一种新型抗病毒分子Kdm6a的抗病毒作用及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及赖氨酸特异性去甲基化酶6a(lysine-specificdemethylase6a，kdm6a)在抵抗外源病毒感染，和治疗病毒感染导致的相关疾病中的效应、作用机制、实施方法和用途。

背景技术：

病毒是由一种以核酸(核糖核酸rna或脱氧核糖核酸dna)为核心，以蛋白质为外壳(衣壳capsid)而组成的微小颗粒，其核酸可分为单股或双股，线形或球形。病毒是最小的生物病原体，从20nm到300nm不等：其中最大的是痘类病毒，例如痘苗病毒为300nm×200nm，在普通光学显微镜下勉强可见；中等大小的如流行性感冒病毒，直径为80～100nm；小型病毒如流行性乙型脑炎病毒，直径为20nm，必须在电子显微镜下才能见到(基础病毒学，莽克强等著，化学工业出版社，2005年第一版；分子病毒学，黄文林等著，人民卫生出版社，2001年第一版)。

随着病毒学和免疫学研究的进展，人们对病毒性疾病(viraldiseases)的认识也逐渐发展。最常用的病毒分类方式是根据核酸的性质(rna或dna)来对病毒进行分类，一般将病毒分为dna病毒和rna病毒。常见的致病性dna病毒主要有人乳头状瘤病毒(hpv)、乙肝病毒(hbv)、eb病毒等，常见的致病性rna病毒包括流行性出血热病毒、人获得性免疫缺陷病毒(hiv)、严重急性呼吸综合征(sars)病毒以及流感病毒等(基础病毒学，莽克强等著，化学工业出版社，2005年第一版；分子病毒学，黄文林等著，人民卫生出版社，2001年第一版)。病毒性疾病根据临床表现及传染方式，可以分为呼吸道病毒、虫媒病毒、出疹性病毒、肠道病毒所致感染等。

病毒性疾病往往引起比较严重的临床表现，每每引起暴发流行。病毒感染后除了短期内引起感染所引起的局部炎症外，长期的病毒感染可以导致肿瘤以及器官功能衰竭等严重的疾病，如hpv感染引起的宫颈癌、hbv感染引起的肝癌、肝硬化和肝功能衰竭、eb病毒引起的鼻咽癌、hiv引起的免疫功能缺陷和卡波济氏肉瘤、sars引起的呼吸功能衰竭以及流感病毒引起的呼吸功能障碍等(基础病毒学，莽克强等著，化学工业出版社，2005年第一版；分子病毒学，黄文林等著，人民卫生出版社，2001年第一版)。

每一种流行性病毒感染都可以造成极大的人体健康和国民经济的损失，然而至今对抗病毒尚无特效药，临床治疗重点就在对症和保守治疗，因此病毒性疾病的发病的分子和免疫学机理的研究和治疗策略的研究具有重大的科学意义和显示意义。

干扰素(interferon，ifn)是一组体内存在的、有广泛生物活性的微量调节蛋白，具有广谱抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节活性，已被广泛用于临床。干扰素是病毒感染后宿主细胞释放的具有抗病毒特性的糖蛋白。根据其生物学、生物化学、基因特征及细胞来源，可分为四种类型，即α、β、γ、ω型干扰素，分别来源于白细胞(单核/巨噬细胞)、成纤维细胞、淋巴细胞(t-cell和滋养层细胞)。干扰素具有抗病毒、抗增殖和免疫调节3种功能。其中α、β型ifn又称为i型干扰素，在病毒性疾病的治疗中具有重要地位。

干扰素已经广泛应用于病毒性疾病的治疗，如带状疱疹、疱疹性口咽、小儿病毒性肺炎、流行性乙型脑炎、病毒性肝炎、艾滋病、尖锐湿疣、sars等，可以抑制病毒的复制并调节病毒特异性免疫反应的产生，是目前已经得以证明并商业化应用于临床病毒性治疗的有效生物制剂。

人们对于机体识别外来病毒的分子机制并不完全了解，但是随着toll样分子的发现，机体针对病毒所产生的ifn的产生机制和作用机制逐步得到了认识。研究发现tlr3主要识别病毒分子中双链rna(double-strandedrna，dsrna)(takeuchi,o.等,immunity.1999；11:443-451；ozinsky,a.等,procnatlacadsciusa.2000；97:13766-13771；alexopoulou,l.等,nature.2001；413:732-738)；人类tlr7和tlr8基因定位于染色体xp22，识别病毒分子中的单链rna(single-strandedrna，ssrnas)(heil,f.等,science.2004；303:1526-1529)；人类tlr9定位于染色体3p21.3，识别细菌和病毒dna中的cpg基序或人工合成的cpg寡核昔酸(cpgoligodeoxynucleotides，cpgodn)(hemmi,h.等,nature.2000；408:740-745)。另外，病毒还可以通过tlr非依赖方式产生i型干扰素(baccala,r.等,nat.med.13,543-551(2007))。其中，tlr3可以通过trif-tbk1/ikkε-irf3信号传导通路诱导i型干扰素的产生；tlr7/8/9可以通过myd88-irf7信号通路活化诱导i型干扰素的产生；另外，一些进入细胞内的病毒可以通过rig-i/mda-5介导的tbk1/ikkε-irf3信号通路活化通过tlr非依赖方式诱导i型干扰素的产生(baccala,r.等,nat.med.13,543-551(2007))。能否诱导i型干扰素的产生以及能否抑制病毒的复制和扩增是检验药物治疗病毒性疾病的非常有效的标准。

kdm6a又名utx，可以特异性去除h3k27me2/3的甲基基团，发挥h3k27去甲基化酶活性(lee,mg.等,science318,447-450(2007))。该分子拥有高度保守的同源的c末端结构域即jmjc结构域，也是其酶活性结构域，主要发挥组蛋白去甲基化活性。该分子的n末端包含了6个重复序列的tpr结构域，主要发挥蛋白蛋白相互作用的功能。kdm6a基因定位于x染色体，但是却不受x染色体失活的影响，在细胞和机体内广泛表达(agger,k.等,nature449,731-734(2007))。

kdm6a作为重要的表观修饰酶可以特异性去除h3k27me2/3的甲基化，在个体的分化、发育以及肿瘤组织的发生、发展过程中发挥着重要作用(lan,f.等，nature449,689-694(2007))，然而在免疫系统中的功能受到的关注非常少。

综上所述，本领域迫切需要开发出一种可有效抵抗病毒感染、抑制炎性因子产生的免疫学活性物质。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供kdm6a蛋白、kdm6a编码序列、其促进剂或其抑制剂在调控i型干扰素产生中的用途，且进一步提供了它们在预防和治疗病毒感染性疾病中的用途。本发明的药物、药物组合物或试剂盒可用于促进i型干扰素的产生，有效抵抗外源病毒感染，和治疗病毒感染导致的相关疾病。

本发明的第一方面，提供kdm6a蛋白或kdm6a编码序列、其促进剂或其抑制剂在制备用于调控i型干扰素产生的药物或试剂盒中的用途。

优选的，所述kdm6a蛋白选自：

(a)seqidno：2或seqidno：4所示的氨基酸序列；或

(b)与seqidno：2或seqidno：4所示的氨基酸序列同源，其具有抑制病毒感染相关疾病和/或征状活性的蛋白或多肽；或

(c)(a)或(b)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有预防或治疗病毒感染相关疾病和/或征状活性的由(a)或(b)衍生的蛋白质或多肽。

更优选的，所述kdm6a蛋白选自：seqidno：2或seqidno：4所示的氨基酸序列。

优选的，所述kdm6a编码基因选自：

(i)seqidno：1或seqidno：1的第378-4583位序列、seqidno：3或seqidno：3的第432-4637位序列所示的核苷酸序列；或

(ii)在严格条件下与(i)限定的核苷酸序列杂交的分子；或

(iii)(i)或(ii)的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸、且编码具有预防或治疗病毒感染相关疾病和/或征状的分子。

更优选的，所述kdm6a编码基因选自：seqidno：1或seqidno：1的第378-4583位序列、seqidno：3或seqidno：3的第432-4637位序列所示的核苷酸序列。

优选的，kdm6a或其编码序列的所述促进剂选自：kdm6a或其编码序列的过表达载体、外源性kdm6a、kdm6a或其编码序列的裸dna、kdm6a或其编码序列的脂质体包裹dna、kdm6a蛋白。

优选的，kdm6a或其编码序列的所述抑制剂选自针对kdm6a或其编码序列的：抗体、sirna、mirna、反义寡核苷酸、拮抗剂、阻断剂。

优选的，所述kdm6a蛋白是：天然纯化的蛋白、化学合成的产物、或使用重组技术从原核或真核宿主中产生，优选为人或小鼠kdm6a，更优选为人kdm6a蛋白。

优选的，所述宿主选自：细菌、酵母、高等动物、昆虫和哺乳动物细胞。

优选的，所述kdm6a、其编码序列或其促进剂促进i型干扰素的产生；所述抑制剂抑制i型干扰素的产生。所述i型干扰素选自：ifn-α或ifn-β，优选为ifn-β。

优选的，所述药物或试剂盒包含kdm6a或kdm6a编码序列、或其促进剂，并通过促进i型干扰素的产生进一步用于预防或治疗与病毒感染相关的疾病和/或其征状；或者

所述药物或试剂盒包含kdm6a或其编码序列的抑制剂，并通过抑制i型干扰素的过度产生用于预防或治疗因i型干扰素过量表达引起的组织和器官损伤和/或其征状。

优选的，所述病毒感染相关疾病和/或征状为选自下组的一种或两种以上因病毒感染引起的疾病和/或征状：病毒感染后的复制；病毒感染局部的细胞(皮肤的上皮细胞、外周血的免疫细胞、免疫器官中的免疫细胞以及实体器官的组成细胞)和组织(包括皮肤、肝脏、肾脏、脑、肺脏)损伤；病毒感染造成的器官(包括皮肤、肝脏、肾脏、脑、肺脏)功能损伤。

优选的，所述病毒感染相关疾病和/或征状选自：带状疱疹、疱疹性口咽、小儿病毒性肺炎、流行性乙型脑炎、病毒性肝炎、艾滋病、尖锐湿疣、sars。

优选的，所述病毒感染是由选自下组的一种或两种以上病毒引起的：人乳头状瘤病毒、乙肝病毒、eb病毒、流行性出血热病毒、人获得性免疫缺陷病毒、严重急性呼吸综合征病毒、流感病毒。

优选的，所述kdm6a蛋白及其编码序列诱导i型干扰素的产生，从而预防或治疗病毒感染相关疾病和/或征状。

优选的，所述药物的给药方法选自：给予kdm6a编码序列，例如直接裸dna注射法、脂质体包裹dna直接注射法、金包被dna基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒dna法、复制缺陷腺病毒携带目的dna法；给予kdm6a蛋白，例如注射给药(如直接注射kdm6a蛋白或用脂质体包埋的kdm6a蛋白)、鼻腔给药、肺部给药、口服给药、透皮给药(如离子导入)。

本发明的第二方面，提供了一种用于调控i型干扰素产生的药物组合物，其包含：

(a)治疗有效量的kdm6a蛋白或kdm6a编码序列、其促进剂或其抑制剂；

(b)预防或治疗病毒感染相关疾病和/或征状活性的其它活性物质；以及

(c)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。

优选的，所述药物组合物中kdm6a蛋白、其编码序列、其促进剂或其抑制剂占药物组合物总重量的0.001～99.9wt％。

优选的，所述药物组合物中kdm6a蛋白、其编码序列、其促进剂或其抑制剂占药物组合物总重量的1～95wt％，优选为5～90wt％，更优选10～80wt％。

优选的，在给予本发明的药物组合物之前、同时或之后，给予具有预防或治疗病毒感染相关疾病和/或征状活性的其它活性物质。所述具有预防或治疗病毒感染相关疾病和/或征状活性的其它活性物质选自：临床常用抗病毒药物(包括抗甲型流感病毒表面m2受体、抗神经氨酸苷酶、抗单磷酸次黄嘌呤核苷酸脱氢酶、抗病毒dna多聚酶、抗hiv逆转录酶、抗hiv蛋白酶、抗唾液酸酶、抗解旋酶)的一种或多种。

本发明的第三方面，提供了一种预防或治疗病毒感染相关疾病和/或其症状的方法，所述方法包括：给予需要预防或治疗的对象有效量的kdm6a蛋白、其编码序列、和/或其促进剂、或有效量的上述的药物组合物。

优选的，所述病毒感染相关疾病和/或征状为选自下组的一种或多种因病毒感染引起的疾病和/或征状：病毒感染后的复制；病毒感染局部的细胞(皮肤的上皮细胞、外周血的免疫细胞、免疫器官中的免疫细胞以及实体器官的组成细胞)和组织(包括皮肤、肝脏、肾脏、脑、肺脏)损伤；病毒感染造成的器官(包括皮肤、肝脏、肾脏、脑、肺脏)功能损伤。

优选的，所述病毒感染是由选自下组的一种或多种病毒引起的：人乳头状瘤病毒、乙肝病毒、eb病毒、流行性出血热病毒、人获得性免疫缺陷病毒、严重急性呼吸综合征病毒、流感病毒。

优选的，所述i型干扰素选自：ifn-α或ifn-β。

本发明的第四方面，提供了一种预防或治疗因i型干扰素过量表达引起的组织和器官损伤和/或其征状的方法，所述方法包括：给予需要预防或治疗的对象有效量的kdm6a蛋白或其编码序列的抑制剂，或有效量的上述的药物组合物。

本发明优点在于：

1、本发明揭示了kdm6a及其编码序列的新功能，即有效促进i型ifn的产生，抵抗外源病毒感染，和治疗病毒感染导致的相关疾病的功能；

2、本发明提供了一种可有效促进i型ifn的产生，抵抗外源病毒感染，和治疗病毒感染导致的相关疾病的药物。

附图说明

图1：kdm6a真核表达载体转染小鼠腹腔巨噬细胞对vsv诱导的ifn-β产生的促进效果。其中，图1a为定量rt-pcr分析结果；图1b为elisa分析结果。

图2：干扰kdm6a在小鼠腹腔巨噬细胞的表达对vsv诱导的ifn-β产生的抑制效果。其中，图2a为定量rt-pcr分析；图2b为elisa分析。“sictrl”代表乱序对照干扰rna(scrambledcontrolrnainterference)；“sikdm6a”代表kdm6a特异性的干扰rna。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考sambrook等人《分子克隆实验指南》(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)，或按照制造厂商所建议的条件。dna的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明人通过大量的研究，发现kdm6a在病毒感染性疾病中，具有促进i型干扰素的产生的功能。在此基础上本发明人完成了本发明。

具体而言，针对ifn调节相关基因进行应用研究是病毒分子生物学和细胞生物学研究的热点，将ifn促进基因的核苷酸和蛋白质应用于病毒性疾病的预防和治疗是人工干预病毒性感染的有效技术，因此无论是在功能基因组研究，还是病毒相关地基因治疗方面均具有广阔地应用前景。

发明人通过研究发现过表达kdm6a能够促进i型干扰素的产生并且该功能与其tpr结构域的相互作用功能密切相关。干扰kdm6a的表达可以抑制i型干扰素的产生。提示kdm6a可能具备病毒性疾病的应用前景。因此本发明还公开了应用该抗病毒分子于病毒感染性疾病的预防和治疗的方法和策略。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

kdm6a蛋白(多肽)

如本文所用，术语“kdm6a蛋白(多肽)”、“kdm6a蛋白(多肽)”、“kdm6a”、“utx”可互换使用，其一种组蛋白h3k27me2/3去甲基化酶。本发明的kdm6a蛋白可为由seqidno：1的序列(人全长序列)或seqidno:1的第378-4583位序列(人cds序列)或seqidno:3(小鼠全长序列)或seqidno:3的第432-4637位序列(小鼠cds序列)所编码的蛋白质或这些蛋白质具有抗病毒作用的同源序列(例如可通过本领域已知的数据库或比对软件获得kdm6a的同源序列)、变异体或修饰形式。例如，所述kdm6a蛋白可选自：(a)seqidno：2或seqidno:4所示的氨基酸序列；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抑制炎症因子的活性的由(a)衍生的蛋白质或多肽。

本发明的蛋白质或多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等动物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明中kdm6a蛋白或多肽优选由人kdm6a基因或其同源基因或家族基因编码。

本发明蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的kdm6a蛋白质或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有抗病毒活性。

可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术来获得上述(b)中的蛋白质或多肽。可利用编码所述蛋白质或多肽的编码序列来构建转基因动物，并观察该转基因动物对病毒感染的抗性是否有所改良来筛选和鉴别所得蛋白质或多肽。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。该术语还包括kdm6a蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与kdm6a蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白、以及利用抗kdm6a蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还可使用其它多肽，如包含kdm6a蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了kdm6a蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有kdm6a蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

kdm6a蛋白编码基因

如本文所用，术语“kdm6a基因”或“kdm6a蛋白编码序列”可互换使用，均是指一种编码本发明所述的kdm6a蛋白或多肽的序列，其可为seqidno：1(人全长)或seqidno：1的第378-4583位(人cds)序列、seqidno：3(小鼠全长)或seqidno：3的第432-4637位(小鼠cds)序列所示的核苷酸序列、在严格条件下与这些序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表达对病毒感染具有一定的抑制作用。本发明的kdm6a基因可选自：(i)seqidno：1或seqidno：1的第378-4583位序列、seqidno：3或seqidno：3的第432-4637位序列所示的核苷酸序列；或(ii)在严格条件下与(i)限定的序列杂交且具有抑制炎症因子活性的分子。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc，0.1％sds，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。

本发明的kdm6a基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

应理解，本发明的kdm6a基因优选获自人，获自其它动物的与人kdm6a基因高度同源(如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如blast。

kdm6a或其编码序列的促进剂和抑制剂

本发明中还涉及kdm6a或其编码序列的“促进剂”。术语“促进剂”或“kdm6a或其编码序列的促进剂”可互换使用，是指可提高kdm6a或其编码序列的水平或活性的物质。可用于本发明中的促进剂包括但不限于：kdm6a表达载体、外源性kdm6a、kdm6a或其编码序列的裸dna、kdm6a或其编码序列的脂质体包裹dna、kdm6a蛋白。

本发明的kdm6a、其编码序列或其促进剂促进i型干扰素的产生进一步用于预防或治疗与病毒感染相关的疾病和/或其征状；

本发明中还涉及kdm6a或其编码序列的“抑制剂”。术语“抑制剂”或“kdm6a或其编码序列的抑制剂”可互换使用，是指可降低kdm6a或其编码序列的水平或活性的物质。可用于本发明中的抑制剂包括但不限于，针对kdm6a或其编码序列的：抗体、sirna、mirna、反义寡核苷酸、拮抗剂、阻断剂。

本发明的抑制剂可抑制i型干扰素的过度产生用于预防或治疗因i型干扰素过量表达引起的组织和器官损伤和/或其征状。

载体、宿主及转基因动物

本发明还涉及包含kdm6a基因的载体，以及用该载体经基因工程产生的宿主细胞，以及通过转基因获得高表达kdm6a的转基因动物。

通过常规的重组dna技术(science，1984；224：1431)，可利用本发明的编码序列可用来表达或生产重组的kdm6a蛋白。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码kdm6a蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；和

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质或多肽。

本发明中，术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、动物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含kdm6a编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本发明中优选使用pcdna3.1载体、pires2-egfp载体、adeno-x表达系统和psilencer2.1-u6-neo干扰载体。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；动物细胞等。在本发明中，优选采用大肠杆菌细菌细胞、小鼠巨噬细胞作为宿主细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是dna的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

本发明中术语“转基因动物”、或“转化动物”可互换使用，均指通过常规转基因的方法获得的转入本发明kdm6a基因并稳定高表达kdm6a蛋白或多肽的细胞、器官、组织或个体。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

药物、药物组合物或试剂盒

本发明还提供了一种药物、药物组合物或试剂盒，其中含有有效量的本发明的kdm6a或kdm6a编码序列、其促进剂或抑制剂，以及药学上或免疫学上可接受的载体。如本文所用，术语“活性物质”或“本发明的活性物质”可互换使用，是指kdm6a或kdm6a编码序列、其促进剂或抑制剂。

在较佳的实施方案中，所述药物组合物可用于治疗与现有技术中已知可治疗或预防病毒感染相关疾病和/或征状，例如：病毒感染后的复制；病毒感染后的复制；病毒感染局部的细胞(皮肤的上皮细胞、外周血的免疫细胞、免疫器官中的免疫细胞以及实体器官的组成细胞)和组织(包括皮肤、肝脏、肾脏、脑、肺脏)损伤；病毒感染造成的器官(包括皮肤、肝脏、肾脏、脑、肺、脾脏)功能损伤。

在本发明中，所述病毒感染相关疾病和/或征状可选自：带状疱疹、疱疹性口咽、小儿病毒性肺炎、流行性乙型脑炎、病毒性肝炎、艾滋病、尖锐湿疣、sars。

病毒感染可由选自下组的一种或多种病毒引起的：人乳头状瘤病毒、乙肝病毒、eb病毒、流行性出血热病毒、人获得性免疫缺陷病毒、严重急性呼吸综合征病毒、流感病毒。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。

如本文所用，术语“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(remington’spharmaceuticalsciences，mackpub.co.，n.j.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、ph缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地，ph约为6-8。

本发明的组合物中kdm6a蛋白或其编码序列有效成分占组合物总重量的0.001～99.9wt％；优选为组合物总重量的1～95wt％，较优选为5～90wt％，更优选10～80wt％。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。

如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用方便，将本发明的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

在本发明的另一优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型，且其中kdm6a蛋白或其编码序列的含量为0.01～2000mg/剂，优选0.1～1500mg/剂，更优选1～1000mg/剂。在本发明的另一个优选例中，每天施用1～6剂本发明的组合物，优选施用1～3剂；最优选的，每天服用的剂量为1剂。

应理解，所用kdm6a蛋白或其编码序列的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。

本发明的组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。给药途径可采用：(1)直接裸dna或者蛋白质注射法；(2)将kdm6a的cdna、mrna和蛋白质与转铁蛋白/多聚l-赖氨酸复合物连接，以增强其生物效应；(3)cdna、mrna和蛋白质与带正电荷的脂类形成复合物，以克服磷酸骨架负电荷所致的穿越细胞膜的困难；(4)用脂质体包裹cdna、mrna和蛋白质后介导进入细胞，既有利于大分子的顺利进入又免受细胞外各种酶的水解作用；(5)cdna、mrna和蛋白质与胆固醇结合使其胞浆保持时间增加10倍；(6)用免疫脂质体转运cdna、mrna和蛋白质可使其特异性转运至靶组织和靶细胞；(7)将cdna、mrna和蛋白质体外转染给转载细胞(如成纤维细胞)也可较好地将kdm6a相关药物载入靶细胞内；(8)电打孔(electroporation)，即借助于电流将cdna、mrna和蛋白质导入靶细胞。

此外，本发明的组合物中还可含有用于改善和治疗病毒感染性疾病的其它活性物质，所述的其它活性物质选自下组：临床常用抗病毒药物(包括抗甲型流感病毒表面m2受体、抗神经氨酸苷酶、抗单磷酸次黄嘌呤核苷酸脱氢酶、抗病毒dna多聚酶、抗hiv逆转录酶、抗hiv蛋白酶、抗唾液酸酶、抗解旋酶)的一种或多种。

本发明的kdm6a相关的核苷酸和蛋白质药物相互间可以联合应用，还可以与其它药物和治疗手段联合，用于病毒感染性疾病的预防和治疗。

实施例1：kdm6a对巨噬细胞ifn-β产生的促进作用

腹腔注射3％的脱水硫羟乙酸培养基2ml，4天后，颈椎脱臼法处死小鼠，75％酒精浸泡5-10分钟，小鼠腹部朝上，在腹中线剪开一小口，撕开皮肤，完全暴露腹膜。然后用20ml注射器注入10ml无血清1640培养基，针尖于腹膜下至腹腔则边，且针尖朝上，避开肠子和脂肪，缓慢抽吸，此时，腹腔灌洗液即含有大量巨噬细胞。将收集的腹腔液放于50ml的离心管。重复此步骤一次，共20ml。细胞悬液800g离心5分钟，弃上清，用含有10％fcs的dmem重悬。细胞悬液置入培养板，37℃培养1小时后换液，贴壁细胞即为新鲜分离的小鼠腹腔巨噬细胞。

采用pcdna3.1(购自invitrogen公司)作为真核表达载体，将带有xhoi/bamhi酶切位点的kdm6a的seqidno:3的cdna产物插入该载体的相应位置，在e.coli菌株dh-5α内扩增该载体，测序鉴定后纯化得到kdm6a的真核表达载体。瞬时转染(转染试剂jetpei-macrophage购自polyplus公司)小鼠巨噬细胞。48小时后，加入0.1moi的活vsv病毒(indianastrain)(可购自atcc，也可采用下述文献方法制备：lix,zhangq,dingy,liuy,zhaod,zhaok,shenq,liux,zhux,lin,chengz,fang,wangq,caox.methyltransferasednmt3aupregulateshdac9todeacetylatetbk1foractivationofantiviralinnateimmunity.natureimmunology.2016；17(7):806-815.)处理不同时间后，收集细胞和培养上清，制备cdna用于定量rt-pcr(94℃，30sec；58℃，30sec；72℃，30sec；共30循环)检测ifn-βmrna水平；或者用培养上清通过elisa(所用试剂盒购自pbl公司)检测ifn-β蛋白水平。

ifn-βmrna的定量rt-pcr分析和ifn-β的elisa分析的结果分别如图1a和图1b所示。结果显示：kdm6a真核表达载体能够促进小鼠巨噬细胞ifn-β的产生。

实施例2：干扰kdm6a表达对巨噬细胞ifn-β产生的抑制作用

用针对kdm6a的干扰rna(si-kdm6a)及模拟物对照(si-模拟物)转染(转染试剂interferin购自polyplus公司)如上所得的小鼠巨噬细胞，6小时后更换新鲜rpmi1640培养基。

针对kdm6a的干扰rna(si-kdm6a)及模拟物对照(si-模拟物)购自genephama公司，si-kdm6a的序列如seqidno：5和seqidno：6所示，si-模拟物的序列如seqidno：7和seqidno：8所示，合成时在3'增加2个dt使序列更加稳定。

具体序列如下：

si-kdm6a序列：

5'-gcugcuacgaaucucuaautt-3'(顺义)；

5'-auuagagauucguagcagctt-3'(反义)。

si-模拟物序列：

5'-uucuccgaacgugucacgutt-3'(顺义)；

5'-acgugacacguucggagaatt-3′(反义)。

48小时后，加入0.1moi的活vsv病毒(可购自atcc，也可采用下述文献方法制备：lix,zhangq,dingy,liuy,zhaod,zhaok,shenq,liux,zhux,lin,chengz,fang,wangq,caox.methyltransferasednmt3aupregulateshdac9todeacetylatetbk1foractivationofantiviralinnateimmunity.natureimmunology.2016；17(7):806-815.)处理不同时间后，收集细胞和培养上清，制备cdna用于定量rt-pcr(94℃，30sec；58℃，30sec；72℃，30sec；共30循环)检测kdm6amrna水平,ifn-βmrna水平；或者用培养上清通过elisa(所用试剂盒购自pbl公司)检测ifn-β蛋白水平。

kdm6amrna水平，ifn-βmrna的定量rt-pcr分析和ifn-β的elisa分析的结果分别如图2a和图2b所示。结果显示：干扰kdm6a在小鼠巨噬细胞的表达对ifn-β产生起抑制作用。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

sequencelisting

<110>中国人民解放军第二军医大学

<120>一种新型抗病毒分子kdm6a的抗病毒作用及其应用

<130>/

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>5785

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<220>

<221>cds

<222>(378)..(4583)

<400>1

gtgtgacacaattacaacaactttgtgctggtgccggggaagtttgtgtctccaacgaat60

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