一种由枸杞子和大枣制成的保健品及其制法与检测方法与流程

本发明属于医药领域，涉及一种由枸杞子和大枣制成的保健品及其制法与检测方法。

背景技术：

枸杞子，系茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium L.)落叶灌木，是起源较古老的植物之一，日本学者Fukuda研究枸杞属植物叶绿体的DNA分子系统进化，认为枸杞属物种起源年代应该在29.4±9.7万年。枸杞还是一个世界性分布的物种，该属植物在全球呈离散性分布，约有80种，其中欧亚大陆约有10种，中亚种类较多，非洲南部20余种，北美洲南部20余种，南美洲南部分布多达30余种。中国自然分布枸杞属植物共有7个种、3个变种。现代科学研究发现枸杞中化学成分类型多样，主要涉及生物碱类，黄酮类，萜类等化合物，此外，多糖及类胡萝卜素衍生物也是枸杞中常见的成分。现代药理研究发现枸杞子具有多种活性，包括抗氧化、抗肿瘤、抗炎、肝保护、神经保护、抗微生物及辐射保护活性等。枸杞子的药用价值目前还未得到充分应用。不论是药用枸杞子品种的确定，还是枸杞子主要成分的分析，均需要更深入的研究。同时，目前枸杞子的加工产业仅停留在初级阶段，出口产品主要是枸杞子干果、鲜汁和枸杞粉等，但枸杞子深加工产品种类较少。

大枣，系鼠李科枣属植物枣Ziziphus jujuba Mill.var.inermis(Bunge)Rehd.的果实，最早记载于《五十二病方》，在《神农本草经》列为上品，历代诸多本草皆有阐述，其味甘平，性温，归心、脾、胃经，具补中益气，养血安神之功，因其助十二经而和百药，故在中医临床遣方用药中属中高频使用的常用中药。我国是大枣资源最丰富的国家，现有大枣品种704个，化学成分复杂，含有90余种成分。且药理活性广泛，具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、修复肝损伤、抗疲劳等作用，对造血功能以及肠道运动等也有改善作用。近年来得以广泛的研究和利用，现有开发药品、保健品、食品等120余种。

枸杞子和大枣配伍使用，目前也有很多研究，并形成了不少的产品，曲永鑫将山楂、大枣、枸杞、菊花制成复合保健饮料；陈万更等将茶叶、枸杞、大枣、进行发酵，制成酒茶；梁治军等将怀山药、大枣、山楂、枸杞制成复合保健饮料；刘庆君等将大枣、枸杞、大豆制成复合饮料；路红波等将枸杞、大枣等制成营养保健鱼饼；王君高等将大枣、枸杞制成保健米酒；杜朝等将银耳、大枣汁、枸杞果粒制成复合悬浮养生饮料；王立江等将将红豆、大枣、枸杞制成复合酸乳饮料；魏鹏等将大枣、枸杞制成保健果酒；顾雨香等将大枣、枸杞、蜂蜜制成果冻；王晓华等采用响应面法将大枣、枸杞制成复合饮料的生产工艺进行了优化研究。

从现有的研究和产品可见，枸杞子和大枣配伍使用，并不少见，并形成了一定的产品，但这些产品仅仅停留在非常粗放式的饮料、果酒、保健茶等产品，对于将枸杞子、大枣进行精细加工，产生高附加值的产品，还非常少见，与此同时，枸杞子、大枣配伍的使用的药用价值也远远没有开发出来。

甘肃中医药大学作为甘肃省、乃至国家对枸杞子的重点研究单位，其科研人员对枸杞子进行了很多年的研究工作，本申请的发明人同时还是甘肃省自然科学基金项目——甘肃产枸杞子的质量评价(编号：148RJZA059)的项目组成员，对枸杞子，以及枸杞子、大枣的配伍进行了深入的研究工作。

技术实现要素：

本发明的目的提供一种有效的辅助治疗股骨头坏死的保健品。

本发明的另一目的是提供该辅助治疗股骨头坏死的保健品的制备方法。

本发明还有一个目的是提供该辅助治疗股骨头坏死的保健品的检测方法。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种辅助治疗股骨头坏死的保健品，该保健品由以下重量份的药味原料制成：枸杞子1～5重量份、大枣1～5重量份。

所述的辅助治疗股骨头坏死的保健品，作为优选，该保健品由以下重量份的药味原料制成：枸杞子3重量份、大枣2重量份。

所述的辅助治疗股骨头坏死的保健品，其特征在于该保健品与药学可接受的辅料制成注射剂。

所述的辅助治疗股骨头坏死的保健品，该保健品的制备方法为：

(1)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，加5～15倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次2～4h，第2次1～3h，第3次0.5～1.5h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至8～10，冷藏，静置12～36h，滤过，滤液挥去乙醇，加入1～3倍量的乙醚，冷藏，静置12～36h，滤过，滤液挥去乙醚，溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液I；

(2)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，置药材于渗漉缸中，以4～12倍量50％乙醇浸渍36～60h，收集初漉液，再用4～12倍量65％乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80％、90％，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为3～5，冷藏，静置12～36h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95％，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为3～5，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为6～8，得提取液Ⅱ；

(3)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，加入5～10倍量的水，煎煮提取3次，每次0.5～2h，合并提取液，提取液浓缩成浸膏；将上述浸膏经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积2～10倍量的pH 1～5的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积2～10倍量的70％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用碱液调节pH至10～11，在60～80℃下加热1～2h，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用5～10倍的乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，然后在70～80℃下蒸馏，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)将以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为6～8，加1％针用活性炭于溶液中煮沸5～15min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的口服液用流通蒸汽灭菌0.5～1h，稍冷后灯检，即得。

所述的辅助治疗股骨头坏死的保健品，作为优选，该保健品的制备方法为：

(1)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液I；

(2)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，置药材于渗漉缸中，以8倍量50％乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65％乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80％、90％，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95％，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；

(3)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，加入7倍量的水，煎煮提取3次，每次1h，合并提取液，提取液浓缩成浸膏；将上述浸膏经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积8倍量的pH 4的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积8倍量的70％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用碱液调节pH至11，在70℃下加热1.5h，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用8倍的乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，然后在75℃下蒸馏，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)将以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1％针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的口服液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得。

一种辅助治疗股骨头坏死的保健品的制备方法，该保健品由以下重量份的药味原料制成：枸杞子1～5重量份、大枣1～5重量份，其特征在于，该保健品的制备方法为：

(1)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，加5～15倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次2～4h，第2次1～3h，第3次0.5～1.5h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至8～10，冷藏，静置12～36h，滤过，滤液挥去乙醇，加入1～3倍量的乙醚，冷藏，静置12～36h，滤过，滤液挥去乙醚，溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液I；

(2)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，置药材于渗漉缸中，以4～12倍量50％乙醇浸渍36～60h，收集初漉液，再用4～12倍量65％乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80％、90％，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为3～5，冷藏，静置12～36h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95％，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为3～5，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为6～8，得提取液Ⅱ；

(3)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，加入5～10倍量的水，煎煮提取3次，每次0.5～2h，合并提取液，提取液浓缩成浸膏；将上述浸膏经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积2～10倍量的pH 1～5的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积2～10倍量的70％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用碱液调节pH至10～11，在60～80℃下加热1～2h，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用5～10倍的乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，然后在70～80℃下蒸馏，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)将以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为6～8，加1％针用活性炭于溶液中煮沸5～15min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的口服液用流通蒸汽灭菌0.5～1h，稍冷后灯检，即得。

所述的辅助治疗股骨头坏死的保健品的制备方法，作为优选，该保健品由以下重量份的药味原料制成：枸杞子3重量份、大枣2重量份，该保健品的制备方法为：

(1)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液I；

(2)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，置药材于渗漉缸中，以8倍量50％乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65％乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80％、90％，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95％，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；

(3)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，加入7倍量的水，煎煮提取3次，每次1h，合并提取液，提取液浓缩成浸膏；将上述浸膏经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积8倍量的pH 4的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积8倍量的70％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用碱液调节pH至11，在70℃下加热1.5h，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用8倍的乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，然后在75℃下蒸馏，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)将以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1％针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的口服液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得。

一种辅助治疗股骨头坏死的保健品的检测方法，该保健品由以下重量份的药味原料制成：枸杞子1～5重量份、大枣1～5重量份，该保健品的制备方法为：

(1)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，加5～15倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次2～4h，第2次1～3h，第3次0.5～1.5h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至8～10，冷藏，静置12～36h，滤过，滤液挥去乙醇，加入1～3倍量的乙醚，冷藏，静置12～36h，滤过，滤液挥去乙醚，溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液I；

(2)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，置药材于渗漉缸中，以4～12倍量50％乙醇浸渍36～60h，收集初漉液，再用4～12倍量65％乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80％、90％，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为3～5，冷藏，静置12～36h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95％，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为3～5，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为6～8，得提取液Ⅱ；

(3)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，加入5～10倍量的水，煎煮提取3次，每次0.5～2h，合并提取液，提取液浓缩成浸膏；将上述浸膏经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积2～10倍量的pH 1～5的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积2～10倍量的70％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用碱液调节pH至10～11，在60～80℃下加热1～2h，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用5～10倍的乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，然后在70～80℃下蒸馏，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)将以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为6～8，加1％针用活性炭于溶液中煮沸5～15min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的口服液用流通蒸汽灭菌0.5～1h，稍冷后灯检，即得；

采用HPLC法同时测定锦葵花素、大枣苷两种成分的含量：

(1)色谱条件：色谱柱：C₁₈柱，流动相：甲醇-乙腈-0.25％磷酸溶液，梯度洗脱：从0min到15min，甲醇从5.0％线性上升到20.0％，乙腈从5.0％线性上升到20.0％，0.25％磷酸溶液从90.0％线性下降至60.0％；从16min到30min，甲醇从20.0％线性上升到50.0％，乙腈从20.0％线性增上升到35.0％，0.25％磷酸溶液从60.0％线性下降至15.0％；从31min到40min，甲醇从50.0％线性下降到30.0％，乙腈从35.0％线性下降到25.0％，0.25％磷酸溶液从15.0％线性上升至45.0％；流速：0.5～2.0mL/min；检测波长：0至15min，检测波长为250～270nm，16至40min，检测波长为390～410nm；柱温：20～40℃；进样量：2～20μL；

(2)混合对照品溶液的制备：精密称取锦葵花素和大枣苷对照品，分别加25％甲醇溶解并稀释制成锦葵花素和大枣苷的单一成分对照品贮备液；精密量取两种对照品贮备液，用25％甲醇稀释制成混合对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：精密量取本口服液样品，加25％甲醇溶解并稀释用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(4)测定：精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各2～10μL，注入高效液相色谱仪进行测定。

所述的辅助治疗股骨头坏死的保健品的检测方法，作为优选，该保健品由以下重量份的药味原料制成：枸杞子3重量份、大枣2重量份，该保健品的制备方法为：

(1)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液I；

(2)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，置药材于渗漉缸中，以8倍量50％乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65％乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80％、90％，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95％，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；

(3)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，加入7倍量的水，煎煮提取3次，每次1h，合并提取液，提取液浓缩成浸膏；将上述浸膏经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积8倍量的pH 4的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积8倍量的70％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用碱液调节pH至11，在70℃下加热1.5h，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用8倍的乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，然后在75℃下蒸馏，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)将以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1％针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的口服液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得；

采用HPLC法同时测定锦葵花素、大枣苷两种成分的含量：

(1)色谱条件：色谱柱：C₁₈柱，流动相：甲醇-乙腈-0.25％磷酸溶液，梯度洗脱：从0min到15min，甲醇从5.0％线性上升到20.0％，乙腈从5.0％线性上升到20.0％，0.25％磷酸溶液从90.0％线性下降至60.0％；从16min到30min，甲醇从20.0％线性上升到50.0％，乙腈从20.0％线性增上升到35.0％，0.25％磷酸溶液从60.0％线性下降至15.0％；从31min到40min，甲醇从50.0％线性下降到30.0％，乙腈从35.0％线性下降到25.0％，0.25％磷酸溶液从15.0％线性上升至45.0％；流速：1.2mL/min；检测波长：0至15min，检测波长为258nm，16至40min，检测波长为405nm；柱温：30℃；进样量：10μL；

(2)混合对照品溶液的制备：精密称取锦葵花素和大枣苷对照品，分别加25％甲醇溶解并稀释制成锦葵花素和大枣苷的质量浓度均为1.0000mg/mL的单一成分对照品贮备液；精密量取两种对照品贮备液，用25％甲醇稀释制成锦葵花素与大枣苷质量浓度均为0.4000mg/mL的溶液，即得混合对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：精密量取本口服液样品1mL，置于10mL量瓶中，加25％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(4)测定：精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪进行测定。

一种保健品在制备辅助治疗股骨头坏死保健品中的应用，该保健品由以下重量份的药味原料制成：枸杞子3重量份、大枣2重量份，该保健品的制备方法为：

(1)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液I；

(2)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，置药材于渗漉缸中，以8倍量50％乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65％乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80％、90％，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95％，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；

(3)取1/3处方量的枸杞子、取1/3处方量的大枣，加入7倍量的水，煎煮提取3次，每次1h，合并提取液，提取液浓缩成浸膏；将上述浸膏经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积8倍量的pH 4的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积8倍量的70％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用碱液调节pH至11，在70℃下加热1.5h，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用8倍的乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，然后在75℃下蒸馏，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)将以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1％针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的口服液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得；

采用HPLC法同时测定锦葵花素、大枣苷两种成分的含量：

(1)色谱条件：色谱柱：C₁₈柱，流动相：甲醇-乙腈-0.25％磷酸溶液，梯度洗脱：从0min到15min，甲醇从5.0％线性上升到20.0％，乙腈从5.0％线性上升到20.0％，0.25％磷酸溶液从90.0％线性下降至60.0％；从16min到30min，甲醇从20.0％线性上升到50.0％，乙腈从20.0％线性增上升到35.0％，0.25％磷酸溶液从60.0％线性下降至15.0％；从31min到40min，甲醇从50.0％线性下降到30.0％，乙腈从35.0％线性下降到25.0％，0.25％磷酸溶液从15.0％线性上升至45.0％；流速：1.2mL/min；检测波长：0至15min，检测波长为258nm，16至40min，检测波长为405nm；柱温：30℃；进样量：10μL；

(2)混合对照品溶液的制备：精密称取锦葵花素和大枣苷对照品，分别加25％甲醇溶解并稀释制成锦葵花素和大枣苷的质量浓度均为1.0000mg/mL的单一成分对照品贮备液；精密量取两种对照品贮备液，用25％甲醇稀释制成锦葵花素与大枣苷质量浓度均为0.4000mg/mL的溶液，即得混合对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：精密量取本口服液样品1mL，置于10mL量瓶中，加25％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(4)测定：精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪进行测定。

本发明提供以下实验研究资料，用以充分公开本发明的技术方案以及本发明的技术效果。

实验一：对辅助治疗实验性股骨头坏死的处方与活性部位的药效学筛选研究

1材料与方法

1.1材料：

1.1.1动物：Wistar大鼠乳鼠，60只，日龄10d，甘肃中医药大学动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK(甘)2011-0001-0001011；实验设施合格证号：SYXK(甘)2011-0001-0000314；饲养于甘肃中医药大学动物实验中心，动物饲养于标准条件下，12h明暗交替，(22±2)℃，自由摄食饮水。动物在上述环境中适应性饲养1周后开始实验。

1.1.2试剂：醋酸泼尼松龙注射液，由华中药业股份有限公司生产。

1.1.3仪器：双能X线骨密度仪，由上海爱申科技发展股份有限公司生产；微循环显微观察系统，由郑州天益健生物科技有限公司生产；MTS生物材料试验机，由济南美特斯测试技术有限公司生产。

1.1.4受试品：

1.1.4.1血塞通注射液：由西安汉丰药业有限责任公司生产，规格：2ml:100mg，批准文号：国药准字Z61021575。

1.1.4.2甲保健品口服液：

处方：枸杞子300.0g、大枣200.0g。

制备方法：(1)取100.0g枸杞子、取66.6g大枣，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液I；

(2)取100.0g枸杞子、取66.6g大枣，置药材于渗漉缸中，以8倍量50％乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65％乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80％、90％，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95％，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；

(3)取100.0g枸杞子、取66.6g大枣，加入7倍量的水，煎煮提取3次，每次1h，合并提取液，提取液浓缩成浸膏；将上述浸膏经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积8倍量的pH 4的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积8倍量的70％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用碱液调节pH至11，在70℃下加热1.5h，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用8倍的乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，然后在75℃下蒸馏，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)将以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水至1000mL，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1％针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的口服液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得。

1.1.4.3乙保健品口服液：

处方：枸杞子300.0g、大枣200.0g。

制备方法：取干燥的枸杞子300.0g、大枣200.0g，混合，粉碎成粗粉，加入8倍重量比的70％乙醇浸渍50h，再用70％乙醇作溶剂缓慢渗滤至滤液呈微黄色，滤液在70℃下减压浓缩得相对密度为1.25的稠膏；再加12倍水充分搅拌并静置24h使油水分离，去除沉淀物和油脂，收集水层药液，加入药用活性炭静置2h吸附药液至无色，上聚酰胺色谱柱，用水饱和正丁醇洗脱，洗脱液在70℃下减压浓缩后加入10倍重量的95％乙醇进行二次乙醇提取，乙醇提液在6℃冷藏24h后过滤，滤液经减压浓缩后，再加入10倍重量份的水进行水提，经冷藏后24h，4℃离心过滤得水提液，水提液用0.3％重量比的活性炭脱色，边加边搅拌，并加热至40℃后静止1h；经膜过滤器过滤，超滤后在40℃下减压浓缩，得提取物稠膏；将提取物稠膏、药用聚乙二醇、甘露醇和医用氯化钠混合，用注射用水稀释，滤过，灌封、灭菌、灯检、包装，即得乙保健品口服液。

1.1.4.4丙保健品口服液：

处方：枸杞子300.0g、大枣200.0g。

制备方法：取干燥的枸杞子300.0g、大枣200.0g，混合，粉碎成粗粉，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取得到水蒸气蒸馏提取物，备用；取水蒸气蒸馏提取后的药渣，加入8倍重量比的70％乙醇浸渍50h，再用70％乙醇作溶剂缓慢渗滤至滤液呈微黄色，滤液在70℃下减压浓缩得相对密度为1.25的提取物稠膏；将提取物稠膏、水蒸气蒸馏提取物、药用聚乙二醇、甘露醇和医用氯化钠混合，用注射用水稀释，滤过，灌封、灭菌、灯检、包装，即得丙保健品口服液。

1.1.4.5丁保健品口服液：

处方：枸杞子300.0g、大枣200.0g。

制备方法：取干燥的枸杞子300.0g、大枣200.0g，混合，粉碎成粗粉，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取得到水蒸气蒸馏提取物，备用；取水蒸气蒸馏提取后的药渣，加入8倍重量比的70％乙醇浸渍50h，再用70％乙醇作溶剂缓慢渗滤至滤液呈微黄色，滤液在70℃下减压浓缩得相对密度为1.25的稠膏；再加12倍水充分搅拌并静置24h使油水分离，去除沉淀物和油脂，收集水层药液，加入药用活性炭静置2h吸附药液至无色，药液经膜过滤器过滤，超滤后在40℃下减压浓缩，得提取物稠膏；将提取物稠膏、水蒸气蒸馏提取物、药用聚乙二醇、甘露醇和医用氯化钠混合，用注射用水稀释，滤过，灌封、灭菌、灯检、包装，即得丁保健品口服液。

1.2方法：

(1)分组与给药：动物分成：正常对照组、模型对照组、血塞通注射液组、甲保健品口服液组、乙保健品口服液组、丙保健品口服液组、丁保健品口服液组，共7个组，每组10只动物。正常对照组乳鼠不作任何处理。模型对照组乳鼠出生10d乳鼠肘关节以上剪除左前肢。自尾根部剪除尾部，烧灼止血后放回笼中，继续由母鼠喂养。1个月后，开始灌服醋酸泼尼松，20mg/kg体重，隔日1次，共30d。甲保健品口服液组、乙保健品口服液组、丙保健品口服液组、丁保健品口服液组、血塞口服液给药组：在大鼠灌服醋酸泼尼松同时每天口服灌胃给药一次，共30d。

(2)检测指标：股骨骨密度，股骨强度、钢性，股骨湿重、干重、灰重，股骨头毛细血管分布观察，股骨头骨组织内脂肪沉积观察。

1.3统计学处理：

各组结果以均数±标准差表示。选择Student检验进行各组间算术平均数的差异显著性检验。

2结果

2.1甲保健品口服液组的股骨BMD、BMC、骨强度、骨钢性、AREA含量明显高于模型对照组，也高于乙保健品口服液组、丙保健品口服液组、丁保健品口服液组(P<0.01，表1)。

2.2甲保健品口服液组的股骨湿重明显高于模型对照组，也高于乙保健品口服液组、丙保健品口服液组、丁保健品口服液组，甲保健品口服液还可以明显降低软骨和骨细胞脂肪着色率，明显高于模型对照，也高于乙保健品口服液、丙保健品口服液、丁保健品口服液(P<0.05，表2)。

2.3模型动物的股骨头内毛细血管明显稀疏，排列紊乱，单位面积内毛细血管所占比例明显下降。甲保健品口服液辅助治疗组股骨头内毛细血管接近恢复正常水平股骨头内密布毛细血管，排列也较规律。

表1对大鼠股骨骨密度、骨矿、骨面积、骨强度和骨钢性的影响(n＝10)

注：与模型对照组比较，*P<0.05，#P<0.01；与正常对照组比较，△P<0.01；与血塞通组比较，☆P<0.05，▲P<0.01

表2对大鼠股骨重量、软骨和骨细胞脂肪着色率的影响(n＝10)

注：与模型对照组比较，*P<0.05，#P<0.01；与正常对照组比较，△P<0.01；与血塞通注射液组比较，☆P<0.05，▲P<0.01

3讨论与结论

本研究结果表明，甲保健品口服液活血化瘀用于辅助治疗股骨头坏死有较好的辅助治疗作用，能增加股骨骨密度，骨矿度，骨重量，骨强度，骨钢性，改善股骨上毛细血管紊乱，降低股骨骨细胞内脂肪着色率。同时，甲保健品口服液辅助治疗股骨头坏死作用优于乙保健品口服液、丙保健品口服液、丁保健品口服液，提示甲保健品口服液的组方及制备工艺具有明显优势，在特定的组方和特定的制备方法下，具有特别突出的、预想不到的、有益的技术效果。

实验二：采用高效液相色谱法对本发明口服液中锦葵花素、大枣苷的含量测定方法研究

1材料

1.1仪器

1200系列HPLC仪，含1200LC型色谱工作站、G1322A型溶剂脱气机、G1311A型四元泵、G1329A(ALS)型自动进样器、G1314BVWD型紫外检测器(由美国Agilent公司生产)；CP225D型电子天平(由深圳市新朗普电子科技有限公司生产)；HT-230A型柱温箱(由北京绿百草科技发展有限公司生产)。

1.2药品与试剂

本发明口服液：

处方：枸杞子300.0g、大枣200.0g。

制备方法：(1)取100.0g枸杞子、取66.6g大枣，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液I；

(2)取100.0g枸杞子、取66.6g大枣，置药材于渗漉缸中，以8倍量50％乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65％乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80％、90％，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95％，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；

(3)取100.0g枸杞子、取66.6g大枣，加入7倍量的水，煎煮提取3次，每次1h，合并提取液，提取液浓缩成浸膏；将上述浸膏经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积8倍量的pH 4的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积8倍量的70％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用碱液调节pH至11，在70℃下加热1.5h，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用8倍的乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，然后在75℃下蒸馏，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)将以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水至1000mL，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1％针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的口服液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得。

锦葵花素、大枣苷对照品(由上海纯优生物科技有限公司生产)；

流动相用甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：C₁₈柱，规格：250mm×4.6mm，5μm；流动相：甲醇(A)-乙腈(B)-0.25％磷酸溶液(C)，梯度洗脱(洗脱程序见表7)；流速：1.2mL/min；检测波长：0至15min，检测波长为258nm，16至40min，检测波长为405nm；柱温：30℃；进样量：10μL。

表3流动相梯度洗脱程序

2.2混合对照品溶液的制备

精密称取锦葵花素和大枣苷对照品各适量，分别加25％甲醇溶解并稀释制成锦葵花素和大枣苷的质量浓度均为1.0000mg/mL的单一成分对照品贮备液；精密量取两种对照品贮备液，用25％甲醇稀释制成锦葵花素与大枣苷质量浓度均为0.4000mg/mL的溶液，即得混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备

精密量取本品1mL，置于10mL量瓶中，加25％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4线性关系考察

取“2.2”项下混合对照品溶液适量，加25％甲醇按倍比稀释法制成系列质量浓度的溶液。按上述色谱条件各进样10μL测定，记录峰面积。以对照品质量浓度(c)为横坐标，峰面积积分值(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得锦葵花素、大枣苷的回归方程分别为：

A＝35.652C+13.268(r＝0.9998)

A＝33.265C+20.361(r＝0.9997)

结果表明，锦葵花素和大枣苷的质量浓度分别在1.195～68.235、2.235～75.625μg/mL范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.5系统适用性试验

分别取混合对照品溶液、供试品溶液各适量，按上述色谱条件注入HPLC仪，记录色谱图，见附图1和附图2。结果发现，在该色谱条件下，锦葵花素和大枣苷与相邻组分峰的分离度均＞1.5，理论板数按锦葵花素峰计算应不低于2500。

2.6精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10μL，按上述色谱条件进样测定，重复6次，记录峰面积。结果显示，锦葵花素和大枣苷的RSD分别为0.06％、0.04％(n均为6)，表明仪器精密度良好。

2.7重复性试验

精密量取同一批样品(批号：1500305)1mL，共6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样测定10μL，记录峰面积。结果显示，锦葵花素和大枣苷的RSD分别为0.18％、0.13％(n均为6)，表明本方法重复性良好。

2.8稳定性试验

取同一供试品溶液(批号：150326)适量，分别于0、1、2、4、6、8、10、12h时按上述色谱条件进样10μL测定，记录峰面积。结果显示，锦葵花素和大枣苷的RSD分别为0.38％、0.32％(n均为6)，表明供试品溶液在12h内稳定。

2.9加样回收率试验

精密量取已测定锦葵花素和大枣苷含量的红花口服液(批号：150411)6份，各0.5mL，每2份为一组，分别按低、中、高质量浓度精密加入锦葵花素和大枣苷对照品贮备液各适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按拟定方法进样测定，计算加样回收率，结果见表4。

表4加样回收率试验结果(n＝9)

2.10样品含量测定

取不同批号的红花口服液各适量，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样分析，以外标一点法计算样品中锦葵花素和大枣苷的含量，结果见表5。

表5样品含量测定结果(mg/mL，n＝6)

3讨论

3.1流动相的选择

发明人曾用单一流动相进行洗脱，并比较了甲醇-水(20：80，V/V)、磷酸盐缓冲液(pH6.5)-甲醇(70：30，V/V)、乙腈-0.2％磷酸溶液-四氢呋喃(30：60：10，V/V/V)、乙腈-0.5％磷酸溶液(10：90，V/V)等不同流动相的试验结果，发现分离效果均不理想或只能测定单一成分。后选择文中所用流动相，待测的两种成分分离较好且峰形较佳。

3.2最大吸收波长的选择

分别精密称取锦葵花素、大枣苷对照品各适量，加适量25％甲醇溶解并稀释制成对照品溶液，在190～600nm波长范围内进行紫外-可见分光光度法扫描，发现锦葵花素在215、258nm波长处有最大吸收，大枣苷在225、405nm波长处有最大吸收，当选择单一波长测定时，则必有其中一种成分的响应值很小，故选用文中所用的双波长为测定波长，同时测定两种成分，所得结果较佳。

4结论

本试验所建立的方法简便、准确、可靠、重复性好，可用于本保健品的质量控制。

实验三：不同保健品中锦葵花素、大枣苷的含量测定

1待测样品

1.1甲保健品口服液：

处方：枸杞子300.0g、大枣200.0g。

制备方法：(1)取100.0g枸杞子、取66.6g大枣，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液I；

(2)取100.0g枸杞子、取66.6g大枣，置药材于渗漉缸中，以8倍量50％乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65％乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80％、90％，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95％，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；

(3)取100.0g枸杞子、取66.6g大枣，加入7倍量的水，煎煮提取3次，每次1h，合并提取液，提取液浓缩成浸膏；将上述浸膏经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积8倍量的pH 4的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积8倍量的70％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用碱液调节pH至11，在70℃下加热1.5h，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用8倍的乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，然后在75℃下蒸馏，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)将以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水至1000mL，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1％针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的口服液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得。

1.2乙保健品口服液：

处方：枸杞子300.0g、大枣200.0g。

制备方法：取干燥的枸杞子300.0g、大枣200.0g，混合，粉碎成粗粉，加入8倍重量比的70％乙醇浸渍50h，再用70％乙醇作溶剂缓慢渗滤至滤液呈微黄色，滤液在70℃下减压浓缩得相对密度为1.25的稠膏；再加12倍水充分搅拌并静置24h使油水分离，去除沉淀物和油脂，收集水层药液，加入药用活性炭静置2h吸附药液至无色，上聚酰胺色谱柱，用水饱和正丁醇洗脱，洗脱液在70℃下减压浓缩后加入10倍重量的95％乙醇进行二次乙醇提取，乙醇提液在6℃冷藏24h后过滤，滤液经减压浓缩后，再加入10倍重量份的水进行水提，经冷藏后24h，4℃离心过滤得水提液，水提液用0.3％重量比的活性炭脱色，边加边搅拌，并加热至40℃后静止1h；经膜过滤器过滤，超滤后在40℃下减压浓缩，得提取物稠膏；将提取物稠膏、药用聚乙二醇、甘露醇和医用氯化钠混合，用注射用水至1000mL，滤过，灌封、灭菌、灯检、包装，即得乙保健品口服液。

1.3丙保健品口服液：

处方：枸杞子300.0g、大枣200.0g。

制备方法：取干燥的枸杞子300.0g、大枣200.0g，混合，粉碎成粗粉，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取得到水蒸气蒸馏提取物，备用；取水蒸气蒸馏提取后的药渣，加入8倍重量比的70％乙醇浸渍50h，再用70％乙醇作溶剂缓慢渗滤至滤液呈微黄色，滤液在70℃下减压浓缩得相对密度为1.25的提取物稠膏；将提取物稠膏、水蒸气蒸馏提取物、药用聚乙二醇、甘露醇和医用氯化钠混合，用注射用水至1000mL，滤过，灌封、灭菌、灯检、包装，即得丙保健品口服液。

1.4丁保健品口服液：

处方：枸杞子300.0g、大枣200.0g。

制备方法：取干燥的枸杞子300.0g、大枣200.0g，混合，粉碎成粗粉，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取得到水蒸气蒸馏提取物，备用；取水蒸气蒸馏提取后的药渣，加入8倍重量比的70％乙醇浸渍50h，再用70％乙醇作溶剂缓慢渗滤至滤液呈微黄色，滤液在70℃下减压浓缩得相对密度为1.25的稠膏；再加12倍水充分搅拌并静置24h使油水分离，去除沉淀物和油脂，收集水层药液，加入药用活性炭静置2h吸附药液至无色，药液经膜过滤器过滤，超滤后在40℃下减压浓缩，得提取物稠膏；将提取物稠膏、水蒸气蒸馏提取物、药用聚乙二醇、甘露醇和医用氯化钠混合，用注射用水至1000mL，滤过，灌封、灭菌、灯检、包装，即得丁保健品口服液。

2测定方法

采用本发明实验三提供的检测方法对各个保健品中的活性成分进行含量测定。

3测定结果

测定结果见表6。

表6样品含量测定结果(mg/mL，n＝3)

4结论

从上表中可以看出，甲保健品口服液中的锦葵花素、大枣苷的含量明显高于其他保健品，这可能也是甲保健品口服液在辅助治疗股骨头坏死方面的效果优于其他保健品的原因，也说明本发明提供的特定的制备方法具备显著的、预料不到的技术效果。

附图说明：

图1：混合对照品高效液相色谱图；图中：1号峰为锦葵花素；2号峰为大枣苷

图2：供试品高效液相色谱图；图中：1号峰为锦葵花素；2号峰为大枣苷

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行进一步阐述：

实施例1：

处方：枸杞子300.0g、大枣200.0g。

制备方法：(1)取100.0g枸杞子、取66.6g大枣，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液I；

(2)取100.0g枸杞子、取66.6g大枣，置药材于渗漉缸中，以8倍量50％乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65％乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80％、90％，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95％，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；

(3)取100.0g枸杞子、取66.6g大枣，加入7倍量的水，煎煮提取3次，每次1h，合并提取液，提取液浓缩成浸膏；将上述浸膏经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积8倍量的pH 4的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积8倍量的70％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用碱液调节pH至11，在70℃下加热1.5h，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用8倍的乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，然后在75℃下蒸馏，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)将以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水至1000mL，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1％针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的口服液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得。

采用高效液相色谱法对本发明口服液中锦葵花素、大枣苷的含量进行测定

(1)色谱条件：色谱柱：C₁₈柱，流动相：甲醇-乙腈-0.25％磷酸溶液，梯度洗脱：从0min到15min，甲醇从5.0％线性上升到20.0％，乙腈从5.0％线性上升到20.0％，0.25％磷酸溶液从90.0％线性下降至60.0％；从16min到30min，甲醇从20.0％线性上升到50.0％，乙腈从20.0％线性增上升到35.0％，0.25％磷酸溶液从60.0％线性下降至15.0％；从31min到40min，甲醇从50.0％线性下降到30.0％，乙腈从35.0％线性下降到25.0％，0.25％磷酸溶液从15.0％线性上升至45.0％；流速：1.2mL/min；检测波长：0至15min，检测波长为258nm，16至40min，检测波长为405nm；柱温：30℃；进样量：10μL；

(2)混合对照品溶液的制备：精密称取锦葵花素和大枣苷对照品，分别加25％甲醇溶解并稀释制成锦葵花素和大枣苷的质量浓度均为1.0000mg/mL的单一成分对照品贮备液；精密量取两种对照品贮备液，用25％甲醇稀释制成锦葵花素与大枣苷质量浓度均为0.4000mg/mL的溶液，即得混合对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：精密量取本口服液样品1mL，置于10mL量瓶中，加25％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(4)测定：精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪进行测定；

(5)测定结果：本口服液样品种锦葵花素、大枣苷的含量分别为0.207mg/mL、0.452mg/mL。