一种多功能靶向分子及其用途的制作方法

本发明属药学领域，涉及一种多功能靶向分子及其用途，尤其是一种具有跨血-脑屏障、血-脑肿瘤屏障靶向肿瘤细胞的多功能靶向分子，及其修饰的复合物、递药系统及其在用于制备脑部肿瘤靶向诊断与治疗制剂中的用途。

背景技术：

资料显示，脑部肿瘤包括脑原发瘤和脑转移瘤。脑原发瘤和脑转移瘤在我国肿瘤患者群体中占了相当大的数量，且危害性极大；目前，脑原发瘤发病率和死亡率均处于我国肿瘤排行榜的前10位，其中脑胶质瘤占了脑原发瘤的45％左右，儿童发病率更甚，其患者的中位生存期小于16个月；脑外肿瘤的脑转移总发生率为10-20％，总量达到脑原发瘤数量的10倍左右，脑转移瘤患者的中位生存期一般不超过6个月。

临床实践显示，脑部肿瘤的药物治疗在脑部肿瘤综合治疗策略中至关重要，但尚存在诸多困难，主要表现在：①脑部肿瘤生长早期存在血-脑屏障(bbb)，使约98％小分子化疗药物和几乎100％蛋白类等大分子药物无法透过bbb进入脑内；②随着脑部肿瘤增大，bbb部分破坏，血-脑肿瘤屏障(bbtb)形成，其存在于脑部肿瘤组织与毛细血管之间，但通透性显著低于脑外肿瘤新生血管，只有小于12nm的荷正电物质才能透过；因此，化疗药物通过靶向递送提高脑部肿瘤的药物浓度成为目前关注的热点，特别是针对脑部肿瘤发展特点的多重靶向递送将更具有明显的优势。

研究显示，苯甲酰胺类似物是一类对多巴胺受体具有高亲和力的小分子化合物。近年来，以苯甲酰胺作为多巴胺受体的配体用于正电子发射断层扫描而进行的苯甲酰胺衍生物研制开展了大量的工作，这些衍生物均显示出很强的跨bbb能力。

整合素是一种重要的黏附分子，整合素αvβ3是整合素家族中的重要成员；作为内皮细胞与细胞外基质的桥梁，整合素αvβ3通过调节内皮细胞的黏附、迁移、增殖、凋亡等功能，在肿瘤血管生成、肿瘤生长及转移中发挥重要的作用；有研究公开了整合素αvβ3主要高表达于新生血管内皮细胞和绝大部分肿瘤细胞，包括神经胶质瘤、肺癌、胰腺癌和黑色素瘤等；rgd肽是含有精氨酸(r)-甘氨酸(g)-天冬氨酸(d)保守序列的多 肽，能与整合素αvβ3特异性结合，rgd肽与其特异性结合后，能增强肿瘤组织的摄取和肿瘤内化程度。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟针对脑部肿瘤治疗中存在的bbb和bbtb屏障问题，以及肿瘤细胞的靶向，提供一种由rgd肽与苯甲酰胺衍生物对羟基苯甲酸(pha)通过分子拼接形成的多功能靶向分子，并构建其靶向递药系统，实现对脑部肿瘤诊断或治疗药物靶向递送。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术存在的脑部肿瘤治疗中存在的bbb和bbtb屏障以及肿瘤细胞的靶向等问题，提供一种多功能靶向分子及其用途，尤其是一种具有跨血-脑屏障、血-脑肿瘤屏障靶向肿瘤细胞的多功能靶向分子，及其修饰的复合物、递药系统及其在用于制备脑部肿瘤靶向诊断与治疗制剂中的用途。

本发明提供了由rgd肽与苯甲酰胺衍生物对羟基苯甲酸(pha)通过分子拼接形成的多功能靶向分子rgd-pha分子，并构建其靶向递药系统，该多功能靶向分子可介导药物或纳米递药系统跨bbb，并且通过整合素受体途径介导药物或纳米递药系统跨bbtb，靶向脑肿瘤细胞，实现脑部肿瘤的靶向诊断和治疗。

本发明中，利用靶向分子中的pha与多巴胺受体的特异性结合介导跨越bbb，通过分子中的rgd肽与肿瘤新生血管上整合素的结合介导跨越bbtb，以及rgd肽与肿瘤细胞上整合素的结合，最终使药物高效地靶向脑肿瘤细胞，实现对脑部肿瘤诊断或治疗药物靶向递送。

本发明所述的rgd-pha，可利用分子中巯基与马来酰亚胺功能化荧光物质(如fluorescein、近红外染料cy5.5、ir820、dir等)反应而形成复合物。

本发明所述的rgd-pha修饰药物，包括通过马来酰亚胺己肼衍生物反应形成ph敏感腙键(涉及阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物)、或通过3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应形成二硫键(涉及紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱等含羟基或氨基的药物)、或通过多巴胺与药物中硼酸基团反应形成ph敏感硼酸脂(涉及药物硼替佐米等含硼酸基团的药物)，或通过固相合成直接形成酰胺键(涉及药物p53激活肽、抗菌肽、多肽毒素等多肽药物)的靶分子-药物复合物。

本发明所述的rgd-pha，可修饰在含马来酰亚胺功能基的聚乙二醇-磷脂、聚乙二醇-聚乳酸(peg-pla)、聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物(peg-plga)、聚乙二醇-聚己 内酯(peg-pcl)等高分子载体材料上，可用于rgd-pha修饰的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统的构建。

本发明所述的rgd-pha修饰的纳米递药系统可包载紫杉醇、多烯紫杉醇，阿霉素、表阿霉素，喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱，长春新碱，硼替唑米、卡非佐米，p53激活肽如pmi、spmi和^dpmi等，蜂毒肽，蝎毒肽等抗肿瘤药物；也可包载荧光物质，如fam、近红外染料cy5.5、ir820、dir、did等。

本发明所设计的rgd-pha修饰脂质体递药系统，脂质体载体系统的膜材料包括以下四种成分：a：天然磷脂或合成的磷脂，b：胆固醇，c：甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物(甲氧基聚乙二醇的分子量为1000～5000)，d：含rgd-pha的聚乙二醇-磷脂复合物(聚乙二醇的分子量为1000～8000)，各成分之间的摩尔比为a:b＝5:1～1:2，a:c＝1000:1～1000:100，a:d＝1000:1～1000:100；脂质体采用旋转蒸发-薄膜水化-挤压法制备。将一定比例的a、b、c和d溶于氯仿，采用旋转蒸发-薄膜水化法制备rgd-pha修饰的脂质体(rgd-pha-ls)，用挤压过膜的方法减小脂质体粒径，得到脂质体，其平均粒径为50～500nm。

本发明试验检测了脑毛细血管内皮细胞系(bend.3细胞)、脑胶质瘤细胞(u87细胞)和脐静脉内皮细胞(huvec)对rgd-pha-fam、rgd-pha-ls/fam、rgd/pha-ls(按rgd-pha-ls处方工艺，将rgd的聚乙二醇-磷脂复合物和pha的聚乙二醇-磷脂复合物混合制备的脂质体)的摄取情况，结果证明，rgd-pha-fam、rgd-pha-ls、rgd/pha-ls同时具有体外脑靶向能力、体外新生血管靶向能力和体外肿瘤靶向能力；其中，rgd/pha-ls是按rgd-pha-ls处方工艺，将rgd的聚乙二醇-磷脂复合物和pha的聚乙二醇-磷脂复合物混合制备的脂质体。

本发明构建了bbb体外模型并进行rgd-pha-ls/fam和rgd/pha-ls/fam转运通过bbb的能力试验，结果证明rgd-pha-ls和rgd/pha-ls均具有体外跨血-脑屏障的能力，但前者更好。

本发明构建了bbtb体外模型并考察rgd-pha-ls/fam和rgd/pha-ls/fam转运通过bbtb的能力，结果证明rgd-pha-ls和rgd/pha-ls均具有体外跨血-脑肿瘤屏障的能力，但前者更好。

本发明采用bbb和u87肿瘤球共培养模型考察rgd-pha-ls/fam和rgd/pha-ls/fam的肿瘤球摄取情况，结果证明rgd-pha-ls和rgd/pha-ls均具有跨体外血-脑屏障能力和体外脑肿瘤靶向能力，但前者更好。

本发明采用bbtb和u87肿瘤球共培养模型进行rgd-pha-ls/fam和rgd/pha-ls/fam的肿瘤球摄取试验，结果证明rgd-pha-ls和rgd/pha-ls均具有跨体外血-脑肿瘤屏障能力和体外脑肿瘤靶向能力，但前者更好。

本发明中，将载近红外染料dir的rgd-pha-ls和rgd/pha-ls经尾静脉注射于荷原位脑胶质瘤模型裸鼠体内，在活体成像仪下观测，结果证明rgd-pha-ls和rgd/pha-ls均具有体内脑肿瘤靶向性，但前者更好。

本发明中，施行荷原位脑胶质瘤模型裸鼠尾静脉注射rgd-pha-ls/dox和rgd/pha-ls/dox，以生存时间为指标评价体内抗肿瘤效果，结果证明rgd-pha-ls/dox和rgd/pha-ls/dox均具有显著的体内抗脑肿瘤能力，但前者更好。

本发明中，施行小鼠尾静脉注射rgd-pha-ls/dox，绘制药物动力学曲线，结果证明rgd-pha-ls载dox可改善rgd-ls/dox的体内循环时间，更有利于药物对脑肿瘤的靶向。

本发明提供了由rgd肽与苯甲酰胺衍生物对羟基苯甲酸(pha)通过分子拼接形成的多功能靶向分子rgd-pha分子，并构建其靶向递药系统，经实验，结果显示：所述的rgd-pha具有同时介导跨bbb和bbtb多重屏障膜的脑部肿瘤靶向递药作用，可用于药物分子和纳米递药系统的脑部肿瘤靶向诊断和治疗；本发明所涉及的rgd修饰聚合物材料和pha修饰聚合物材料混合制备的纳米递药系统，可用于脑部肿瘤靶向诊断和治疗。

附图说明

图1、c(rgdyk)-pha的hplc和esi-ms图谱，

其中采用色谱方法：色谱柱(ymc，c18)：150×4.6mm；流动相a：水(含0.1％三氟乙酸)，流动相b：乙腈(含0.1％三氟乙酸)；洗脱程序：5％b-65％b30分钟；流速：0.7毫升/分钟；柱温：30℃；检测：uv214nm。esi-ms：955.7道尔顿；与理论分子量相符。

图2、脑胶质瘤细胞u87、脑毛细血管内皮细胞bend.3细胞和脐静脉内皮细胞huvec对荧光素标记物的摄取，

其中，图a、d为荧光素标记物与u87细胞作用4小时后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果，显示了u87细胞对c(rgdyk)-pha-fam有明显的摄取，且摄取量高于c(rgdyk)-fam；图b、e为荧光素标记物与bend.3细胞作用4小时后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果，显示了bend.3细胞对c(rgdyk)-pha-fam有明显的摄取，且摄取量显著高于pha-fam；图c、f为荧光素标记物与huvec作用4小时后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果，显示了huvec对c(rgdyk)-pha-fam有明显的摄取，且摄取量高于c(rgdyk)-fam；表明c(rgdyk)-pha对u87、bend.3和huvec细胞同时具有良好的靶向作用。

图3、脑胶质瘤细胞u87、脑毛细血管内皮细胞bend.3细胞和脐静脉内皮细胞huvec对载荧光素脂质体的摄取，

其中，图a、d为载荧光素脂质体与u87细胞作用4小时后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果，图b、e为载荧光素脂质体与bend.3细胞作用4小时后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果，图c、f为载荧光素脂质体与huvec作用4小时后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果；图中显示了c(rgdyk)-pha-ls和c(rgdyk)/pha-ls均能同时被u87、bend.3和huvec细胞摄取，摄取效率c(rgdyk)-pha-ls高于c(rgdyk)/pha-ls。

图4、脂质体体外bbb、bbtb转运，

其中，图a、b分别为脂质体于不同时间点转运跨越体外血-脑屏障模型和血-脑肿瘤屏障模型的百分比，显示在30分钟、1、2和4小时，c(rgdyk)-pha-ls、pha-ls和c(rgdyk)/pha-ls转运通过体外bbb模型的量显著高于ls和c(rgdyk)-ls，且前三者的转运百分率无明显差别，说明分子中的pha可介导跨越血-脑屏障。c(rgdyk)-pha-ls、c(rgdyk)-ls和c(rgdyk)/pha-ls转运通过体外bbtb模型的量显著高于ls和pha-ls，且前三者的转运百分率无明显差别，表明通过分子中的c(rgdyk)可介导跨越血-脑肿瘤屏障。

图5、脂质体跨bbb、bbtb后u87三维肿瘤球摄取，

其中图a为脂质体跨bbb后u87肿瘤球的摄取，显示c(rgdyk)-pha-ls、c(rgdyk)/pha-ls组的肿瘤球有明显荧光，而其它各组几乎无荧光，且c(rgdyk)-pha-ls的荧光强度明显高于c(rgdyk)/pha-ls，对肿瘤球的穿透深度更优；图b为脂质体跨bbtb后u87肿瘤球的摄取，显示靶分子中含c(rgdyk)的脂质体组的 肿瘤球有明显荧光，ls和pha-ls几乎无荧光，且靶分子中含c(rgdyk)的脂质体组中c(rgdyk)-pha-ls的荧光强度最大且穿透最深。

图6、载荧光素脂质体的脑及其肿瘤内分布

其中，图a、b分别为荷原位脑胶质瘤裸鼠于肿瘤接种后第15天分别尾静脉注射包载dir脂质体于1、2和4小时的离体脑及脑肿瘤成像定量结果，显示了与其余各组脂质体相比，c(rgdyk)-pha-ls在脑肿瘤区域呈现最高分布；图c为脑肿瘤组织切片的免疫组化图片，显示了与活体成像一致，c(rgdyk)-pha-ls在脑肿瘤区域有更多的聚集。

图7、载阿霉素脂质体对u87细胞的体外药效，

图中显示，u87细胞分别与游离dox、ls/dox、pha-ls/dox、c(rgdyk)-ls/dox、c(rgdyk)/pha-ls/dox和c(rgdyk)-pha-ls/dox孵育72小时后，其ic50值分别为0.48、22.91、18.19、7.59、4.79和3.31μm；c(rgdyk)-pha-ls的体外抗肿瘤活性在脂质体组中最优。

图8、脑胶质瘤原位肿瘤模型裸鼠的生存曲线，

图中显示，生理盐水、游离dox、ls/dox、pha-ls/dox、c(rgdyk)-ls/dox、c(rgdyk)/pha-ls/dox和c(rgdyk)-pha-ls/dox组平均生存时间分别为20、23、26.5、28.5、30、35和36.5天，说明c(rgdyk)/pha-ls/dox和c(rgdyk)-pha-ls/dox均可显著延长脑胶质瘤原位肿瘤模型裸鼠的生存时间，而后者更好。

图9、载阿霉素脂质体的小鼠体内药物动力学曲线

图中显示，游离dox在体内消除很快，0.5小时即测不到血中的药物浓度，以脂质体包裹后显著延长了dox的体内循环时间；脂质体中含c(rgdyk)靶分子组的dox比其它组半衰期短，药物时间曲线下面积明显减小，是因单纯c(rgdyk)易在血中清除，连接pha后延长了其消除时间，故反映c(rgdyk)-pha修饰脂质体的药动学参数比c(rgdyk)修饰脂质体或c(rgdyk)/pha共修饰脂质体有所改善，这是c(rgdyk)-pha-ls具有更好的脑肿瘤靶向性与抗脑肿瘤药效的原因之一。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但本发明不局限于如下描述范围。

实施例1

rgd-pha、rgd-pha-fam、rgd-pha-药物、rgd-pha-peg-dspe的制备

1)rgd环肽-pha(c(rgdyk)-pha)的合成与表征

采用fmoc固相合成法，分别制备c(rgdyk)多肽和cys(trt)-acp-4-tert-butoxybenzoicacid，两者再缩合得c(rgdyk)-pha；

c(rgdyk)多肽合成过程为：将fmoc-gly-ctc树脂用20％哌啶的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液脱保护15分钟，两次，将fmoc保护氨基酸溶解在0.5m的hbtu和hobt(溶剂为dmf)中，加diea后加入树脂中，室温反应45分钟；反应后树脂以dmf洗涤，20％哌啶脱除fmoc保护，按照氨基酸序列依次进行相同反应；序列反应完成后，1％三氟乙酸(tfa)将多肽从树脂上切割下来，得侧链保护的多肽；在pybop催化下进行首尾缩合，然后于tfa切割液(tfa/h2o/tis＝95％:2.5％:2.5％)反应2小时，经制备型hplc纯化得c(rgdyk)；

cys(trt)-acp-4-tert-butoxybenzoicacid合成过程为：将fmoc-cys(trt)-ctc树脂用20％哌啶脱保护，依次接入fmoc保护氨基己酸(acp)、4-叔丁氧基苯甲酸(4-tert-butoxybenzoicacid)，方法同氨基酸缩合；1％tfa切割，纯化得cys(trt)-acp-4-tert-butoxybenzoicacid；

两片段缩合过程为：cys(trt)-acp-4-tert-butoxybenzoicacid溶于dmf，以dcc与nhs活化2小时，然后加入c(rgdyk)多肽(1.2倍过量)及微量diea，于室温反应过夜；经制备型hplc纯化，tfa切割液脱去保护基后得c(rgdyk)-pha；hplc和esi-ms表征纯度和分子量(mw)，结果如图1所示；

2)合成rgd线性肽-pha(^lrgd-pha)

采用boc固相合成法，直接制备^lrgd-pha；具体过程为：将boc-asp(ochx)-pam树脂用tfa脱保护1分钟(两次)，boc保护氨基酸以与fmoc氨基酸相同的反应接入树脂，缩合反应时间减少为30分钟；依次接入gly、arg、cys、acp与4-tert-butoxybenzoicacid。反应完成后，树脂用氟化氢切割，纯化得^lrgd-pha；

3)合成c(rgdyk)-pha-fam

通过c(rgdyk)-pha的巯基与荧光素的马来酰亚胺的加成反应，合成c(rgdyk)-ph-fam，具体为，将多肽c(rgdyk)-pha与马来酰亚胺荧光素(1.2倍过量)溶解于少量dmf中，加1％体积diea，反应2小时，制备液相纯化；

4)制备rgd-pha-药物复合物

以c(rgdyk)-pha-阿霉素复合物制备作为连接含酮或醛基药物：c(rgdyk)-pha溶于3ml磷酸盐缓冲液(0.1m，ph7.0)，加入10倍摩尔量的三(2-羧乙基)膦(tcep)， 于4℃搅拌20分钟，然后加入4倍摩尔量的阿霉素6-马来酰亚胺己肼衍生物，于室温避光反应1小时，反应液用制备型hplc纯化，得c(rgdyk)-pha-阿霉素复合物；

以c(rgdyk)-pha-紫杉醇复合物作为以二硫键连接药物：紫杉醇溶于10ml氯仿中，冷却至0-5℃，先后加入dcc及3-(2-吡啶二巯基)丙酸，加料完毕后，升至室温反应过夜；反应液过滤，经柱层析纯化(chcl3/meoh＝50:1～15:1，v/v洗脱)得紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物，紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物溶解在dmf中，1.5倍摩尔量的c(rgdyk)-pha溶解在pbs/dmf中，溶液ph值保持4～5，将紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物滴加至c(rgdyk)-pha溶液中，于室温反应6小时，经制备型hplc纯化得c(rgdyk)-pha-紫杉醇复合物；

以^lrgd-pha-硼替佐咪复合物作为以氨基修饰药物：依照^lrgd-pha的合成，树脂上接入氨基酸时，以boc-lys(fmoc)-oh替代原序列中cys，待序列完成后，用20％哌啶脱fmoc，加入含3倍摩尔量的丁二酸酐与diea的dmf溶液，于室温反应30分钟，洗涤树脂后，加入5倍摩尔量的三甲基氯硅烷保护多巴胺，并以hbtu/diea为缩合剂，于室温反应1小时，树脂用氟化氢切割，并经制备型hplc纯化得^lrgd-pha-多巴胺衍生物，在ph7.4的缓冲液中，多肽-多巴胺衍生物与硼替佐咪以摩尔比1:1混合即得^lrgd-pha-硼替佐咪复合物；

以^lrgd-pha-p53激活肽pmi复合物作为融合多肽药物：直接通过boc固相多肽合成法制得，具体过程为：依照^lrgd-pha的合成，boc-asp(ochx)-pam树脂上依次接入gly、arg、lys，以及pmi相应的氨基酸序列，序列完成后，用20％哌啶脱去lys上侧链的fmoc，再依次接入acp与4-tert-butoxybenzoicacid，反应完成后，树脂用氟化氢切割并纯化后即得^lrgd-pha-pmi融合多肽；

5)制备c(rgdyk)-pha-peg-dspe

将c(rgdyk)-pha溶于0.1m的pbs溶液中(ph7.2)，取mal-peg3400-dspe溶于dmf，两者混合后搅拌反应，hplc监测，待mal-peg-dspe反应完全后停止反应，过量的c(rgdyk)-pha和dmf透析(截留分子量3.5kda)除去，冷冻干燥得c(rgdyk)-pha-peg3400-dspe。

实施例2c(rgdyk)-pha的体外细胞靶向性验证

1)c(rgdyk)-pha-fam的体外靶向性

对脑胶质瘤细胞u87的体外靶向性：取对数生长期的单层培养的脑胶质瘤细胞(u87细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的dmem培养液配成单细胞悬液，以每孔1×10⁵个细胞接种于12孔培养板中，每孔体积1ml，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养，24小时后，用含10％胎牛血清的dmem培养液配制浓度为5μm的c(rgdyk)-pha-fam，并以fam、c(rgdyk)-fam及pha-fam溶液为对照，加至细胞培养板中，37℃孵育4小时，吸弃上清液，用pbs溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，dapi进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片如图2a所示，另用pbs洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图2b所示；

对脑毛细血管内皮细胞bend.3的体外靶向性：取对数生长期的单层培养的人脑毛细血管内皮细胞(bend.3细胞)，同上实验，激光共聚焦观察，细胞内化照片如图2c所示；流式细胞仪分析结果如图2d所示。

实施例3c(rgdyk)-pha-ls的体外靶向性验证

1)制备c(rgdyk)-pha-ls/fam

脂质体膜材料处方为hspc/chol/mpeg2000-dspe/c(rgdyk)-pha-peg3400-dspe(52:43:4:1，摩尔比)，称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均匀脂质膜，真空干燥24小时；加入5-fam水溶液水化，60℃水浴震荡2小时，得脂质体混悬液；在60℃水浴中，使用高压均质机(若脂质体体积少于10ml则改用微型挤出器)依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，使其粒径减小；然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶g-50柱分离除去未包封的药物，得到载fam的脂质体；

2)c(rgdyk)-pha-ls的体外靶向性验证

对u87细胞的体外靶向性：取对数生长期的u87细胞，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的dmem培养液配成单细胞悬液，以每孔1×10⁵个细胞接种于共聚焦皿或12孔培养板中，37℃，5％co2及饱和湿度条件下培养，24小时后，用含10％fbs的dmem培养液配制荧光浓度为5μm的c(rgdyk)-pha-ls/fam溶液，并以fam、ls/fam、c(rgdyk)-ls/fam、pha-ls/fam、c(rgdyk)/pha-ls/fam为对照，加入细胞培养板中，37℃孵育12小时，吸弃上清液，pbs溶液洗三次后甲醛固定，dapi染核，共聚焦显微镜观察，细胞内化照片见附图3a，用pbs洗板三次，进行流式细胞仪分析，结果如图3b所示；

对脑毛细血管内皮细胞bend.3的体外靶向性：取对数生长期的单层培养的人脑毛细血管内皮细胞(bend.3细胞)，同上实验，共聚焦显微镜观察，细胞内化照片如图3c所示；流式细胞仪分析结果如图3d所示；

3)c(rgdyk)-pha-ls跨体外屏障膜能力考察

跨体外血-脑屏障(bbb)能力：4周龄sd大鼠常规处理后取脑，于冰冷的d-hanks溶液中迅速分离得到大脑皮层，除去脑膜和脑部大血管后剪碎，加入胶原酶和dna酶37℃消化90分钟后，1000转/分钟离心8分钟，弃去上清，转移至20％的bsa中，1000转/分钟4℃离心20分钟，弃去中上层液体，将底部微血管转移至培液中，1000转/分钟离心5分钟，用含20％胎牛血清的dmem培养液配成微血管段悬液，接种于预先铺有鼠尾胶原的24孔transwell中；将transwell移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养24小时后，换成含有嘌呤霉素的内皮专用培养液继续培养72小时，再换成含有细胞生长因子的内皮专用培养液培养72小时，测得电阻超过200ω·cm²，即体外bbb模型成功建立；

用含10％fbs的dmem培养液配制荧光浓度为30μm的c(rgdyk)-pha-ls/fam溶液，并以ls/fam、c(rgdyk)-ls/fam、pha-ls/fam、c(rgdyk)/pha-ls/fam为对照，加入transwell上室，分别于30分钟，1、2和4小时取下室培养液测其荧光浓度，bbb转运结果如图4a所示；

跨体外血-脑肿瘤屏障(bbtb)能力：将脐静脉内皮细胞huvec和u87按照1:5的比例分别铺于transwell的上、下室，培养72小时后，同上实验；bbtb转运结果如图4b所示；

4)c(rgdyk)-pha-ls的体外脑肿瘤靶向性验证

将2％的低分子琼脂糖溶液趁热加入48孔板中，每孔150μl，室温放置冷却凝固后，每孔接种400μlu87细胞悬液，细胞密度为2×10³个/孔，置二氧化碳培养箱中，37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养7天即形成肿瘤球，将u87肿瘤球转移至bbb或bbtb模型的transwell下室培养，得bbb/u87肿瘤球或bbtb/u87肿瘤球共培养模型；

用含10％fbs的dmem培养液配制荧光浓度为30μm的c(rgdyk)-pha-ls/fam溶液，并以ls/fam、c(rgdyk)-ls/fam、pha-ls/fam、c(rgdyk)/pha-ls/fam为对照，加入transwell上室，于37℃孵育4小时后，取下室的肿瘤球用pbs溶液洗三次，用甲醛固定，置于荧光显微镜下观察，结果图5所示。

实施列4c(rgdyk)-pha-ls体内肿瘤靶向性验证

1)制备c(rgdyk)-pha-ls/dir

脂质体膜材料处方同上，将上述膜材料及dir溶于氯仿，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均匀脂质膜，真空干燥24小时。加入生理盐水溶液水化，60℃水浴震荡2小时，得脂质体混悬液，在60℃水浴中，使用高压均质机(若脂质体体积少于10ml则改用微型挤出器)依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，使其粒径减小，然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶g-50柱分离除去未包封的dir，得脂质体；

2)c(rgdyk)-pha-ls/dir的体内靶向性验证

原位脑胶质瘤模型鼠的建立：取对数生长期的u87细胞，每只裸小鼠接种5×10⁵个细胞(分散于5μlpbs缓冲液中)，裸小鼠麻醉后，用脑立体定位仪固定，细胞接种于纹状体右部(前囟前0.6mm，侧1.8mm，深3mm)。定期观察裸小鼠状态；

裸鼠接种肿瘤细胞第15天，尾静脉分别注射ls/dir、c(rgdyk)-ls/dir、pha-ls/dir、c(rgdyk)/pha-ls/dir和c(rgdyk)-pha-ls/dir，于注射后1、2、4、12小时处死裸鼠，生理盐水心脏灌流，4％多聚甲醛固定，取荷瘤脑组织及分离的脑肿瘤组织于活体成像仪成像结果如图6a，6b所示；

裸鼠接种肿瘤细胞第15天，尾静脉分别注射ls/dir、c(rgdyk)-ls/dir、pha/dir、c(rgdyk)/pha-ls/dir和c(rgdyk)-pha-ls/dir，于注射后4小时处死裸鼠，生理盐水心脏灌流，4％多聚甲醛固定，取脑组织冷冻切片，以dapi染核，抗-cd31抗体染微血管，共聚焦显微镜观察，结果如图6c所示。

实施例5载阿霉素的c(rgdyk)-pha-ls体外药效学试验

脂质体膜材料处方同上，采用硫酸铵梯度法制备包载阿霉素(dox)的脂质体；采用mtt法分别检测游离dox、ls/dox、c(rgdyk)-ls/dox、pha-ls/dox、c(rgdyk)/pha-ls/dox和c(rgdyk)-pha-ls/dox对u87肿瘤细胞的体外生长抑制作用，取对数生长期的u87细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，细胞悬浮在含10％fbs的dmem培养液中，计数，以每孔3000个细胞的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔体积0.2ml，留出三孔加不含细胞的培养液作为空白孔，二氧化碳培养箱内培养24小时，用细胞培养液将各给药样品依次四倍稀释，吸去96孔板内细胞培液，各孔加入200μl一系列浓度的药液，每个浓度均设三复孔，留出三个仅加入培养液的孔作为对照孔，培养72小时，在实验孔、对照孔和空白孔中加入mtt试剂(5mg/ml)20μl孵育 4小时，弃去孔内培养液，每孔加入二甲亚砜150μl，振荡使生成的蓝紫色结晶充分溶解后，用酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度(a)，按照以下公式计算细胞存活率：

存活率＝(a490实验孔-a490空白孔)/(a490对照孔-a490空白孔)×100％

用graphpadprism软件将存活率对药物浓度对数值做图(如图7所示)，计算半数抑制浓度(ic50)。

实施例6载阿霉素的c(rgdyk)-pha-ls体内药效学试验

荷原位脑胶质瘤模型裸鼠尾静脉分别注射生理盐水、游离dox、ls/dox、c(rgdyk)-ls/dox、pha-ls/dox、c(rgdyk)/pha-ls/dox和c(rgdyk)-pha-ls/dox，给药总剂量为10mg/kg(阿霉素)，分别在肿瘤种植后第7、9、11、13和15天给药，记录裸鼠的生存时间，裸鼠生存曲线如图8所示。

实施例7载阿霉素的c(rgdyk)-pha–ls的药物动力学试验

小鼠尾静脉分别注射游离dox、ls/dox、c(rgdyk)-ls/dox、pha-ls/dox、c(rgdyk)/pha-ls/dox和c(rgdyk)-pha-ls/dox，给药剂量2mg/kg(阿霉素)，于时间点(15、30和60分钟，2、4、6、8、12和24小时)眼眶取血，血样于3000转/分钟离心10分钟，上清中加入内参(多柔比星)，然后加入4倍体积氯仿和1倍体积甲醇，于3000转/分钟离心15分钟；取上清液，hplc分析，绘制药物浓度-时间曲线(如图9所示)。