一种四氧化三铁/奥曲肽修饰的纳米脂质体及其制备方法与流程

本发明属于医药技术领域，特别涉及一种载药脂质体及其制备方法。

背景技术：

当前，全世界由恶性肿瘤引起的死亡所占比率越来越高，而目前所拥有的治疗手段如化疗、放射疗法、手术治疗等手段对机体具有非常大的副作用，因此寻求一种安全、无毒副作用的癌症治疗手段仍然是全球癌症治疗面临的一大难题。

研究发现脂溶性抗肿瘤药物，除具有显著的抗肿瘤效果外，还具有多种生物学效应，如抗炎、抗氧化、抗病毒等，药学价值显著。但是其在体内的生物利用度较差，血液半衰期短，这些缺点使其应用受到限制。纳米脂质体是一种认可度较高的新型载体系统，由磷脂双分子层、胆固醇构成，疏水性药物包覆在磷脂双分子层之间，亲水性药物包覆在亲水性核心，可以提高包载药物生物利用度，且生物相容性良好。然而传统脂质体载药系统仍存在一定缺陷，如不能实现药物靶向运输和精准释放等。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种制备方法简单、成本较低、重复性高、能高效靶向肿瘤组织或细胞，且提高肿瘤细胞对药物摄取率的四氧化三铁/奥曲肽修饰的纳米脂质体及其制备方法。

本发明主要是以包载脂溶性药物纳米脂质体为基础，在其上修饰l-谷氨酸，使脂质体带负电荷，在ph为6.0～7.5条件下，奥曲肽带正电，在温和条件下避光孵育，即可得到奥曲肽修饰的载药脂质体。

本发明的fe3o4/奥曲肽脂质体是一种粒径大小为80-200nm，表面具有磁性fe3o4纳米粒子的奥曲肽修饰的载药纳米脂质体。

上述fe3o4/奥曲肽脂质体的制备方法如下：

(1)制备谷氨酸修饰的载药纳米脂质体

①原料：胆固醇、大豆卵磷脂、脂溶性药物、聚乙二醇-2000、吐温-80、l-谷氨酸；所述脂溶性药物为脂溶性天然来源抗肿瘤药物，如齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸等。

②将脂溶性药物、大豆卵磷脂、胆固醇按质量比1:12～40:1.4～4混合，按每毫升无水乙醇加入上述混合物22.5～36mg的比例，将它们磁力搅拌溶解于无水乙醇中形成脂相溶液；将聚乙二醇-2000、谷氨酸按质量比1:1～2混合，按每毫升磷酸缓冲液加入聚乙二醇-2000和谷氨酸混合物0.25～0.75mg的比例，将其溶解到磷酸缓冲液中作为水相溶液，用浓度为1mol/lnaoh溶液将水相溶液调节ph为6.0～7.5，由于谷氨酸在水溶液中为酸性，溶解后ph为4左右，偏酸性条件会影响脂质体形貌；再按每毫升水相溶液加入1～1.5μl吐温-80，以增加药物溶解性；

③将水相溶液水浴加热至30～50℃，到达相变温度，随后按脂相溶液与水相溶液的体积比1:4～6的比例，在磁力搅拌器搅拌下，将脂相溶液缓慢匀速逐滴滴入到水相溶液中，转速为80～150rpm，保证脂质体粒径大小在80-200nm范围内，得到脂质体悬液；最后继续旋转蒸发1.5～3小时除去无水乙醇，得到谷氨酸修饰的纳米脂质体；

(2)制备奥曲肽修饰的载药脂质体

①配制奥曲肽溶液：按每毫升去离子水加入2～6mg奥曲肽的比例，用去离子水溶解奥曲肽，超声振荡2～10min；

②采用共孵育法使奥曲肽修饰到载药脂质体上：按谷氨酸修饰的纳米脂质体与奥曲肽溶液体积比体积为1:1～3的比例，将步骤(1)得到的谷氨酸修饰的纳米脂质体与步骤①配制的奥曲肽溶液均匀混合，制得脂质体/奥曲肽混悬液；

③将步骤②制备的脂质体/奥曲肽混悬液置于摇床25～30℃，90～140rpm，孵育2～6h，使得谷氨酸修饰的脂质体充分与奥曲肽结合，从而得到奥曲肽修饰的载药纳米脂质体；

(3)制备fe3o4/奥曲肽修饰的纳米脂质体

①制备fe3o4纳米粒子

共沉淀法制备fe3o4纳米粒子：以每克铁盐加入5～7ml去离子水的比例，将fecl3·6h2o、fecl2·4h2o按照摩尔比1～3:1溶解于去离子水中，配制成铁盐溶液，以0.01～0.03g/ml的比例，向铁盐溶液中加入peg-2000用来修饰fe3o4纳米粒子，使其具有亲水性；再将上述铁盐溶液置于超声清洗仪中超声，40～60℃温度下，采用机械搅拌，同时按每毫升铁盐溶液中再滴加1.4～3.0mlnaoh溶液的比例，向铁盐溶液中加入浓度为1～3mol/lnaoh溶液，生成磁性fe3o4粒子，直至溶液变为纯黑色，反应完全后置于80℃水浴中熟化10～20min；将黑色悬浊液置于磁铁上进行磁分离，沉淀fe3o4，倾倒上清液，用水、无水乙醇分别交替清洗三次，将终产物在70℃烘箱中彻底烘干，存放在干燥器中待用；

②按每毫升去离子水加入0.5～2mgfe3o4的比例，将步骤①的fe3o4溶解于去离子水中，超声分散2～6h；

③按步骤②制备的fe3o4溶液与步骤(2)制备的奥曲肽修饰的载药脂质体的体积比为1:0.5～2的比例，将fe3o4溶液与奥曲肽修饰的载药脂质体混合孵育3～8h，获得fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、制备的fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体具有理想的形貌，粒径分布在80-200nm之间，不仅可以在外加磁场作用下提高脂质体在肿瘤部位积累，达到更好的治疗效果，还具有磁热转换性能，使包载的载药实现可控释放，达到热疗效果。

2、制备的fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体在外加磁场作用下可以定向、定速到达肿瘤细胞，同时奥曲肽特异性配体作用下，通过受体-配体相互作用，使纳米脂质体同时具有内靶向(受体-配体靶向)和外靶向(磁靶向)，该载药系统可实现靶向运输药物、药物精准释放、磁热治疗、和化学治疗等多种功效，提高肿瘤的治疗效果；此外还能够将化学治疗和磁热治疗、精准释放相结合，不仅可以高效进行癌症治疗，且应用的原材料均对人体无毒副作用，减少药物对正常组织和细胞的损伤。

3、在常温、常压及温和条件下完成制备，所需实验条件温和，操作简便，易于控制，重复性高。

4、制备过程较为简练，成本较低，且连接剂谷氨酸为人体必需氨基酸，可以为人体补充所需氨基酸。

附图说明

图1是本发明实施例1所得fe3o4纳米粒子透射电子显微镜图。

图2是本发明实施例2所得奥曲肽修饰的载药纳米脂质体透射电子显微镜图。

图3是本发明实施例2所得fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体透射电子显微镜图。

图4是本发明实施例3所得fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体粒径分布图。

图5是本发明实施例4所得纳米脂质体不同剂型条件下zeta电位图。

图6是本发明实施例5所得fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体磁响应性结果图。

图7是本发明实施例6所得fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体体外细胞毒性实验结果图。

具体实施方式

实施例1

以天然脂溶性抗肿瘤药物-齐墩果酸为模板药物，将1.0mg齐墩果酸(购自四川什邡市华康药物原料厂)、40mg大豆卵磷脂(购自沈阳天峰生物制药有限公司)和4.0mg胆固醇(购自天津市大茂化学仪器供应站)溶解于2ml无水乙醇中，通过磁力搅拌形成脂相溶液；将1mgpeg，1mg谷氨酸溶解到8ml磷酸缓冲液中作为水相溶液，用浓度为1mol/lnaoh溶液将水相溶液调节ph至6.0，加入8μl吐温-80。在磁力搅拌下，将2ml脂相缓慢匀速逐滴滴入到30℃8ml水相溶液中，转速为80rpm，得到脂质体悬液，最后继续旋转蒸发1.5h除去脂质体悬液中的无水乙醇，得到谷氨酸修饰的齐墩果酸纳米脂质体。

将奥曲肽用去离子水溶解，配制浓度为2mg/ml的溶液，水浴超声2min；采用共孵育法，将得到的谷氨酸修饰的齐墩果酸纳米脂质体与2mg/ml奥曲肽溶液，按体积比1:1的比例混合，置于摇床，25℃，90rpm，孵育2h得到奥曲肽修饰的齐墩果酸纳米脂质体。

以每克铁盐加入5ml去离子水的比例，将fecl3·6h2o、fecl2·4h2o按照摩尔比1:1溶解于5ml去离子水中，加入0.05gpeg-2000。将上述铁盐溶液置于超声清洗仪中超声，40℃下，采用机械搅拌器搅拌，同时滴加15ml浓度为1mol/lnaoh溶液，生成磁性fe3o4粒子，直至溶液变为纯黑色，反应完全后置于80℃水浴中熟化10min。将黑色悬浊液置于磁铁上进行磁分离，沉淀fe3o4，弃去上清液，用水、无水乙醇分别交替清洗三次。将终产物在70℃烘箱中彻底烘干，存放在干燥器中待用。将fe3o4溶解于去离子水中，使其浓度为0.5mg/ml，超声分散2h，并与制备的奥曲肽修饰的齐墩果酸脂质体1:0.5体积比混合孵育3h，即获得fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体。

应用透射电子显微镜对fe3o4纳米粒子进行形貌表征，如图1所示，可以看出，fe3o4纳米粒子粒径为10～20nm，且有聚集现象。

实施例2

以天然脂溶性抗肿瘤药物-白桦脂酸为模板药物，将1.5mg白桦脂酸(购自南京泽朗医药科技有限公司)、45mg大豆卵磷脂(购自沈阳天峰生物制药有限公司)和4.5mg胆固醇(购自天津市大茂化学仪器供应站)溶解于2ml无水乙醇中，通过磁力搅拌形成脂相溶液。将1.0mgpeg，1.5mg谷氨酸溶解到9ml磷酸缓冲液中作为水相溶液，用浓度为1mol/lnaoh溶液将水相溶液调节ph至6.2，加入11μl吐温-80。在磁力搅拌下，将2ml脂相缓慢匀速逐滴滴入到34℃9ml水相溶液中，转速为90rpm，得到脂质体悬液。最后继续旋转蒸发1.7h除去脂质体悬液中的无水乙醇，得到谷氨酸修饰的白桦脂酸纳米脂质体。

将奥曲肽用去离子水溶解，配制浓度为2.5mg/ml的溶液，水浴超声3min；采用共孵育法，将得到的谷氨酸修饰的脂质体与2.5mg/ml奥曲肽溶液，按体积比1:1的比例混合，置于摇床，26℃，100rpm，孵育2.2h得到奥曲肽修饰的白桦脂酸纳米脂质体。

以每克铁盐加入5ml去离子水的比例，将fecl3·6h2o、fecl2·4h2o按照摩尔比2:1溶解于5ml去离子水中，加入0.1gpeg-2000。将上述铁盐溶液置于超声清洗仪中超声，44℃下，采用机械搅拌器搅拌，同时滴加14ml浓度为1.2mol/lnaoh溶液，生成磁性fe3o4粒子，直至溶液变为纯黑色，反应完全后置于80℃水浴中熟化12min。将黑色悬浊液置于磁铁上进行磁分离，沉淀fe3o4，弃去上清液，用水、无水乙醇分别交替清洗三次。将终产物在70℃烘箱中彻底烘干，存放在干燥器中待用。将fe3o4溶解于去离子水中，使其浓度为0.7mg/ml，超声分散2.5h，并与制备的奥曲肽修饰的白桦脂酸脂质体1:0.7体积比混合孵育4h，即获得fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体。

应用透射电子显微镜对奥曲肽修饰的脂质体及fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体进行形貌表征，如图2所示，奥曲肽修饰的白桦脂酸纳米脂质体呈球形，形貌规则，没有团聚现象，分散性良好。如图3所示，fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体在其表面可观察到fe3o4纳米粒子，粒径在80-200nm范围内。

实施例3

以天然脂溶性抗肿瘤药物-熊果酸为模板药物，将3.0mg熊果酸(购自四川什邡市华康药物原料厂)、50mg大豆卵磷脂(购自沈阳天峰生物制药有限公司)和5.0mg胆固醇(购自天津市大茂化学仪器供应站)溶解于2ml无水乙醇中，通过磁力搅拌形成脂相溶液。将2.5mgpeg，4.5mg谷氨酸溶解到10ml磷酸缓冲液中作为水相溶液，用浓度为1mol/lnaoh溶液将水相溶液调节ph至7.0，加入12μl吐温-80。在磁力搅拌下，将2ml脂相缓慢匀速逐滴滴入到40℃10ml水相溶液中，转速为110rpm，得到脂质体悬液。最后继续旋转蒸发2h除去脂质体悬液中的无水乙醇，得到谷氨酸修饰的熊果酸纳米脂质体。

将奥曲肽用去离子水溶解，配制浓度为4mg/ml的溶液，水浴超声5min；采用共孵育法，将得到的谷氨酸修饰的脂质体与4mg/ml奥曲肽溶液，按体积比1:1.5的比例混合，置于摇床，28℃，110rpm，孵育4h得到奥曲肽修饰的熊果酸纳米脂质体。

以每克铁盐加入6ml去离子水的比例，将fecl3·6h2o、fecl2·4h2o按照摩尔比2.2:1溶解于6ml去离子水中，加入0.12gpeg-2000。将上述铁盐溶液置于超声清洗仪中超声，50℃下，采用机械搅拌，同时滴加13ml浓度为2mol/lnaoh溶液，生成磁性fe3o4粒子，直至溶液变为纯黑色，反应完全后将反应液置于80℃水浴中熟化15min。将黑色悬浊液置于磁铁上进行磁分离，沉淀fe3o4，弃去上清液，用水、无水乙醇分别交替清洗三次。将终产物在70℃烘箱中彻底烘干，存放在干燥器中待用。将fe3o4溶解于去离子水中，使其浓度为1mg/ml，超声分散4h，并与制备的奥曲肽修饰的熊果酸脂质体1:1.2体积比混合孵育5h，即获得fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体。

利用激光粒度仪检测fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体粒径分布情况，如图4所示，可以看出fe3o4/奥曲肽修饰后脂质体粒径分布在80-200nm左右，证明纳米脂质体粒径均匀，分散性良好。

实施例4

以天然脂溶性抗肿瘤药物-熊果酸为模板药物，将3.5mg熊果酸(购自四川什邡市华康药物原料厂)、52mg大豆卵磷脂(购自沈阳天峰生物制药有限公司)和5.5mg胆固醇(购自天津市大茂化学仪器供应站)溶解于2ml无水乙醇中，通过磁力搅拌形成脂相溶液。将1.5mgpeg，3mg谷氨酸溶解到11ml磷酸缓冲液中作为水相溶液，用浓度为1mol/lnaoh溶液将水相溶液调节ph至6.8，加入13μl吐温-80。在磁力搅拌下，将2ml脂相缓慢匀速逐滴滴入到45℃11ml水相溶液中，转速为120rpm，得到脂质体悬液。最后继续旋转蒸发2.5h除去脂质体悬液中的无水乙醇，得到谷氨酸修饰的熊果酸纳米脂质体。

将奥曲肽用去离子水溶解，配制浓度为5mg/ml的溶液，水浴超声7min；采用共孵育法，将得到的谷氨酸修饰的脂质体与5mg/ml奥曲肽溶液，按体积比1:2的比例混合，置于摇床，26℃，120rpm，孵育4.5h得到奥曲肽修饰的熊果酸纳米脂质体。

以每克铁盐加入6.5ml去离子水的比例，将fecl3·6h2o、fecl2·4h2o按照摩尔比2:1溶解于6.5ml去离子水中，加入0.13gpeg-2000。将上述铁盐溶液置于超声清洗仪中超声，54℃下，采用机械搅拌器搅拌，同时滴加12ml浓度为2.3mol/lnaoh溶液，生成磁性fe3o4粒子，直至溶液变为纯黑色，反应完全后置于80℃水浴中熟化17min。将黑色悬浊液置于磁铁上进行磁分离，沉淀fe3o4，弃去上清液，用水、无水乙醇分别交替清洗三次。将终产物在70℃烘箱中彻底烘干，存放在干燥器中待用。将fe3o4溶解于去离子水中，使其浓度为1.7mg/ml，超声分散7h，并与制备的奥曲肽修饰的熊果酸脂质体1:1.6体积比混合孵育6h，即获得fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体。

利用激光粒度仪检测fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体带电荷状态，如图5所示，由于奥曲肽在去离子水中带正电荷，谷氨酸带负电荷，fe3o4磁性纳米粒子带负电荷，可以看出奥曲肽修饰的脂质体负电性明显减小，证明奥曲肽成功修饰到纳米脂质体上，fe3o4纳米粒子修饰后负电性增大，证明fe3o4纳米粒子结合到脂质体表面。

实施例5

以天然脂溶性抗肿瘤药物-齐墩果酸为模板药物，将4.5mg齐墩果酸(购自四川什邡市华康药物原料厂)、54mg大豆卵磷脂(购自沈阳天峰生物制药有限公司)和6.3mg胆固醇(购自天津市大茂化学仪器供应站)溶解于2ml无水乙醇中，通过磁力搅拌形成脂相溶液。将2mgpeg，3.6mg谷氨酸溶解到12ml磷酸缓冲液中作为水相溶液，用浓度为1mol/lnaoh溶液将水相溶液调节ph至7.2，加入16μl吐温-80。在磁力搅拌下，将2ml脂相缓慢匀速逐滴滴入到49℃12ml水相溶液中，转速为140rpm，得到脂质体悬液。最后继续旋转蒸发2.7h除去脂质体悬液中的无水乙醇，得到谷氨酸修饰的齐墩果酸纳米脂质体。

将奥曲肽用去离子水溶解，配制浓度为5.5mg/ml的溶液，水浴超声8min；采用共孵育法，将得到的谷氨酸修饰的脂质体与5.5mg/ml奥曲肽溶液，按体积比1:2.5的比例混合，置于摇床，27℃，130rpm，孵育5.4h得到奥曲肽修饰的齐墩果酸纳米脂质体。

以每克铁盐加入7ml去离子水的比例，将fecl3·6h2o、fecl2·4h2o按照摩尔比1:1溶解于7ml去离子水中，加入0.18gpeg-2000。将上述铁盐溶液置于超声清洗仪中超声，56℃下，采用机械搅拌器搅拌，同时滴加11ml浓度为2.5mol/lnaoh溶液，生成磁性fe3o4粒子，直至溶液变为纯黑色，反应完全后置于80℃水浴中熟化18min。将黑色悬浊液置于磁铁上进行磁分离，沉淀fe3o4，弃去上清液，用水、无水乙醇分别交替清洗三次。将终产物在70℃烘箱中彻底烘干，存放在干燥器中待用。将fe3o4溶解于去离子水中，使其浓度为1.7mg/ml，超声分散5.5h，并与制备的奥曲肽修饰的齐墩果酸脂质体1:2.5体积比混合孵育7h，即获得fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体。

利用磁铁对fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体进行磁响应性试验，如图6所示，可以看出通过磁场作用3min，纳米脂质体被吸附到磁铁一侧，且溶液几乎呈透明状态，证明双靶向脂质体具有磁靶向性能。

实施例6

以天然脂溶性抗肿瘤药物-白桦脂酸为模板药物，将5.0mg白桦脂酸(购自南京泽朗医药科技有限公司)、60mg大豆卵磷脂(购自沈阳天峰生物制药有限公司)和7.0mg胆固醇(购自天津市大茂化学仪器供应站)溶解于2ml无水乙醇中，通过磁力搅拌形成脂相溶液。将3mgpeg，6mg谷氨酸溶解到12ml磷酸缓冲液中作为水相溶液，用浓度为1mol/lnaoh溶液将水相溶液调节ph至7.5，加入18μl吐温-80。在磁力搅拌下，将2ml脂相缓慢匀速逐滴滴入到50℃12ml水相溶液中，转速为150rpm得到脂质体悬液。最后继续旋转蒸发3h除去脂质体悬液中的无水乙醇，得到谷氨酸修饰的白桦脂酸纳米脂质体。

将奥曲肽用去离子水溶解，配制浓度为6mg/ml的溶液，水浴超声10min；采用共孵育法，将得到的谷氨酸修饰的脂质体与6mg/ml奥曲肽溶液，按体积比1:3的比例混合，置于摇床，30℃，140rpm，孵育6h得到奥曲肽修饰的白桦脂酸纳米脂质体。

以每克铁盐加入7ml去离子水的比例，将fecl3·6h2o、fecl2·4h2o按照摩尔比3:1溶解于7ml去离子水中，加入0.21gpeg-2000。将上述铁盐溶液置于超声清洗仪中超声，60℃下，采用机械搅拌器搅拌，同时滴加10ml浓度为3mol/lnaoh溶液，生成磁性fe3o4粒子，直至溶液变为纯黑色，反应完全后置于80℃水浴中熟化20min。将黑色悬浊液置于磁铁上进行磁分离，沉淀fe3o4，弃去上清液，用水、无水乙醇分别交替清洗三次。将终产物在70℃烘箱中彻底烘干，存放在干燥器中待用。将fe3o4溶解于去离子水中，使其浓度为2mg/ml，超声分散6h，并与制备的奥曲肽修饰的白桦脂酸脂质体1:2体积比混合孵育8h，即获得fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体。

采用mtt检测法，检测制备的双靶向纳米脂质体对sstrii超表达细胞a549的细胞毒性，如图7所示，可以看出，双靶向脂质体细胞毒性显著大于普通脂质体细胞毒性，当浓度为100mg/ml时，双靶向纳米载药脂质体细胞毒性高达85％，证明制备的fe3o4/奥曲肽修饰的双靶向纳米脂质体不仅可以提高药物对肿瘤细胞的细胞毒性，还可以提高普通载药脂质体的治疗效果。