茯苓萃取物及土莫酸于保护肌肉的用途的制作方法

本发明涉及茯苓(fu-ling(poriacocos))萃取物与土莫酸(tumulosicacid)(即，茯苓萃取物的一成分)或土莫酸的医药上可接受的盐的应用，尤其是关于使用茯苓萃取物、土莫酸、或土莫酸的医药上可接受的盐以保护肌肉的应用，包括抗肌细胞损伤、促进肌肉的再生与修复，以调节、治疗及/或延缓肌肉萎缩，特别是因为老化、疾病、及/或恶病质所引起的肌肉萎缩。

背景技术：

肌肉组织是哺乳动物体内质量最高的组织，其主要功能是产生力量以牵引身体各部位运动。肌肉可区分为骨骼肌、心肌及平滑肌三种。骨骼肌依其本身的代谢类型及特性可进一步区分为慢肌和快肌，前者由慢肌纤维蛋白所组成，其收缩可持续较长的时间，但力量较小；后者则由快肌纤维蛋白所组成，收缩较快、力量较大，但也较容易感到疲劳。

在正常生理状态下，肌蛋白的合成与降解呈动态平衡。然而，当发生肌蛋白降解速度大于肌蛋白合成速度的肌蛋白代谢失衡情形时，会导致肌肉萎缩(或称肌肉流失)，且出现肌肉重量明显减轻、肌纤维横截面积减少、肌纤维类型相关蛋白(即，慢肌纤维蛋白与快肌纤维蛋白)选择性减少等特征性的变化，造成肌力下降、运动障碍、易疲劳、代谢紊乱等症状，严重影响日常工作和生活机能。

一般而言，骨骼肌在受到损伤后可通过肌肉再生程序而修复受损部位，然而，当该再生程序严重受阻则会发生肌肉萎缩的情形。研究发现，肌肉再生程序相当复杂，首先涉及星状细胞(satellitecells)的活化，活化后的星状细胞会分化形成单核的成肌细胞(myoblasts)，成肌细胞再进一步增殖与分化以相互融合成多核的肌管(myotubes)，最后再由肌管成熟分化为新的肌纤维(myofibers)。于肌肉再生过程中，不同阶段各自受到不同肌肉生成调节因子(myogenicregulatoryfactors，mrfs)所调控。例如，在成肌细胞分化形成肌管的过程中，myod及myogenin可调控肌球蛋白重链(myosinheavychain，myhc；一肌管特异性结构蛋白)的生成，前述调控在肌肉再生过程中乃不可或缺的重要步骤，因此，myod、myogenin、及myhc可作为成肌细胞分化状况的标志性分子。

已知有些生理状况或特殊疾病会引起肌细胞损伤，导致肌蛋白代谢失衡或肌细胞死亡，最终造成肌肉萎缩。其中，前述生理状况包括例如：神经退化、长期卧床、衰老、创伤和恶病质(cachexia；例如癌症恶病质)等；前述特殊疾病则包括例如：败血病、艾滋病、肾脏衰竭、库欣氏症候群(cushing’ssyndrome，cs)、肌少症(sarcopenia)、癌症、慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease，copd)、郁血性心脏衰竭(congestiveheartfailure，chf)等。

老化是肌少症的最主要成因，有统计数据指出，成人在60至70岁发生肌少症的机率为13至24％，高于80岁的发生机率则为约50％。其中，美国每年因为肌少症所造成的医疗花费高达约118至262亿美元。恶病质则与其他高发生率的疾病相关，举例言之，约有50％的癌症患者、20至40％的copd患者、及50至70％的chf患者会出现恶病质的症状(例如营养不良)。

临床上迄今尚无有效治疗或延缓肌肉萎缩的方法。为开发更有效治疗或延缓肌肉萎缩的方法，本发明人由传统中药材中选择茯苓，探讨其应用于保护肌肉(抗肌细胞损伤、促进肌肉的再生与修复)的可行性。

本发明人从研究结果发现，茯苓及其所含的土莫酸(tumulosicacid)，皆可有效抗肌细胞损伤、促进肌肉的再生与修复，故可用于调节、治疗及/或延缓肌肉萎缩，特别是因为老化、疾病、及/或恶病质所引起的肌肉萎缩，从而可用于提供保护肌肉的医药组合物、药物或食品。

技术实现要素：

本发明的一目的，在于提供一种使用茯苓萃取物于制备一保护肌肉的药物或食品的用途。较佳地，该茯苓萃取物为茯苓的极性溶剂萃取物，该极性溶剂选自水、c1-c4醇类、及前述的组合；更佳地，该茯苓萃取物含有土莫酸；尤其较佳地，该茯苓萃取物为茯苓肉部、茯苓皮部及/或茯苓发酵产物的萃取物。其中，该药物用于抗肌细胞损伤、促进肌肉再生与修复、或治疗及/或延缓以下的至少一种所引起的肌肉萎缩：老化、疾病、及恶病质；该食品用于调节以下的至少一种所引起的肌肉萎缩：老化、疾病、及恶病质，从而有助于肌肉正常收缩、维持肌肉正常生理、维持神经肌肉正常功能(neuromuscularfunction)、维持能量正常代谢或增强能量，且该食品为保健食品、营养补充食品或特殊营养食品。

本发明的另一目的，在于提供一种使用一活性成分于制备一保护肌肉的药物或食品的用途，其中该活性成分为土莫酸及/或其医药上可接受的盐。较佳地，该活性成分以植物萃取物的形式使用；更佳地，以茯苓萃取物的形式(例如：茯苓肉部、茯苓皮部及/或茯苓发酵产物的萃取物)使用，尤其是以茯苓的极性溶剂萃取物的形式使用，该极性溶剂选自水、c1-c4醇类、及前述的组合。其中，该药物用于抗肌细胞损伤、促进肌肉再生与修复、或治疗及/或延缓以下的至少一种所引起的肌肉萎缩：老化、疾病、及恶病质；该食品用于调节以下的至少一种所引起的肌肉萎缩：老化、疾病、及恶病质，从而有助于肌肉正常收缩、维持肌肉正常生理、维持神经肌肉正常功能、维持能量正常代谢或增强能量，且该食品为保健食品、营养补充食品或特殊营养食品。

本发明的又一目的，在于提供一种保护肌肉的方法，其包含对一有需要的个体施用一有效量的上述活性成分或茯苓萃取物。该方法用于抗肌细胞损伤、促进肌肉再生与修复、或调节、治疗及/或延缓以下的至少一种所引起的肌肉萎缩：老化、疾病、及恶病质，或用于帮助肌肉正常收缩、维持肌肉正常生理、维持神经肌肉正常功能、维持能量正常代谢或增强能量。

本发明的再一目的，在于提供一种保护肌肉的组合物，该组合物为一药物或食品，且包含一有效量的上述活性成分或茯苓萃取物。其中，该组合物用于抗肌细胞损伤、促进肌肉再生与修复、或调节、治疗及/或延缓以下的至少一种所引起的肌肉萎缩：老化、疾病、及恶病质，或用于帮助肌肉正常收缩、维持肌肉正常生理、维持神经肌肉正常功能、维持能量正常代谢或增强能量。

附图说明

图1所示为tnf-α对c2c12细胞内活性氧水平的影响；

图2所示为茯苓萃取物对经tnf-α诱导损伤的c2c12细胞的存活率的影响；以及

图3所示为茯苓萃取物对经tnf-α诱导损伤的c2c12细胞内活性氧水平的影响。

具体实施方式

本发明的详细技术及较佳实施例，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域普通技术人员据以明了本发明的特征；但，在不背离本发明精神下，本发明还可以多种不同形式的实施例来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所陈述的。

除非文中有另外说明，于本说明书中(尤其是在权利要求书中)所使用之“一”、“该”及类似用语应理解为包含单数及复数形式；所谓“有效量”，是指投予至个体时，可有效至少部分改善怀疑个体的病情的化合物数量；单位“毫克/公斤体重”是指每公斤体重个体所须的投与量。

除非文中有另外说明，于本说明书中(尤其是在权利要求书中)所谓“个体”是指人类或非人的哺乳动物；所谓“治疗”包括预防特定疾病或症状、减轻特定的疾病或症状、及/或防止或消除该病症；所谓“调节肌肉萎缩”是指帮助肌肉正常收缩、维持肌肉正常生理、维持神经肌肉正常功能(neuromuscularfunction)、维持能量正常代谢、及/或增强能量；所谓“医药上可接受的盐”是指投予至生物体后，可产生与母体化合物相同或类似的药理活性、且为生理上可忍受(即，具有尽可能小的毒性作用)的盐。

本说明书中所使用的数值范围(例如5至100)应理解为也包含在该范围中的所有有理数以及在该范围中的任何有理数所组成的范围，因此，本说明书中所使用的数值范围包含介于所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能组合。另外，当本文于数值前使用“约”时，实质上代表与所述数值相差在20％以内，较佳在10％以内，且更佳在5％以内。

茯苓药材是指拟层孔菌科真菌(poriacocos(schw.)wolf)的干燥菌核。茯苓真菌常寄生在松树根上，外皮呈淡棕色或黑褐色(茯苓皮部)，内部则呈粉红色或白色(茯苓肉部)。

本发明人研究发现，茯苓萃取物可有效地抗肌细胞损伤、促进肌肉再生与修复，故可用于保护肌肉，具有调节、治疗及/或延缓肌肉萎缩的功效。如下附实施例所显示，于不受理论限制下，坚信本发明所使用的茯苓萃取物可针对因为老化、疾病、及/或恶病质所引起的肌肉萎缩，提供调节、治疗及/或延缓效果。因此，本发明提供一种使用茯苓萃取物于保护肌肉的应用，包括使用茯苓萃取物于制备一保护肌肉的药物或食品、对有需要的个体投予茯苓萃取物以保护肌肉的方法、以及提供一包含茯苓萃取物的食品或医药组合物。

根据本发明，所采用的茯苓萃取物可以是一通过使用一极性溶剂以萃取茯苓原料所提供的萃取液。其中，该茯苓原料可以是茯苓肉部、茯苓皮部及/或茯苓发酵产物；该极性溶剂可以是水及/或c1-c4醇类。较佳地，使用水、乙醇、或其组合作为该极性溶剂。可视需要调整用于萃取的极性溶剂与茯苓的用量比率，一般而言，极性溶剂的用量并无特殊限制，只要可使原料均匀分散即可。于本发明一具体实施例中，使用乙醇作为极性溶剂，并以体积比约1：8的原料：乙醇，将原料分散于乙醇中，以进行萃取。

于上述萃取操作中，进行该萃取一段时间以达到所欲的萃取程度。以采用乙醇作为该极性溶剂为例，通常为至少1小时，较佳为至少2小时，更佳为至少3小时，且可视需要辅以例如煎煮、冷却、过滤、减压浓缩、树脂管柱层析等其它操作。

视需要地，可以对前述通过使用一极性溶剂以萃取茯苓原料所提供的萃取液依序进行碱化及酸化处理，以提升萃取液中的土莫酸含量。其中，所谓“碱化”是指使采用任何合宜的碱性物质，以提高物料(于本发明是指前述通过使用一极性溶剂以萃取茯苓原料所提供的萃取液)的ph值。于本发明一具体实施例中，使用氢氧化钠以进行该碱化反应。

一般而言，于碱化处理步骤中将物料的ph值提升到不小于约10；较佳是提升到不小于约11；最佳是提升到不小于约12。于本发明一具体实施例中，于碱化处理中添加使用1n的氢氧化钠，以提升该萃取液的ph值到约12。在提升萃取液的ph值后，视需要于升温下进行碱化反应。举例言之，该碱化反应于不小于50℃的温度下进行，较佳于不小于60℃的温度下进行。如下附实施例所示，可以于例如约70℃的温度下进行碱化反应。

所谓“酸化”是指采用任何合宜的酸性物质，以调降物料(于本发明是指前述经碱化的萃取液)的ph值。于本发明一具体实施例中，使用盐酸以调降经碱化的萃取液的ph值。

一般而言，该酸化处理所达的ph值的调降程度并无特殊要求，只要有降低ph值即可。举例言之，使萃取液的ph值调降至少约3.0，较佳调降至少约4.0。于本发明一具体实施例中，于酸化处理中将经碱化的萃取液的ph值调降至约7。

根据本发明所采用的茯苓萃取物，也可以是一干燥物，此干燥物可通过干燥前述经或未经碱化及酸化处理所得的萃取液而提供。为尽可能达到最大的萃取效益，视需要地，可以相同或不同极性溶剂重复萃取茯苓原料，并合并该多次萃取所得的萃取液，再进行干燥，或视需要的碱化及酸化处理。其中，各萃取操作可以相同或不同的极性溶剂进行。

本发明人进一步研究发现，于茯苓萃取物所含有的成分中，土莫酸本身即可有效地促进肌肉的再生与修复，故可用于保护肌肉，具有调节、治疗及/或延缓肌肉萎缩的功效。如下附实施例所显示，于不受理论限制下，坚信土莫酸可针对因为老化、疾病、及/或恶病质所引起的肌肉萎缩，提供调节、治疗及/或延缓效果。因此，本发明也提供一种使用土莫酸及/或其医药上可接受的盐于保护肌肉的应用，包括使用土莫酸及/或其医药上可接受的盐于制备一保护肌肉的药物或食品、对有需要的个体投予土莫酸及/或其医药上可接受的盐以保护肌肉的方法、以及提供一包含土莫酸及/或其医药上可接受的盐的食品或医药组合物。

较佳地，该土莫酸及/或其医药上可接受的盐以植物萃取物的形式使用；更佳地，以茯苓萃取物的形式使用，尤其是以茯苓的极性溶剂萃取物的形式使用，该极性溶剂选自水、c1-c4醇类、及前述的组合。

于根据本发明的应用所提供的医药组合物或药物可呈任何合宜的型式，并无特殊限制，端视所欲的用途而呈对应的合宜剂型。举例言之，但不以此为限，该医药组合物或药物可以口服或非经口服(例如：皮下、静脉内、肌肉、腹腔、或鼻腔)的投药方式施用至有需要的个体上，以治疗及/或延缓因为老化、疾病、及/或恶病质所引起的肌肉萎缩。其中，视使用形式及用途而定，可选用合宜的载剂以提供该医药组合物或药物，其中，该载剂包括赋形剂、稀释剂、辅助剂、安定剂、吸收延迟剂、崩散剂、增溶剂、乳化剂、抗氧化剂、黏合剂、结合剂、增黏剂、分散剂、悬浮化剂、润滑剂、吸湿剂等。

以适于口服的剂型为例，于根据本发明的应用所提供的医药组合物或药物可含有任何不会不利影响活性成分(即，茯苓萃取物或土莫酸)的所欲效益的医药上可接受的载剂，例如：水、食盐水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其类似物、纤维素、淀粉、糖膨润土(sugarbentonite)、及前述的组合。可利用任何合宜的方法，以适于口服投药的剂型提供该医药组合物或药物，例如：锭剂(例如糖衣锭)、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、流浸膏剂、溶液剂、糖浆剂、悬液剂、酊剂等。

至于适于皮下、静脉内、肌肉、或腹腔注射的针剂或点滴剂，则可于根据本发明的应用所提供的医药组合物或药物中含有一或多种例如等张溶液、盐类缓冲液(如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液)、增溶剂、乳化剂、5％糖溶液、以及其他载剂等成分，以静脉输注液、乳剂静脉输注液、干粉注射剂、悬液注射剂、或干粉悬液注射剂等剂型提供该医药组合物或药物。或者，可将该医药组合物或药物制备成一注射前固体，以可溶于其他溶液或悬浮液中的剂型、或可乳化的剂型提供该注射前固体，并于投予至有需要的个体之前，将该注射前固体溶于其他溶液或悬浮液中或将其乳化，提供所欲的注射剂。

视需要地，可于根据本发明的应用所提供的医药组合物或药物中另外含有合宜用量的添加剂，例如可提高该医药组合物或药物于服用时的口适感及视觉感受的调味剂、调色剂、着色剂等，以及可改善该医药组合物或药物的稳定性及储存性的缓冲剂、保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等。此外，该医药组合物或药物可视需要另外含一或多种其他活性成分(例如维生素d、维生素b1、维生素b2、烟碱素、生物素、泛酸、钙、碘、镁、锌、蛋白质等)，或者与含该一种或多种其他活性成分的药物并用，以进一步加强该医药组合物或药物的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度，只要该其他活性成分对本发明活性成分(即，茯苓萃取物或土莫酸)的效益没有不利的影响即可。

于根据本发明的应用所提供的医药组合物或药物可以一日一次、一日多次、或数日一次等不同投药频率施用，端视投予个体的需求、年龄、体重、及健康况状而异。举例言之，当以口服方式施用至一个体以保护肌肉时，以茯苓萃取物计，其用量为每天约0.003毫克/公斤体重至约30毫克/公斤体重，较佳为每天约0.05毫克/公斤体重至约20毫克/公斤体重，更佳为每天约1毫克/公斤体重至约15毫克/公斤体重。或者，以土莫酸计，其用量为每天约0.5毫克/公斤体重至约20毫克/公斤体重，较佳为每天约1毫克/公斤体重至约15毫克/公斤体重，更佳为每天约5毫克/公斤体重至约10毫克/公斤体重。

于根据本发明的应用所提供的食品有助于肌肉正常收缩、维持肌肉正常生理、维持神经肌肉正常功能(neuromuscularfunction)、维持能量正常代谢或增强能量，可用于调节因为老化、疾病、及/或恶病质所引起的肌肉萎缩。

于根据本发明的应用所提供的食品可以是保健食品、营养补充食品或特殊营养食品，且可以制成例如乳制品、肉类加工品、面包类、面食品、饼干、口含锭、胶囊、果汁类、茶类、运动饮料、营养饮料等产品，但不以此为限。较佳地，根据本发明的应用的食品以保健食品的型式提供。

于根据本发明的应用所提供的保健食品、营养补充食品及特殊营养食品可以一日一次、一日多次、或数日一次等不同频率食用，端视投予个体的年龄、体重、运动量、及健康状况而采用的建议摄取量而异。也可针对特定族群调整本发明所提供的保健食品、营养补充食品及特殊营养食品中茯苓萃取物或土莫酸的含量，较佳为调整至每日应服用的量。

可于本发明保健食品、营养补充食品及/或特殊营养食品的外包装标示建议使用量、特定族群(例如重度运动者、孕妇、癌症患者、心脏衰竭患者)的使用标准及条件、或与其他食品或医药共同服用的建议事项，以利用户在无医师、药师或相关执事人员指导下可在家自行服用而无安全疑虑。

本发明也提供一种于一个体中保护肌肉的方法，其包含对该个体施用一有效量的活性成分，其中该活性成分为茯苓萃取物、土莫酸、及/或土莫酸的医药上可接受的盐。于根据本发明的保护肌肉的方法中，有关该活性成分的实施例、投予途径、投予形式、适用剂量、以及相关治疗的应用，均如上述的说明。

现以下列实施例进一步例示说明本发明。其中这些实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的保护范围。本发明保护范围应如权利要求书界定为准。

实施例1：茯苓萃取物的制备与成分分析

(1-1)

取茯苓药材(来源产地为云南)，清洗后剥取其外皮(下称“茯苓皮部”)，其余即为肉部(下称“茯苓肉部”)。

(1-2)

取(1-1)的茯苓肉部700公斤，于室温以约1：8(茯苓肉部：75％乙醇)的体积比浸泡于75％乙醇中，历时12小时，然后煮沸并进行萃取(历时3小时)。重复前述萃取步骤，共三次。合并三次萃取所得的萃取液并过滤以去除不溶物。接着，进行减压浓缩以去除乙醇，再以喷雾干燥机进行干燥，获得一萃取物。

(1-3)

以液相层析/紫外光/质谱仪(lc/uv/ms，liquidchromatographycoupledtodiodearrayuvdetectionandmassspectrometry)，分别于243纳米及210纳米波长下检测由(1-2)所获得的萃取物的成分。结果显示，由(1-2)所获得的萃取物含有茯苓酸(pachymicacid)、去氢茯苓酸(dehydropachymicacid)、土莫酸(tumulosicacid)、去氢土莫酸(dehydrotumulosicacid)、猪苓酸c(polyporenicacidc)、及3-表-去氢土莫酸(3-epi-dehydrotumulosicacid)等成分。接着，以高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，hplc)定量该萃取物中各成分的含量，结果示于表1。

表1

(1-4)

取3250公克(1-2)所获得的萃取物，以约1：10(萃取物：纯水)的体积比均匀分散于纯水中。接着，加入氢氧化钠使该混合物的碱浓度为1n(即，提升该混合物的ph值到约12)，再倒入温度维持于70℃的调制桶中且均匀搅拌直至反应完全。然后，以12n的浓盐酸进行中和，使该混合物的ph值下降至7，再于室温下以1000(rpm)进行离心(以平板式离心机)，历时30分钟，去除滤液，并以纯水清洗剩余的不溶物。将该不溶物烘干并研磨成粉末后，以约1：40(不溶物：95％乙醇)的体积比，使用95％乙醇进行萃取，重复该萃取步骤，共三次，合并三次萃取所得萃取液并进行减压浓缩以去除乙醇，获得2000公克产物(此即，后续实验所使用的茯苓肉部萃取物)。

(1-5)

以液相层析/紫外光/质谱仪，分别于243纳米及210纳米波长下检测由(1-4)所获得的萃取物的成分。结果显示，由(1-4)所获得的萃取物含有土莫酸、去氢土莫酸、猪苓酸c、及3-表-去氢土莫酸等成分，但不含茯苓酸及去氢茯苓酸。接着，以高效液相色谱法定量该萃取物中各成分的含量，结果显示，土莫酸、去氢土莫酸、猪苓酸c、及3-表-去氢土莫酸于(1-4)所得的萃取物中的总含量为6.2重量％。其中，以土莫酸、去氢土莫酸、猪苓酸c、及3-表-去氢土莫酸的总重量计，土莫酸约占53.74％、去氢土莫酸约占21.26％、猪苓酸c约占12.10％、3-表-去氢土莫酸约占12.90％。

(1-6)

取(1-1)的茯苓皮部，于室温以约1：8(茯苓皮部：75％乙醇)的体积比浸泡于75％乙醇中，历时12小时，然后煮沸并进行萃取(历时3小时)。重复前述萃取步骤，共三次。合并三次萃取所得的萃取液并过滤以去除不溶物。接着，进行减压浓缩以去除乙醇，再以喷雾干燥机进行干燥，获得一茯苓皮部萃取物供后续实验使用。

(1-7)

以灭菌后的固态基质接种茯苓菌株，置于20～35℃、相对湿度30～70％的环境避光发酵数周至数月，以获得茯苓发酵产物。取前述的茯苓发酵产物100公克，将其烘干并研磨成粉末后，于室温以约1：8(发酵产物粉末：75％乙醇)的体积比均匀分散于75％乙醇中，历时12小时，然后煮沸并进行萃取(历时3小时)。重复前述萃取步骤，共三次。合并三次萃取所得的萃取液并过滤以去除不溶物。接着，进行减压浓缩以去除乙醇，再以喷雾干燥机进行干燥，获得一茯苓发酵萃取物供后续实验使用。

实施例2：肌细胞损伤模型的建立

肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactoralpha，tnf-α)是一种促进发炎反应(pro-inflammatory)的细胞激素(cytokine)，分子量为17,000。人体临床数据显示，在一些特殊疾病(如癌症、艾滋病、慢性阻塞性肺病等)患者、施用抗癌药物者、及老年人的体内，tnf-α的浓度会上升，伴随肌肉异化作用(即，肌肉分解消耗)或肌细胞死亡增加的现象。研究显示，将tnf-α注射至实验动物体内或投予药物使实验动物体内tnf-α浓度增加会诱发肌细胞损伤(包括肌蛋白代谢失衡、肌细胞死亡等)，进而导致肌肉的萎缩。为了探讨茯苓萃取物及其中的成分于保护肌肉的功效与作用机制，本发明人以tnf-α进行诱导，建立肌细胞损伤模型。

首先，以h-dmem培养基(购自sigma公司)对c2c12细胞(即，小鼠的成肌细胞，购自atcc)进行培养，待c2c12细胞生长至80％汇合度(即，混合单层细胞占80％面积)后，将细胞分成四组，并将各组的培养基更换为2％马血清的分化培养基。接着，加入tnf-α(购自sigma公司)使其在各组培养基中的最终浓度达到0、2、5、或10纳克/毫升(ng/ml)。在历时4天的分化培养基与tnf-α的共处理之后，测定c2c12细胞内活性氧水平(reactiveoxidativestress，ros)作为模型评价指针，建立肌细胞损伤模型。最后，以未经tnf-α处理的组别(即，tnf-α的使用浓度为0纳克/毫升)的结果为基准，计算其他各组的相对的细胞内活性氧水平，结果示于图1(数据均为平均数±sem，n＝6，由t检验分析得到，***p<0.001)。

由图1可知，当使用5纳克/毫升的tnf-α，c2c12细胞内活性氧水平有升高的现象；当使用10纳克/毫升的tnf-α，c2c12细胞内活性氧水平的升高更为明显。因此，后续实验以10纳克/毫升作为tnf-α诱导肌细胞损伤的浓度。

实施例3：茯苓萃取物于抗肌细胞损伤的效果

取实施例1(1-4)所提供的茯苓萃取物，以二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，dmso；购自sigma公司)配制成茯苓肉部萃取物溶液。待c2c12细胞在h-dmem培养基中细胞生长至80％汇合度后，将其分成五组，并进行以下处理：

(1)控制组：以h-dmem培养基(不含茯苓萃取物)进行培养，历时6小时。接着，将培养基更换为2％马血清的分化培养基，以进行培养，历时4天。

(2)tnf-α组：以h-dmem培养基进行培养，历时6小时。接着，将培养基更换为2％马血清的分化培养基，并加入tnf-α使其于培养基中的最终浓度为10纳克/毫升，以与分化培养基进行共处理，历时4天。

(3)tnf-α+茯苓萃取物组(共三组)：于h-dmem培养基中加入上述的茯苓肉部萃取物溶液，使其于培养基中的最终浓度为1、5、或10微克/毫升，以进行预处理，历时6小时。接着，将培养基更换为2％马血清的分化培养基，并加入tnf-α使其于培养基中的最终浓度为10纳克/毫升，以与分化培养基进行共处理，历时4天。

其后，测定各组c2c12细胞的存活率(以mttassay进行测试)、以及细胞内活性氧水平，并以控制组的结果为基准，计算其他各组的相对的存活率以及细胞内活性氧水平，以测定茯苓萃取物抗tnf-α诱导的肌细胞损伤的有效浓度，结果示于图2及图3(数据均为平均数±sem，n＝6，由t检验分析得到，#p<0.05，###p<0.001，*p<0.05，***p<0.001)。

由图2及图3可知，在经tnf-α诱导细胞损伤的组别中，若以1至5微克/毫升的茯苓萃取物进行预处理，c2c12细胞的存活率随着茯苓萃取物浓度的升高而呈逐渐上升的趋势，细胞内活性氧水平则随茯苓萃取物浓度的升高而呈逐渐下降的趋势。其中，以5微克/毫升的茯苓萃取物进行预处理，活性氧水平下降至与控制组(未经tnf-α诱导损伤)相当。前述结果显示，茯苓萃取物可有效降低tnf-α对肌细胞所造成的损伤，具有抗肌细胞损伤的效果。

实施例4：茯苓萃取物及土莫酸于促进肌肉再生与修复的效果

如上述说明，myogenin、及myhc可作为成肌细胞分化状况的标志性分子。为探讨茯苓萃取物与土莫酸是否具有促进成肌细胞分化的效果，将土莫酸(购自杏辉药品工业股份有限公司)、实施例1(1-4)所提供的茯苓肉部萃取物、实施例1(1-6)所提供的茯苓皮部萃取物、及实施例1(1-7)所提供的茯苓发酵萃取物，分别以二甲基亚砜(dmso；购自sigma公司)配制成土莫酸溶液、茯苓肉部萃取物溶液、茯苓皮部萃取物溶液、茯苓发酵萃取物溶液。

待c2c12细胞在h-dmem培养基中细胞生长至80％汇合度后，将其分成十四组，并进行以下处理：

(1)控制组：将培养基更换为2％马血清的分化培养基，以进行培养，历时4天。

(2)肉部萃取物组(共三组)：将培养基更换为2％马血清的分化培养基，并加入上述的茯苓肉部萃取物溶液，使其于培养基中的最终浓度为0.1、1、或10微克/毫升，以进行处理，历时4天。

(3)皮部萃取物组(共四组)：将培养基更换为2％马血清的分化培养基，并加入上述的茯苓皮部萃取物溶液，使其于培养基中的最终浓度为0.01、0.1、0.5、或1微克/毫升，以进行处理，历时4天。

(4)发酵萃取物组(共三组)：将培养基更换为2％马血清的分化培养基，并加入上述的茯苓发酵萃取物溶液，使其于培养基中的最终浓度为0.2、2、或20微克/毫升，以进行处理，历时4天。

(5)土莫酸组(共四组)：将培养基更换为2％马血清的分化培养基，并加入土莫酸溶液，使其于培养基中的最终浓度为0.01、0.1、1、或10微克/毫升，以进行处理，历时4天。

其后，萃取各组细胞的蛋白质，并以西方墨点法侦测myogenin、myhc等成肌细胞分化指标蛋白的表现。最后，以控制组的结果为基准(即，以控制组的表现量为100％)，计算其他各组细胞的myogenin及myhc蛋白的相对表现量，结果示于表2。

表2

由表2可知，针对myogenin蛋白的表现量，低剂量(0.1微克/毫升)的茯苓肉部萃取物可提升约30％的表现量，高剂量(10微克/毫升)的茯苓肉部萃取物则可提升高达170％的表现量；另一方面，低剂量(0.01微克/毫升)的茯苓皮部萃取物可提升约50％的表现量，0.1至0.5微克/毫升的茯苓皮部萃取物可提升约70-80％的表现量，1微克/毫升的茯苓皮部萃取物也具有提升myogenin蛋白表现量的效果；又一方面，低剂量(0.2微克/毫升)的茯苓发酵萃取物可提升约70％的表现量，而2微克/毫升的茯苓发酵萃取物可提升高达120％的表现量，20微克/毫升的茯苓发酵萃取物也具有提升myogenin蛋白表现量的效果；再一方面，低剂量(0.01至0.1微克/毫升)的土莫酸可提升约30％的表现量，且myogenin蛋白表现量随着土莫酸浓度提升而呈现正向增加的趋势，其中10微克/毫升的土莫酸时提升约390％的表现量。

由表2也可知，针对myhc蛋白的表现量，10微克/毫升的茯苓肉部萃取物可提升约30％的表现量；另一方面，低剂量(0.01微克/毫升)的茯苓皮部萃取物即可提升10％的表现量，且myhc蛋白表现量随着茯苓皮部萃取物的浓度提升而呈现正向增加的趋势，其中1微克/毫升的茯苓皮部萃取物可提升约120％的表现量；又一方面，低剂量(0.2微克/毫升)的茯苓发酵萃取物可提升约60％的表现量，而20微克/毫升的茯苓发酵萃取物可提升高达90％的表现量；再一方面，10微克/毫升的土莫酸可提升约80％的表现量。

上述结果显示，茯苓萃取物(包含茯苓肉部萃取物、茯苓皮部萃取物、茯苓发酵萃取物等)及土莫酸皆可有效提升c2c12细胞中的myogenin、myhc等成肌细胞分化指标蛋白的表现，具有促进肌细胞分化的效果，有助于受损的肌肉组织的再生与修复。

由以上实验结果可知，茯苓萃取物可有效保护损伤的肌细胞，使肌细胞的存活率上升，同时可抑制活性氧水平的上升。因此，茯苓萃取物对于损伤的肌细胞具有改善氧化压力(oxidativestress)的功效。此外，茯苓萃取物及其所含的土莫酸能够促进成肌细胞分化。此说明，茯苓萃取物及其所含成分可有效抗肌细胞损伤、以及促进肌肉再生与修复，故可用于保护肌肉，并且有助于肌肉正常收缩、维持肌肉正常生理、维持神经肌肉正常功能(neuromuscularfunction)、维持能量正常代谢或增强能量。