本发明涉及一种防腐剂，尤其涉及一种复配型天然中药防腐剂组合物，具有安全高效、无毒无副作用，抗菌广谱性好的特点，该防腐剂不但能杀死化妆品不得检出菌的生长，同时对作为皮肤常驻菌的表皮葡萄球菌杀害作用小。
背景技术：
目前，植物配方的化妆品越来越受消费者欢迎，植物提取物在化妆品中的应用也越来越广泛。传统中药提取物因其防腐及美容功效成为现代天然防腐剂研发的新方向，但颜色、气味、稳定性及成分不明确等问题限制了其实际应用(植物防腐剂及其在化妆品中的应用.蒋勇)。同时，化妆品常用的防腐、抑菌剂可通过作用于微生物细胞膜、细胞壁及酶等多个靶点，破坏细菌的生长和繁殖，而长期使用添加防腐剂的化妆品可扰乱皮肤常驻菌丛(例如表皮葡萄球菌)，从而打破皮肤的微生态环境平衡(从皮肤微生态角度分析化妆品中的防腐、抑菌成分对皮肤健康的影响.李和伟，刘星)。
五味子乙素是五味子木质素类主要药用活性成分，具有抑菌性和较强的清除自由基的能力，尤其是对羟基自由基的清除能力(北五味子乙素清除自由基及体外抑菌作用的研究，李斌)。黄芩素是黄芩中含量最高的黄酮类化合物之一，也是黄芩发挥功效的主要活性成分。黄芩素具有抗氧化、清除氧自由基、抗菌抗病毒解热镇痛、抗炎、抗过敏等作用，是极具研发价值的中药化合物(黄芩素的药理作用及分子机制的最新研究进展，田硕，洪涛，张多等)。白藜芦醇是虎杖、葡萄籽等中的主要成分，现已作为一种食品添加剂在食品中应用越来越广(白藜芦醇功能和作用机制研究.郝海燕)。
但目前并没有将五味子乙素、黄芩素以及白藜芦醇组合作为防腐剂应用于化妆品以及食品的报道，本发明将五味子乙素、白藜芦醇及黄芩素三者复配，结果发现三者复配后对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌具有协同杀菌作用，不仅减少了单味药的使用量，同时扩大了复合物的抗菌谱。因此，本发明的提出对于安全高效、无毒无副作用的新型防腐剂的研究及开发具有重要的指导意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种由复配型天然中药防腐剂化合物，具有安全高效、无毒无副作用的特点，同时抗菌广谱性好，同时对表皮葡萄球菌的杀灭作用较小的特点。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种复配型天然中药防腐剂组合物，其特征在于其有效成分由五味子乙素，黄芩素以及白藜芦醇组成。
在本发明中，五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇的重量比例为1～3:50～100:25～50，优选的，五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇的重量比例为1:50:25。
进一步的，本发明还提出了所述的复配型天然中药防腐剂组合物在制备食品、药品、化妆品，特别是护肤类化妆品的中的用途。
其中，优选的，五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇的最小杀菌浓度分别为2.5μg/mL、125μg/mL及62.5μg/mL。
实验证明，所述的复配型天然中药防腐剂组合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌具有显著的杀菌作用，对于作为皮肤常驻菌的表皮葡萄球菌的杀灭作用较小。
与现代防腐剂相比，本发明的优点在于：是由五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇混合而成的，具有安全高效、无毒无副作用的特点，从复配实验结果看，五味子乙素、白藜芦醇及黄芩素三者复配对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌的抑菌性具有协同作用，不仅减少了单味药的使用量，同时具有良好抗菌广谱性，不仅能够抑制化妆品常见菌的生长，同时对作为皮肤常驻菌的表皮葡萄球菌的杀灭作用不完全。本发明的复配型植物源防腐剂可用于化妆品、食品、药品等领域中，尤其是在护肤类化妆品中，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1复配型天然中药防腐剂组合物的制备及杀菌效果验证
1材料与方法
1.1实验材料与仪器
1.1.1实验菌种
大肠杆菌(Escherichia coli,ATCC 8739)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC6538)、白色念珠菌(Candida albicans,ATCC10231)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,ATCC12228)
1.1.2实验试剂
五味子乙素为白色结晶体，纯度为98.8％，采购于中国食品药品检定研究所。
黄芩素为黄色针状结晶，纯度为97.8％，采购于中国食品药品检定研究所。
白藜芦醇为白色粉末，纯度为98％，批号130423(北京工商大学植物原料技术实验室)。
1.1.3实验仪器与设备
1.2实验方法
1.2.1五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇的最低杀菌浓度测定
以中药材五味子为原料经水和/或醇萃取得到的提取液，主要成分有五味子乙素、五味子乙素等木质素类成分，挥发油成分及有机酸类。本发明发明人首先比较了五味子中木质素类成分(五味子甲素及五味子乙素)的抑菌性，发现五味子乙素是对白色念珠菌的具有明显的抑菌性，其MBC值为10.32μg/mL。因此，本发明实施中以五味子乙素作为其中一种有效成分。
五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇的最低杀菌浓度测定以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及白色念珠菌为实验菌种。
采用微量液体培养法测定五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及白色念珠菌的最小杀菌浓度范围，基本步骤是：取单菌落进行增菌培养，利用平板计数法对菌悬液中活菌数并用已灭菌液体培养基稀释得到活菌数为0.5×105-1×106CFU/mL的菌悬液，备用；用无水乙醇和DMSO混合液(v:v，5:1)分别将五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇进行10倍稀释；取无菌96孔板，向每个孔中加入195μL菌悬液及5μL待测液并混合均匀，得到终浓度分别为825μg/mL、82.5μg/mL、8.25μg/mL的五味子乙素和黄芩素及终浓度为500μg/mL、50μg/mL、5μg/mL的白藜芦醇，同时用无水乙醇和DMSO混合液(v:v，5:1)作阴性对照，取200μL菌悬液作空白对照，取200μL液体培养基做无菌控制组(每组实验另作2个平行)，用封口膜密封后在180rpm摇床培养24h(真菌为28℃，细菌为37℃)，取100μL菌悬液涂布于固体平板上，将平板置于生化培养箱(真菌为28℃，细菌为37℃)中培养18～24h，观察营养琼脂平板是否长菌，以平板上未长菌的浓度为最低杀菌浓度，得到三种植物化合物最低杀菌浓度(MBC)范围。
依据五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇对不同菌株的最低杀菌浓度范围，采用二倍稀释法测定五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及表皮葡萄球菌的最小杀菌浓度，基本步骤为：取单菌落进行增菌培养，利用平板计数法测定菌悬液中活菌数并用已灭菌液体培养基稀释得到活菌数为1*106CFU/mL的菌悬液，备用；利用倍半稀释法配制黄芩素、五味子乙素及白藜芦醇的稀释液；向96孔板中加入195μL菌悬液和5μL待测液，使白色念珠菌菌悬液中五味子乙素的浓度分别为82.5μg/mL，41.25μg/mL，20.625μg/mL，10.318μg/mL及5.159μg/mL，黄芩素的浓度分别为825μg/mL，412.5μg/mL，206.25μg/mL，103.18μg/mL及51.59μg/mL，大肠杆菌菌悬液中黄芩素的浓度分别为825μg/mL，412.5μg/mL，206.25μg/mL，103.18μg/mL及51.59μg/mL，白藜芦醇的浓度分别为500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL及31.25μg/mL，金黄色葡萄球菌菌悬液中白藜芦醇的浓度分别为500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL及31.25μg/mL，表皮葡萄球菌菌悬液中黄芩素的浓度分别为8.25μg/mL，4.125μg/mL，2.062μg/mL，1.031μg/mL及0.516μg/mL，同时用无水乙醇和DMSO混合液(v:v，5:1)作阴性对照，200μL菌悬液作空白对照，200μL液体培养基做控制组(每组另作2个平行)。用封口膜密封后在180rpm摇床培养24h(真菌为28℃，细菌为37℃)，取100μL菌悬液涂布于固体平板上，将平板置于生化培养箱(真菌为28℃，细菌为37℃)中培养18～24h，以平板上未长菌的浓度为最低杀菌浓度。
1.2.2五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇复配混合物的抑菌性测定
将五味子乙素稀释至0，0.6mg/mL，1.2mg/mL，1.8mg/mL，黄芩素稀释至0，18mg/mL，24mg/mL及30mg/mL，白藜芦醇稀释至0，12mg/mL，15mg/mL，18mg/mL，根据三因素四水平表进行等体积复配得到待测复合物混合液。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌为实验菌株，采用微量液体培养法测定所得复配产物的抑菌性，基本操作步骤：取单菌落进行增菌培养，利用平板计数法对菌悬液中活菌数进行计算，并用已灭菌液体培养基稀释得到活菌数为0.5×105-1×106CFU/mL的菌悬液，取5μL混合液与195μL菌悬液混合均匀，200μL菌悬液作空白对照，200μL液体培养基做控制组(每组另做2个平行)。用无菌封口膜密封后在180rpm摇床培养24h(真菌为28℃，细菌为37℃)，取100μL菌悬液涂布于固体平板，将平板置于生化培养箱(真菌为28℃，细菌为37℃)中培养18～24h，根据平板上菌落生长情况评价复配产物的抑菌性。200μL体系中五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇浓度满足表1及表2所示的正交表。
表1因素水平表(浓度μg/mL)
表2三因素四水平正交表
1.2.3复配混合物最小杀菌浓度的测定
复配混合物的最小杀菌浓度测定以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及白色念珠菌为是实验菌种。
复配实验所得的最优复配组方是终浓度为5μg/mL的五味子乙素、250μg/mL的黄芩素及125μg/mL的白藜芦醇混合物(记为Y)。取单菌落进行增菌培养，利用平板计数法对菌悬液中活菌数进行计算，并用已灭菌液体培养基稀释得到活菌数为0.5×105-1×106CFU/mL的菌悬液，配制五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇的终浓度分别为200μg/mL、10mg/mL及5mg/mL的混合物(即40×Y)，利用倍半稀释法将混合物进行稀释得到20×Y，10×Y，5×Y，2.5×Y，1.25×Y的混合物，将5μL混合物加入195μL菌悬液并混匀(混合物的终浓度分别为Y、Y/2、Y/4、Y/8、Y/16及Y/32)，取200μL菌悬液作空白对照，200μL液体培养基做控制组(每组另做2个平行)。用封口膜密封后在180rpm摇床培养24h(真菌为28℃，细菌为37℃)，取100μL菌悬液涂布于固体平板，将平板置于生化培养箱(真菌为28℃，细菌为37℃)中培养18～24h，以平板上未长菌的浓度为最低杀菌浓度。
2.结果与分析
2.1五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇的最低杀菌浓度测定
将所有平板置于生化培养箱中培养18～24h后，观察平板上菌的生长状况，得出实验中三种化合物对四种菌的最低杀菌浓度如下表3所示：
表3五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇的最低杀菌浓度(MBC)测定
最低杀菌浓度是测量抑菌药物的抗菌活性大小的一个指标，反映了抑菌药物的抑菌性大小。从上表可见五味子乙素、白藜芦醇和黄芩素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及白色念珠菌的抑菌作用各不相同：五味子乙素对白色念珠菌的最小杀菌浓度为10.32μg/mL，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌的最低杀菌浓度大于825μg/mL；黄芩素对表皮葡萄球菌的最低杀菌浓度小于或等于8.25μg/mL，对白色念珠菌及大肠杆菌的最低杀菌浓度分别为206.3μg/mL和412.5μg/mL，对金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度大于825μg/mL；白藜芦醇对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度分别为250μg/mL和125μg/mL，对表皮葡萄球菌及白色念珠菌的最低杀菌浓度大于500μg/mL。可见，五味子乙素对白色念珠菌的抑制作用最好，白藜芦醇对金黄色葡萄球菌的抑制作用最好，黄芩素对表皮葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果最好。五味子乙素、黄芩素和白藜芦醇对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌的抑制效果各不相同，但有各自的优势菌。
2.2五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇复配物的抑菌性测定
五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇正交试验结果如下表4及表5所示：
表4五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇正交试验结果
注：－表示未生长菌落；+为少量菌落；++为中量菌落；+++为大量菌
表5正交实验结果分析表
注：为了便于进行正交试验结果分析，将‘－’记为0；‘+’记为1；‘++’记为2；‘+++’记为3。
结合五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇的混合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌的作用可以看出，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌均有效的的复配物中应含有5～15μg/mL五味子乙素、250～500μg/mL黄芩素及125～250μg/mL白藜芦醇。五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇复配后，其中白藜芦醇对混合物抑制大肠杆菌的能力影响最大，而黄芩素对混合物抑制金黄色葡萄球菌及白色念珠菌的能力影响最大，考虑到混合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌的广谱抑菌性，选定黄芩素为影响复合物抑菌性的主要因素，其最优水平为B4。五味子乙素为影响复合物抑菌性的次要因素，以节约方便为选择水平最终确定次要因素的最优水平更为A2。白藜芦醇的选择与次要因素选择标准相同，最终选择白藜芦醇的最优水平为C3。黄芩素、五味子乙素和白藜芦醇复配的最优水平为B4A2C3，即终浓度为5μg/mL的五味子乙素、250μg/mL的黄芩素及125μg/mL的白藜芦醇混合物。
2.3最优配比复配混合物最小抑菌浓度的测定
将所有平板置于生化培养箱中培养18～24h后，观察平板上菌的生长状况，得出实验中三种化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及白色念珠菌的最低杀菌浓度如表6所示：
表6最优复配产物对四种菌的最小杀菌浓度表
终浓度分别为2.5μg/mL、125μg/mL及62.5μg/mL的五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇复配混合物(即1/2Y)能完全抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌，同时又能保证不完全杀死表皮葡萄球菌。在单味药MBC测定实验可以看出，五味子乙素对白色念珠菌的MBC值为10.32μg/mL，且在此浓度下对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌无杀菌作用；黄芩素对大肠杆菌的MBC值为206.25μg/mL，且在此浓度下对金黄色葡萄球菌无杀菌作用；白藜芦醇对金黄色葡萄球菌的MBC值为125μg/mL，且在此浓度下对白色念珠菌没有杀菌作用。与单味药的抑菌性相比，达到相同效果时组方后单味药的浓度降低，表明三者复配后药性增强。同时，1/2Y的复配产物能完全抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌，说明与单味药相比复配产物具有更强的抑菌广谱性。此外，单味药黄芩素对表皮葡萄球菌有很强的抑制作用，其MBC值为8.25μg/mL；而在复方中对其抑制作用明显降低，MBC值为250μg/mL。因此1/2Y的复配产物不完全抑制表皮葡萄球菌，表明复配产物对皮肤益生菌破坏性小，能更好的维持皮肤微生态平衡，对皮肤微生态平衡具有重要意义。
本发明在食品、药品、化妆品等中应用，应保证该植物复合防腐剂中五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇比例为1～3:50～100:25～50，优选的，五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇在护肤类化妆品中的应用比例为1:50:25，且应用到最终体系中后，五味子乙素、黄芩素及白藜芦醇的最小浓度分别为2.5μg/mL、125μg/mL及62.5μg/mL。