本发明属于天然产物领域，涉及天然产物的医药用途，具体涉及香豆酰基黄酮苷在神经保护方面的应用。
背景技术：
：：黄酮类化合物普遍存在于药用植物、蔬菜以及水果中，是一种重要的植物次生代谢产物，多以黄酮糖苷或者游离的黄酮苷元两种形式存在。黄酮类化合物的许多药理活性已被实验证明，如抗氧化、抗炎、抗癌等作用。这是因为其在不同的碳位上发生羟基或者甲氧基取代时，就成为各种类黄酮色素，从而具有不同的理化性质和药理作用。黄酮类化合物的药理活性受取代基的类型和位置影响较大，了解黄酮类化合物的构效关系有助于黄酮类新药的研发。quercetin-3-o-2″-(6″-p-coumaroyl)-glucosylrhamnoside是分离自银杏中的一种黄酮苷，中文名称为槲皮素-3-o-2″-(6″-p-香豆酰基)-葡萄糖基鼠李糖苷，比另一种黄酮苷槲皮素-3-o-2″-葡萄糖基鼠李糖苷(quercetin-3-o-2″-glucosylrhamnoside)多一个香豆酰基【本申请为使表述简洁，将槲皮素-3-o-2″-(6″-p-香豆酰基)-葡萄糖基鼠李糖苷缩写为qcgr，化学结构式如下a所示；将槲皮素-3-o-2″-葡萄糖基鼠李糖苷缩写为qgrb，化学结构式如下b所示】。这两种黄酮苷都存在于银杏中，发明人所在课题组前期开展了很多有关银杏和该类黄酮苷的研究工作(astrategyforscreeningantioxidantsinginkgobilobaextractbycomprehensivetwo-dimensionalultrahighperformanceliquidchromatography,journalofchromatographya,2015:147-154；directanalysisof18flavonolglycosides,aglyconesandterpenetrilactonesinginkgobilobatabletsbymatrixsolidphasedispersioncoupledwithultra-highperformanceliquidchromatographytandemtriplequadrupolemassspectrometry,journalofpharmaceuticalandbiomedicalanalysis,2014:123-128)。目前，香豆酰基对黄酮苷药理活性的影响尚未有相关报道。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供香豆酰基黄酮苷在神经保护方面的应用，发明人发现香豆酰基可以增强黄酮苷的神经保护作用，降低黄酮苷的细胞毒性；本发明的第二目的在于提供一种通过在黄酮苷中引入香豆酰基增强其神经保护作用并降低其细胞毒性的方法。本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：一种香豆酰基黄酮苷在神经保护方面的应用，所述香豆酰基黄酮苷指基本母核为黄酮且含有糖侧链的化合物，糖侧链通过糖苷键连接在基本母核上，香豆酰基连接在糖侧链上。优选地，所述香豆酰基黄酮苷的基本母核为2-苯基色原酮结构。优选地，所述香豆酰基黄酮苷的基本母核为2-苯基色原酮结构，糖侧链连接在基本母核的c-3位。优选地，所述香豆酰基黄酮苷的基本母核为2-苯基色原酮结构，糖侧链通过鼠李糖单元连接在基本母核的c-3位。优选地，所述香豆酰基黄酮苷为槲皮素-3-o-2″-(6″-p-香豆酰基)-葡萄糖基鼠李糖苷。优选地，所述香豆酰基黄酮苷为山柰酚-3-o-2″-(6″-p-香豆酰基)-葡萄糖基鼠李糖苷。优选地，所述香豆酰基黄酮苷的基本母核为2-苯基色原酮结构，糖侧链通过葡萄糖单元连接在基本母核的c-3位。优选地，所述香豆酰基黄酮苷为山柰酚-3-o-(6″-p-香豆酰基)-葡萄糖苷。上述技术方案中，所述神经保护指降低缺血再灌注对神经元造成的损伤。一种通过在黄酮苷中引入香豆酰基增强其神经保护作用并降低其细胞毒性的方法，所述黄酮苷的基本母核为2-苯基色原酮结构，糖侧链连接在基本母核的c-3位，所述香豆酰基通过酯键连接在糖侧链的末端。本发明对现有技术的贡献：本发明证实香豆酰基黄酮苷具有神经保护作用，香豆酰基可以增强黄酮苷的神经保护效果，同时降低黄酮苷的细胞毒性；发明人还发现香豆酰基可以增强黄酮苷的水溶性，有助于提高黄酮苷的生物利用度，改善黄酮苷的成药性能。附图说明图1为kg和kcg化学结构式；图2为kgr和kcgr化学结构式。具体实施方式下面结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。实验中未详述的试验操作均为本领域技术人员所熟知的常规试验操作。实施例1qcgr的神经保护作用一、实验材料dmem高糖培养基、0.25％胰蛋白酶、gibco胎牛血清；dmso(美国sigma公司)；96孔板(美国corning公司)；多功能酶标仪(bio-tekinstruments,usa)；生物安全柜(thermofisherscientific,usa),co2细胞培养箱(thermofisherscientific,usa)。细胞株：本实验应用n2a细胞株是小鼠源性永生化神经元细胞。细胞培养于正常含10％胎牛血清(fetalbovineserum,fbs)的dmem(gibco,usa)的完全培养基中。溶液配制：无糖eagles液，分别称取nacl6.68g,mgso4·7h2o0.2g,cacl20.2g,nahco32.2g,kcl0.04g,nah2po4.2h2o溶于三蒸水中并定容至1l，用0.22μm滤膜过滤分装至无菌瓶内，于4℃冰箱内保存备用。mtt试剂，称取250mgmtt溶于50mlpbs中配制成浓度为5mg/ml的溶液然后用0.22μm的滤膜过滤后分装，-20℃保存。二、实验方法1、细胞模型建立(糖氧剥夺模型模拟神经元缺血损伤)n2a细胞培养并接种于细胞培养板中，采用体外氧糖剥夺模型(oxygenandglucosedeprivation,ogd)。将培养板中的细胞用eagles液洗一遍后换成eagles液，放入参数预先设置好的三气培养箱(气体参数设置为：1％o2,94％n2,5％co2)，o2浓度降至1.0％时开始计时，培养4h后，将eagles液换成10％fbs的完全培养基，并置于正常(气体参数设置为：21％o2，74％n2，5％co2)的细胞培养箱中继续培养。2、药物干预方法n2a细胞培养并接种于细胞培养板中，随机分为空白对照组、模型组、qcgr干预组和qgr干预组。预先给予qcgr、qgr培养12h后，对n2a细胞按照上述方法进行糖氧剥夺4h，然后换正常培养基继续培养24h。3、细胞形态学观察和存活率测定显微镜下观察各组n2a细胞复糖复氧培养24h的细胞形态学变化。存活率采用mtt法测定：n2a细胞复糖复氧培养24h后每孔避光加入5mg/mlmtt溶液10μl，37℃培养4h，吸出培养基，每孔加入150μldmso溶解紫色结晶，在酶标仪上摇匀后490nm下检测吸光度。4、对神经元细胞乳酸脱氢酶(ldh)释放率的影响按照前述方法对n2a细胞进行造模，n2a细胞复糖复氧培养24h后，每孔取20μl上清液于新的培养板中，加入基质缓冲液25μl混匀，37℃温孵15min，加入2,4-二硝基苯肼25μl混匀，37℃温孵15min，再加入0.4mol/lnaoh溶液250μl混匀，室温放置5min，波长450nm，在酶标仪测定吸光度。乳酸脱氢酶计算公式：ldh活性(u/l)＝(测定od值-对照od值)/(标准od值-空白od值)×标准品浓度(0.2mmol/l)×1000。三、实验结果1、细胞形态学变化n2a细胞在正常培养条件下呈类圆形，有突起，轮廓清晰；ogd培养4h复糖复氧24h后，细胞胞体增大，突起缩短，轮廓不清晰；qcgr干预能抑制n2a细胞形态异常变化。2、对细胞存活率的影响采用体外模拟脑缺血再灌注造成神经元损伤的神经元氧糖剥夺/复糖复氧模型，表1结果表明，模型组与空白对照组相比细胞存活率显著降低，损伤严重，说明造模成功(p<0.01)。与模型组相比，qcgr干预组给药20μm时神经元细胞存活率显著提高(p<0.01)，qgr干预组给药80μm时细胞存活率显著提高(p<0.01)。这证明qcgr和qgr均具备神经保护作用，qcgr比qgr的剂量低4倍可达到相同药效。表1药物干预对神经元损伤的保护作用3、对神经元细胞ldh释放率的影响缺氧导致细胞膜损伤后细胞内ldh外漏，培养基中ldh活性增高，ldh释放量可以反应细胞的损伤程度。ldh的含量以相对百分含量计，与空白对照组相比，模型组ldh相对含量显著升高(p<0.001)，给予qcgr20μm、40μm保护可有效减少ldh的释放(p<0.001)。实验结果见表2。表2药物干预对神经元细胞ldh释放率的影响实施例2qcgr的细胞毒作用一、实验材料dmem高糖培养基、0.25％胰蛋白酶、gibco胎牛血清；dmso(美国sigma公司)；96孔板(美国corning公司)；多功能酶标仪(bio-tekinstruments,usa)；生物安全柜(thermofisherscientific,usa),co2细胞培养箱(thermofisherscientific,usa)。细胞株：本实验应用n2a细胞株是小鼠源性永生化神经元细胞。细胞培养于正常含10％胎牛血清(fetalbovineserum,fbs)的dmem(gibco,usa)的完全培养基中。二、实验方法称取qcgr和qgr溶解于二甲基亚砜中，制备成母液，使用时稀释至所需浓度。n2a细胞培养并接种于细胞培养板中，给予qcgr和qgr培养12h后，每孔避光加入10μlmtt，37℃培养4h，吸出培养基，每孔加入150μldmso溶解紫色结晶，在酶标仪上摇匀后490nm下检测吸光度。三、实验结果与溶剂组相比，qcgr在测试剂量范围内没有显著的细胞毒性，qgr在200μm时有显著的细胞毒性(p<0.01)，结果见表3。表3qcgr和qgr的细胞毒作用实施例1和实施例2的实验结果表明，qcgr比qgr具有更高的神经保护活性，且无明显细胞毒性。发明人还比较了另外两对黄酮苷的神经保护活性，其化学结构如图1和2所示，神经保护活性和细胞毒活性比较见表4(其中，相同活性给药剂量比指不同药物干预组n2a细胞存活率达到70％时给药浓度之比；细胞毒中的显著指细胞存活率在85％以下，与溶剂组差异显著；不显著指细胞存活率在93％以上，与溶剂组无显著性差异)。表4另外两对黄酮苷的神经保护活性和细胞毒大小上表中，山柰酚-3-o-葡萄糖苷缩写为kg，山柰酚-3-o-(6″-p-香豆酰基)-葡萄糖苷缩写为kcg；山柰酚-3-o-2″-葡萄糖基鼠李糖苷缩写为kgr，山柰酚-3-o-2″-(6″-p-香豆酰基)-葡萄糖基鼠李糖苷缩写为kcgr。本发明证实香豆酰基黄酮苷具有神经保护作用，香豆酰基可以增强黄酮苷的神经保护效果，同时降低黄酮苷的细胞毒性；另外，香豆酰基可以增强黄酮苷的水溶性，有助于提高黄酮苷的生物利用度，改善黄酮苷的成药性能。上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于上述具体实施例。当前第1页12当前第1页12