩大，如食品、医药、生化、材料、环保等领域。因而鞣质的提取也就得到了人们的高度重视。鞣质能溶于乙酸乙酯，乙醇，甲醇，丙酮等有机溶剂，由于乙酸乙酯则比较特殊，它亲水性差，除少量水饱和外，大多数情况下可与水很好的分层，利用此性质可以用乙酸乙酯萃取，鞣质的水溶液将大部分鞣质转移到乙酸乙酯层，而将较少量的水溶性杂质留在水层，从而达到提纯鞣质的目的。由于乙酸乙酯提取鞣质存在提取率低和提取步骤繁琐等弊端，因此开发一种以丙酮为提取溶剂的岩生忍冬鞣质成分提取方法，为岩生忍冬在川西北藏区畜禽疾病防控中广泛应用奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种岩生忍冬鞣质提取方法，旨在解决乙酸乙酯提取鞣质存在提取率低和提取步骤繁琐等问题。

本发明是这样实现的，一种岩生忍冬鞣质提取方法，所述岩生忍冬鞣质提取方法采用丙酮溶液提取法包括：

(1)将岩生忍冬粉碎，过40目药典筛；

(2)称取岩生忍冬5g，按1:20料液比加入50％丙酮，于40℃浸提2次，每次浸提时间50分钟；

(3)在循环水式真空泵和低温冷却液循环泵负压冷冻条件下，将上清液在50℃下用旋转蒸发仪RE-3000浓缩。

进一步，所述岩生忍冬鞣质最小抑菌浓度为5.882mg/mL。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述岩生忍冬鞣质提取方法提取的鞣质。

本发明提供的岩生忍冬鞣质提取方法，植物鞣质主要分为水解鞣质和缩合鞣质两大类，本发明提供的岩生忍冬鞣质提取物，经颜色反应鉴定，岩生忍冬中提取的鞣质为缩合鞣质。正交试验设计和分析方法是目前最常用的工艺优化试验设计和分析方法，其特点在于节能省时，流程简单、易操作，弥补了单一因素对提取工艺操作达不到优化的结果，从而使结果更加可靠。为优化岩生忍冬鞣质的提取工艺提供了理论方法依据。根据正交试验结果分析表明，采用丙酮溶液提取法对岩生忍冬中鞣质的最佳提取工艺条件为：丙酮浓度50％、浸提温度40℃、浸提次数2次、浸提时间50min。在上述最佳条件下，3次平行试验提取平均的总浸膏率为19.99％，均值都高于正交试验的浸膏率。3次平行试验所得的总浸膏经过活性炭脱色和乙酸乙酯萃取后得到的鞣质最终得率较高。由于鞣质具有氧化性和抗菌作用，提取物鞣质对除肠沙门氏菌肠亚种CGMCC1.10754、阴沟肠杆菌阴沟亚种CGMCC1.1022外的12种标准菌都有一定的抑制作用，测得其最小抑菌浓度5.882mg/mL。

本发明根据正交试验结果分析表明，采用丙酮溶液提取法对岩生忍冬中鞣质的最佳提取工艺条件为：丙酮浓度50％、浸提温度40℃、浸提次数2次、浸提时间50min，为优化岩生忍冬鞣质的提取工艺提供了理论方法依据。根据微量稀释肉汤法测定的岩生忍冬对维氏气单胞菌CGMCC3700和大肠杆菌ATCC25922等12种标准菌株的最小抑菌浓度为5.882mg/mL，对肠沙门氏菌肠亚种和阴沟肠杆菌阴沟亚种没有抑菌活性。

附图说明

图1是本发明实施例提供的岩生忍冬鞣质提取方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明以岩生忍冬为原料，提取采用正交设计法，以丙酮浓度、浸提时间、浸提次数、浸提温度为因素，每个因素3个水平进行试验，研究岩生忍冬中鞣质提取的影响，并测定其对14种标准菌的最低抑菌浓度(MIC)。初步建立了岩生忍冬鞣质的提取工艺。试验结果表明：岩生忍冬鞣质的最佳提取条件为：丙酮浓度50％、浸提温度40℃、浸提次数2次、浸提时间50min；鞣质对12种标准菌有一定的抑制作用，其最小抑菌浓度为5.882mg/mL。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的岩生忍冬鞣质提取方法包括以下步骤：

S101：将岩生忍冬粉碎，过40目药典筛；

S102：称取岩生忍冬5g，按1:20料液比加入50％丙酮，于40℃浸提2次，每次浸提时间50分钟，将上清液在50℃下浓缩。

本发明实施例具体包括以下步骤：

(1)将岩生忍冬粉碎，过40目药典筛；

(2)称取岩生忍冬5g，按1:20料液比加入50％丙酮，于40℃浸提2次，每次浸提时间50分钟；

(3)在循环水式真空泵和低温冷却液循环泵负压冷冻条件下，将上清液在50℃下用旋转蒸发仪RE-3000浓缩。

下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。

1材料

1.1药材来源及处理

药材岩生忍冬于2014年采自四川阿坝州红原县，经兽医药理试验室陈朝喜副教授鉴定为忍冬科岩生忍冬。洗净泥沙，晾干，粉碎待用。

1.2供试菌株

供试菌株是14种标准菌株，肠沙门氏菌肠亚种CGMCC1.10754、阴沟肠杆菌阴沟亚种CGMCC1.1022、维氏气单胞菌CGMCC3700、大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞杆菌CGMCCPa3、普通变形杆菌CGMCC1.491、肠炎克雷伯氏杆菌GMCC1.1062、痢疾志贺氏菌GMCC1.1869、中间耶尔森氏菌GMCC1.6197、粘质沙雷氏菌GMCC1.4256、金黄色葡萄球菌ATCC25913、F菌(粪肠球菌ATCC25912)、S菌(屎肠球菌ATCC35667)、阪崎肠杆菌GMCC1.6765购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.3主要仪器及耗材

旋转蒸发仪RE-3000(上海亚荣生化仪器厂)、SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)、DHP-9162电热恒温培养箱(上海齐欣科学仪器有限公司)、无菌操作台、立式压力蒸汽灭菌器、DZF-6030A真空干燥箱、电子天平、分样筛、磁力搅拌器、DLSB-10L/20低温冷却液循环泵(巩义市予华仪器有限责任公司)等。

试管、试管架、烧杯、锥形瓶、量筒、玻璃棒、称量纸、胶头滴管、培养皿、96孔聚苯乙烯微孔板、记号笔、一次性手套、枪头、移液枪、接种环(针)、注射器、回流仪器、摇床。

1.4试验试剂

MH肉汤培养基、丙酮(0、50％、100％)，乙酸乙酯，活性炭，去离子水，溴水，三氯化铁，二甲基亚砜。

2方法与步骤

2.1试验步骤

岩生忍冬采集粉碎→称量→不同浓度的丙酮浸提→活性炭脱色→抽滤→乙酸乙酯萃取纯化→颜色反应鉴定(分别加三氯化铁和溴水)→旋转蒸发冷冻干燥→风干→二甲基亚砜溶解净膏→微量肉汤稀释法测定MIC。

2.2正交设计试验

精密称取干燥的岩生忍冬药材粉末9份，每份5g，不同浓度的丙酮溶液、浸提温度、浸提次数、浸提时间4因素进行L9(34)正交试验，因素与水平设计见表1.

表1因素水平设置表

2.3鞣质纯化鉴定

2.3.1滤液活性炭脱色

活性炭吸附法作为一种应用十分广泛的方法，用于纯化具有较好的效果，可除去色素，树胶等杂质。活性炭吸附可使单宁质量分数提高1％左右，颜色和透射率有明显改善。称取活性炭量为药材粉末量的5％即0.25g，设定活性炭最适温度60℃，在回流仪器上加热搅拌50min，用高压泵抽滤(两张滤纸)，至溶剂颜色呈棕黄色。

2.3.2萃取分离

以1：2比例加入乙酸乙酯，45℃摇床水浴保温30min，加入分液漏斗，室温静置10-20h，分别收集两相，上层为乙酸乙酯相，鞣质的水溶液将大部分鞣质转移到乙酸乙酯层，而将较少量的水溶性杂质留在水层，从而达到提纯鞣质的目的，旋转蒸发，以去除溶液中丙酮等有机溶剂，得到缩合鞣质的水溶液，冷冻干燥后淡黄色粉末为缩合鞣质。

2.3.3定性鉴别

颜色反应，加入三氯化铁反应显深绿色，一般具邻二酚羟基化合物可分为邻二酚羟基的黄酮和儿茶素类缩合鞣质；加入溴水反应有黄色或橙红色沉淀为缩合鞣质。用胶头滴管吸取1ml鞣质水溶液于定量管，共取3管，1号按5:1的比例加入三氯化铁0.2ml，2号加入0.2ml溴水，3号做空白对比。

2.4MIC测定

在纯化后的浸膏里加入10ml二甲基亚砜溶解，装入15mlEP管备用。在超净工作台里，通过在注射器上安装一次性0.22μm孔径的针式过滤头过滤制得药液。参照CLSI(2013)指导原则和执行标准，采取微量肉汤稀释法测定岩生忍冬鞣质提取物对10种标准菌株体外抑制敏感性。取10个96孔板，按照倍比稀释法，将MH肉汤按照每孔100μL鞣质提取液，并以此倍比稀释均匀至第11孔，然后每个板1-11列各孔加入1种标准菌株的菌悬液100μL，第12列做空白对照。置于37℃恒温培养箱中培养24h，观察各孔培养液中细菌生长情况，以抑制细菌生长的岩生忍冬鞣质提取物最高稀释浓度作为鞣质提取物的最小抑菌浓度(MIC)，记录其结果。

3结果与分析

3.1正交试验结果

表2正交试验设计及结果

试验结果表明，鞣质的最佳提取条件为A2B1C2D3，即丙酮浓度50％，浸提温度40℃，浸提次数2，浸提时间50min。根据极差分析结果，影响鞣质提取效果的因素大小为丙酮浓度﹥浸提温度﹥浸提次数﹥浸提时间，该提取工艺影响因素最大的是丙酮浓度，最小的是浸提时间。

3.1.1验证试验结果

精确称取鞣质粉末5g各3份，50％的丙酮溶液，根据筛选得到的最佳提取条件平行提取3次，分别测定鞣质含量，结果见表3

表3验证试验结果

经验证试验，根据最佳提取条件的鞣质含量均大于正交设计中的含量所得的结果。

3.2正交设计的方差分析结果

表4正交试验的方差分析

从正交试验的方差分析表可以看出，各试验因素之间没有显著性。

3.3纯化鉴定结果

颜色反应，加入三氯化铁，反应显深绿色；加入溴水，反应有橙红色沉淀，即可鉴定为所提取的物质为缩合鞣质。

3.4 MIC测定结果

表5鞣质的体外抑菌浓度情况

试验表明：岩生忍冬中鞣质对肠沙门氏菌肠亚种和阴沟肠杆菌阴沟亚种没有抑菌作用，对其余的12种菌，均有抑制作用，且最小抑菌浓度都为5.882mg/mL。

植物鞣质主要分为水解鞣质和缩合鞣质两大类，通常存在于植物体的根花叶和木质部分，经颜色反应鉴定，本试验中，岩生忍冬中提取的鞣质为缩合鞣质。缩合鞣质是以黄烷-3-醇为基本结构单元的缩合物。这些特殊结构赋予了鞣质独特的化学性质，使其广泛应用于林业，农业，医药，食品，材料，化工，环境等学科领域。正交试验设计和分析方法是目前最常用的工艺优化试验设计和分析方法，其特点在于节能省时，流程简单、易操作，弥补了单一因素对提取工艺操作达不到优化的结果，从而使结果更加可靠。为优化岩生忍冬鞣质的提取工艺提供了理论方法依据。根据正交试验结果分析表明，采用丙酮溶液提取法对岩生忍冬中鞣质的最佳提取工艺条件为：丙酮浓度50％、浸提温度40℃、浸提次数2次、浸提时间50min。在上述最佳条件下，3次平行试验提取平均的总浸膏率为19.99％，均值都高于正交试验的浸膏率。3次平行试验所得的总浸膏经过活性炭脱色和乙酸乙酯萃取后得到的鞣质最终得率较高。由于鞣质具有氧化性和抗菌作用，提取物鞣质对除肠沙门氏菌肠亚种CGMCC1.10754、阴沟肠杆菌阴沟亚种CGMCC1.1022外的12种标准菌都有一定的抑制作用，测得其最小抑菌浓度5.882mg/mL。

本发明根据正交试验结果分析表明，采用丙酮溶液提取法对岩生忍冬中鞣质的最佳提取工艺条件为：丙酮浓度50％、浸提温度40℃、浸提次数2次、浸提时间50min，为优化岩生忍冬鞣质的提取工艺提供了理论方法依据。根据微量稀释肉汤法测定的岩生忍冬对12种的最小抑菌浓度为5.882mg/mL，且对肠沙门氏菌肠亚种和阴沟肠杆菌阴沟亚种没有抑菌活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。