一种具有抗内皮炎症的王不留行刺桐碱的应用制作方法与流程

一种具有抗内皮炎症的王不留行刺桐碱的应用制作方法，属于中药应用技术领域。本发明涉及一种具有抗内皮炎症的王不留行刺桐碱，阐明其在医药，食品、化妆品方面的新用途。

背景技术：

血管内皮细胞是介于血流和血管壁组织之间的一层单核细胞，可通过自分泌、内分泌、旁分泌三种途径分泌一系列一氧化氮(NO)、前列环素2(PGI2)、内皮素-1(ET-1)等血管活性物质发挥调节血管紧张性、抗血栓形成、抑制平滑肌细胞增殖及血管壁炎症反应等功能。近年来研究发现内皮炎症是很多心血管疾病的共同病理基础，研究证实内皮炎症是导致高血压、糖尿病、冠心病等患者内皮结构和功能严重受损的重要因素。炎症反应介导的内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发生发展的重要机制之一，在高血压、糖尿病内皮功能障碍的病理过程中也具有重要的作用。炎症内皮细胞影响细胞外基质和纤维蛋白原降解，增加血管基膜厚度，产生的粘附分子增加内皮细胞对白细胞的粘附，也会引起内皮细胞损伤，以内皮炎症为靶点成为治疗高血压、糖尿病、冠心病等血管病变的主要策略之一。我国学者研究发现脑心通、通心络、血脂康胶囊、黄连素等传统中药均可通过抑制内皮细胞炎症来促进内皮细胞修复，进而恢复血管平衡稳态，减少心血管不良事件。我国中药博大精深，筛选具有抗内皮炎症的中药不仅拓展了治疗内皮炎症相关疾病的选择，也为我国治疗内皮炎性相关心血管疾病的药物筛选提供的新的策略。

王不留行是石竹科植物麦蓝菜Vaccaria Segetalis(Neck.)Garcke的干燥成熟种子，具有活血通经、下乳消肿等功效。王不留行主要含有刺桐碱、三萜皂苷、黄酮苷、类脂、环肽、脂肪酸和单糖等成分，过去本实验室研究发现通过单因素实验、正交实验及验证实验，对王不留行刺桐碱得率进行工艺优化，将王不留行种子经石油醚脱脂，75％乙醇85℃回流提取，减压浓缩至干，去离子水复溶，水饱和正丁醇萃取得正丁醇相，再用硅胶GF254板，以展开剂为正丁醇:乙酸乙酯:水＝4:1:5的薄层层析制备；C18柱高效制备液相分离得刺桐碱，并经理化性质鉴定、红外光谱、紫外光谱、质谱、核磁共振技术确定王不留行刺桐碱的结构。经过查阅大量文献，尚未见到我国学者对王不留行刺桐碱抗内皮炎症的相关文献报道(自CNKI、万方、维普中国期刊网)，因此王不留行刺桐碱在具有抗内皮炎症的药理、药效等研究领域目前还处于空白阶段。本研究发现王不留行刺桐碱具有抑制内皮细胞炎症的作用，为治疗内皮细胞炎症相关疾病提供新的治疗方法与应用。

技术实现要素：

所述王不留行刺桐碱对内皮细胞炎症的影响，将人微血管内皮细胞(HMEC-1)给予不同浓度的脂多糖(LPS)和王不留行刺桐碱孵育48h，经实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测内皮炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达。本发明要解决的是为现有的治疗内皮炎症的药物提供一种新的途径，提供王不留行刺桐碱在抗内皮细胞炎症中的作用，因此本研究提供的技术方法是将王不留行刺桐碱应用于制备抗内皮细胞炎症的药物。

本发明的有益效果是：王不留行刺桐碱显著抑制LPS诱导内皮细胞炎症，将王不留行刺桐碱应用到抗内皮细胞炎症相关疾病药物的开发中，以制备更好的抗内皮炎症相关心血管疾病药物。

附图说明

图1：脂多糖诱导的炎症内皮细胞模型。

图2：王不留行刺桐碱对内皮细胞炎症因子的影响。

图3：王不留行刺桐碱对脂多糖诱导的内皮细胞炎症的影响。

图4：王不留行刺桐碱对脂多糖诱导的内皮细胞TLR4的影响。

具体实施方式

实施例1脂多糖诱导的炎症内皮细胞模型

将处于对数期的人微血管内皮细胞(HMEC-1)消化后传代至6孔板，待细胞长至70％-80％状态下给予脂多糖(LPS)在不同浓度(0，100，200和500ng/ml)情况下孵育48h，弃去培养基，无菌磷酸盐缓冲生理液体(PBS)清洗三次，Trizol提取RNA，经RT-PCR检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达。结果显示LPS剂量依赖性升高内皮细胞TNF-α、IL-1β、VCAM-1和MCP-1的水平，提示LPS诱导炎症内皮细胞模型成功，见图1。

数据均以均值±标准差(mean±SD)表示，每组样本为4，P<0.05为有统计学差异，*与0ng/ml组相比，TNF-α，肿瘤坏死因子-α；IL-1β，白介素-1β；VCAM-1，血管细胞粘附分子-1；MCP-1，单核细胞趋化蛋白-1。

实施例2王不留行刺桐碱对内皮细胞炎症因子的影响

将处于对数期的人微血管内皮细胞(HMEC-1)消化后传代至6孔板，待细胞长至70％-80％状态下给予王不留行刺桐碱在不同浓度(0，25，50，100μM)情况下孵育48h，弃去培养基，无菌磷酸盐缓冲生理液体(PBS)清洗三次，Trizol提取RNA，经RT-PCR检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达。结果显示不同剂量的王不留行刺桐碱对内皮细胞TNF-α、IL-1β、VCAM-1和MCP-1的水平无明显影响，见图2。

数据均以均值±标准差(mean±SD)表示，每组样本为4，TNF-α，肿瘤坏死因子-α；IL-1β，白介素-1β；VCAM-1，血管细胞粘附分子-1；MCP-1，单核细胞趋化蛋白-1。

实施例3王不留行刺桐碱对脂多糖诱导的内皮细胞炎症的影响

将处于对数期的人微血管内皮细胞(HMEC-1)消化后传代至6孔板，待细胞长至70％-80％状态下先给予不同浓度的王不留行刺桐碱(0，25，50，100μM)孵育6h，再给予高剂量的脂多糖(LPS，500ng/ml)处理48h，弃去培养基，无菌磷酸盐缓冲生理液体(PBS)清洗三次，Trizol提取RNA，经RT-PCR检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达。结果显示高剂量的王不留行刺桐碱显著抑制LPS诱导的内皮细胞炎症，见图3。

数据均以均值±标准差(mean±SD)表示，每组样本为4，P<0.05为有统计学差异，*与Control组相比，与LPS组相比，P<0.05。LPS，脂多糖；TNF-α，肿瘤坏死因子-α；IL-1β，白介素-1β；VCAM-1，血管细胞粘附分子-1；MCP-1，单核细胞趋化蛋白-1。

实施例4王不留行刺桐碱对脂多糖诱导的内皮细胞TLR4的影响

Toll样受体4(TLR4)是参与内皮细胞炎症的重要分子，而脂多糖(LPS)是TLR4的激活剂，为研究王不留行刺桐碱对脂多糖诱导的内皮细胞TLR4的影响，我们采用Western Blot和RT-PCR技术发现，LPS剂量依赖性升高内皮细胞TLR4的表达，单纯的王不留行刺桐碱不影响内皮细胞TLR4的表达，但却可以降低LPS诱导的内皮细胞TLR4蛋白和mRNA的表达，见图4，(A)，LPS对TLR4蛋白的影响；(B)，LPS对TLR4的mRNA的影响；(C)，王不留行刺桐碱对TLR蛋白的影响；(D)，王不留行刺桐碱对TLR4的mRNA的影响；(E)，王不留行刺桐碱对LPS诱导的TLR4蛋白的影响；(F)，王不留行刺桐碱对LPS诱导的TLR4的mRNA的影响。

数据均以均值±标准差(mean±SD)表示，每组样本为4，P<0.05为有统计学差异，*与Control组相比，与LPS组相比，P<0.05。LPS，脂多糖；TNF-α，肿瘤坏死因子-α；IL-1β，白介素-1β；VCAM-1，血管细胞粘附分子-1；MCP-1，单核细胞趋化蛋白-1。