粪菌移植在治疗帕金森病方面的应用的制作方法

本发明涉及粪菌移植在治疗帕金森病方面的应用，属于医学神经药理学
技术领域：
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背景技术：
：帕金森病(parkinson’sdisease，pd)是最常见的运动神经系统退行性疾病，主要临床表现为：静止震颤、行动迟缓、站立不稳以及姿势反射障碍。帕金森病患者脑部的主要病变部位为黑质及纹状体，其中黑质致密部内多巴胺能神经元的死亡和数量减少是造成投射到纹状体内多巴胺减少的直接原因。作为仅次于阿尔茨海默症的第二大神经退行性疾病，帕金森病随年龄的增加其发病率和患病率均急剧增加，在60岁以上老年人中患病率达1％，85岁以上人群达5％-6％，目前我国的帕金森病患者数量超过200万。pd的发病与老化、环境及遗传因素有关，但pd发病机制目前仍不明确。研究表明，氧化应激损伤、自噬、免疫炎症、内质网应激、凋亡等病理机制相互作用，可能影响了pd的发生和发展。最近研究表明肠道菌群失衡或与pd的发生及临床表型有关。目前我国已逐渐进入老龄化社会，随着老龄人口的增加，pd患者的数量也将迅速增加。由于该病病程长、致残率高、缺乏有效治愈手段，患者、家庭和社会的经济负担极其沉重。因此，找到有效治疗pd的治疗方式和药物已经到了刻不容缓的地步。目前临床针对帕金森病的治疗主要有药物干预治疗以及神经核团毁损术、脑深部电刺激术或神经组织及干细胞移植等外科手术的治疗，以及仍处于实验阶段的细胞治疗和基因治疗。其中药物治疗大多是对症治疗，可暂时缓解症状，但不能抑制或延缓疾病的进程，而手术治疗具有一定的适应症，且费用较高。与药物治疗不同，粪菌移植(fecalmicrobiotatransplantation，fmt)作为一种特殊的器官移植和可以重建肠道菌群的疗法被临床所关注，目前主要应用于复发性难辨梭菌感染、炎症性肠病、肠易激综合征等肠道疾病以及代谢性疾病和自闭症，具有治愈率高，不良反应少等优点，对于治疗pd方面的报道极少，其巨大作用潜力有待发掘。fmt是将健康人粪便中的功能菌群移植至患者胃肠道内，重建具有正常功能的肠道菌群，以此治疗肠道和肠道外疾病。东晋时期，葛洪所编著《肘后方》就有关于fmt的记载。明朝时期由李时珍编著的《本草纲目》中也有人粪(黄龙汤)治疗严重腹泻和食物中毒的内容。目前，fmt已开始应用于临床难辨梭菌感染、炎性肠病、肠易激综合征等肠道疾病，fmt还可能用于治疗肠道免疫缺陷和过敏、肥胖、非酒精性脂肪肝、儿童自闭症等疾病。技术实现要素：为了克服现有临床治疗帕金森病的治疗方式和药物的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种具有潜在治疗帕金森病作用的治疗方式和药物。本发明通过建立c57bl/6j小鼠帕金森病模型，观察粪菌移植对帕金森病小鼠运动障碍症状，通过实验论证，fmt能改善帕金森病小鼠的运动迟缓症状，改善黑质致密部神经元，从而证明fmt对帕金森病具有神经保护作用。本发明的第一个目的是提供一种缓解和/或辅助治疗和/或治疗帕金森病的药物或者药物组合物，所述药物或者药物组合物以粪便菌群作为有效成分或者主要有效成分。在本发明的一种实施方式中，所述药物或者药物组合物还包括药学上可接受的赋型剂。所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。在本发明的一种实施方式中，所述药物或者药物组合物中含有质量百分比大于99％的粪便菌群和质量百分比小于1％的药学上可接受的载体或赋形剂。在本发明的一种实施方式中，本发明的粪便菌群可以与其他活性成分组合使用，只要它们不产生其他不利的作用，例如过敏反应。在本发明的一种实施方式中，本发明的治疗物可配制成若干种剂型，其中含有药学领域中常用的一些赋形剂；例如，口服制剂(如片剂，胶囊剂，溶液或混悬液)。在本发明的一种实施方式中，用于本发明药物组合物的载体是药学领域中可得到的常见类型，包括：口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如肠内肠外营养)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。本发明的第二个目的是提供一种改善运动能力的药物，所述药物以粪便菌群作为有效成分或者主要有效成分。本发明的第三个目的是提供一种提高纹状体内酪氨酸羟化酶表达的药物，所述药物以粪便菌群作为有效成分或者主要有效成分。本发明的第四个目的是提供一种缓解和/或辅助治疗和/或治疗帕金森病的保健食品、饮品、肠内营养制剂或者膳食补充剂，所述保健食品、饮品、肠内营养制剂或者膳食补充剂以粪便菌群为主要有效成分。本发明的第五个目的是提供粪菌移植的新应用。所述应用，是制备缓解和/或辅助治疗和/或治疗帕金森病的药物、保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂。在本发明中，所述粪便菌群是指无帕金森病的正常动物体或健康人的粪便菌群。在本发明中，所述粪便菌群是指健康人粪便中的菌群。在本发明中，所述粪便菌群是取正常动物体的粪便，稀释、振荡，过滤得到的菌液。本发明的有益效果：本发明通过建立小鼠帕金森病模型，观察粪菌移植对帕金森病小鼠运动障碍症状，通过实验论证，粪菌移植能改善帕金森病小鼠的运动迟缓症状，改善黑质致密部神经元，从而证明粪菌移植对帕金森病具有神经保护作用。本发明使用粪菌移植，明显改善纹状体内多巴胺含量，小鼠的运动能力、黑质致密部的酪氨酸羟化酶阳性神经元细胞等有了显著的提高或者改善。附图说明图1：粪菌移植对mptp诱导帕金森模型小鼠的体重变化影响实验结果图；图2：粪菌移植对mptp诱导帕金森模型小鼠运动行为学影响实验结果图；其中，图2a为爬杆实验结果；图2b为悬挂实验结果；图3：粪菌移植对mptp诱导帕金森模型小鼠粪便短链脂肪酸含量影响图；其中，图3a为乙酸含量，图3b为丙酸含量，图3c为正丁酸含量，图3d为正戊酸含量；图4：粪菌移植对mptp诱导帕金森模型小鼠肠道炎症影响图；其中，图4a为tnfαmrna含量，图4b为traf2mrna含量，图4c为tlr4mrna含量，图4d为nfκbmrna含量；图5：粪菌移植对mptp诱导的pd小鼠模型的神经保护作用；图6：空白组小鼠(c)和pd小鼠模型(m)粪便菌群构成差异。具体实施方案下面通过具体实施进一步阐述本发明方法，但本发明的实施方式不限于此。实施例1：动物模型的建立和分组体重20-25g，8周龄，雄性c57bl/6j小鼠，随机分为对照组，mptp模型组(先给mptp后给甘油pbs混合液)，fmt给菌组(先给mptp后给正常小鼠粪便菌液)，每组20只。置于23±2℃，照明时间为12h/day，动物适应环境一周后开始给予药物。mptp模型组每日腹腔注射mptp(30mg/kg)一次，连续5天，后每日甘油pbs混合液灌胃一次，连续7天。给药组每日腹腔注射mptp(30mg/kg)一次，连续5天，后每日正常小鼠粪便菌液灌胃一次，连续7天。对照组全程给予腹腔注射生理盐水，连续12天。实验过程中记录各组小鼠的体重变化并采集各组小鼠粪便。随后通过爬杆实验对小鼠的行为学进行评价，然后通过gc-ms检测粪便短链脂肪酸的含量，qpcr检测肠内炎症因子表达情况。通过以上方法来评价粪菌移植对帕金森病小鼠的神经保护作用。一、体重监测各组小鼠分别在进行给药操作前进行称重并记录，连续称重至给药结束。体重监测结果如图1所示，在进行mptp第一天给药后，模型组与给菌组小鼠均出现体重下降现象，适应后体重均缓慢上升。给菌治疗操作后，给菌组小鼠体重较模型组小鼠体重有升高的现象。体重监测证实fmt能改善帕金森小鼠的体重减轻现象。二、行为学评价各组小鼠分别在给予行为学检测前三天进行训练，每天一次，于给药结束后第一天进行行为学检测。爬杆实验(poletest)：自制爬杆架：选择长55cm，直径lcm的金属管，外紧裹纱布防滑，上端覆以直径2cm的球形突起(实验时作为小鼠的附着点)，然后将其固定于金属底座，放置在鼠笼中，底座用敷料覆盖。测试时将小鼠头朝上置于球形突起，记录其自放置杆至爬至杆底后肢着地的时间，测3次取平均值，每次间隔10分钟以上。如小鼠出现中途停顿或反向攀爬，则重新测量。该实验动物要经过提前训练3天。利用爬杆实验检测小鼠运动能力，如图2a所示。检测结果显示，空白组、模型组、给菌组的小鼠的爬杆平均时间分别为3.635s、5.153s、4.325s。与空白组小鼠比较，模型组小鼠爬杆所需时间增加，运动的速度减慢。结果证实注射mptp的小鼠活动能力减弱。给菌组的小鼠较模型组小鼠所需时间减少，速度较快，与模型组比较具有显著性差异(p<0.01)。结果证实fmt能改善帕金森病小鼠的运动能力。悬挂实验(tractiontest)：在两金属立柱之间水平拉紧一条金属线，直径1mm，距地面30cm。实验时让小鼠用两前爪悬挂在一水平金属线上停留10s，测3次取平均值，每次间隔10分钟以上。小鼠悬挂能力评分标准：在测试时间内，小鼠能够用两后爪抓住金属线计为3分，小鼠仅用一后爪抓住金属线计为2分，两后爪均抓不住金属线计为1分，小鼠跌落计为0分。同时每次实验前观察每只小鼠是否有震颤、竖毛、前腿抬高、竖尾、动作缓慢、减少等异常行为。该实验动物要经过提前训练3天。利用悬挂实验检测小鼠运动能力，如图2b所示。检测结果显示，空白组、模型组、给菌组的小鼠的悬挂实验平均得分分别为2.788s、2.091s、2.667s。与空白组小鼠比较，模型组小鼠悬挂得分低，运动灵活性下降。结果证实注射mptp的小鼠活动能力减弱。给菌组的小鼠较模型组小鼠悬挂得分高，灵活性高，与模型组比较具有显著性差异(p<0.01)给菌结果证实fmt能改善帕金森病小鼠的运动能力。三、gc-ms检测粪便短链脂肪酸的含量(1)样品处理每组收集8只小鼠的粪便组织于1.5mlep管中，所得取材立即转移到-80℃保存。测量时每1mg粪便加入10μlddh2o(10％，w/v)，用混悬仪制备成匀浆，13000r/min，4℃离心5min，0.2μm滤膜过滤，4℃储存备用。采用gc-ms法检测小鼠粪便短链脂肪酸含量。(2)gc-ms检测(a)色谱条件：日本shimadzu公司rtx-wax(0.25mm×30.0m，0.25μm)；分流进样；载气，超纯氦；柱温箱温度：100℃；进样口温度：240℃；升温程序见下表；分流进样，总流速:12.7ml/min，分流比：10.0:1；总程序时间：9.67min。(b)质谱条件：离子源(ei源)温度：220℃；接口温度：250℃；溶剂延迟：2.5min；选择离子扫描：43m/z、74m/z；具体条件如表1。表1速率最终温度保持时间7.50140.00.0060.00230.03.00(c)标准曲线的制备将短链脂肪酸品用超纯水制成浓度为1mg/ml的贮备液，再用超纯水稀释成5，10，20，40，60，80，100μg/ml的对照品溶液，取10μl注入色谱仪进行分析，得到对照品溶液色谱图。以各标准品溶液的浓度为横坐标(x)，各组分的峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，得到标准曲线方程。(3)实验结果如图3所示，与空白组的正常小鼠比较，模型组帕金森病小鼠粪便短链脂肪酸(乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸)含量明显上升，具有显著性差异(p<0.05，其中乙酸p<0.01)；给菌组小鼠粪便短链脂肪酸(乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸)含量较模型组小鼠明显下降(乙酸p<0.001，丙酸p<0.01，正丁酸p<0.05，正戊酸p<0.01)，结果证明模型组小鼠肠道菌群出现紊乱现象，导致肠道短链脂肪酸代谢异常，fmt能改善肠道菌群失衡状态并调节短链脂肪酸代谢。四、qrt-pcr检测结肠炎症水平变化(1)样品处理每组取8只小鼠，使用异氟烷吸入式麻醉，剪破右心耳，从左心室进针灌注生理盐水，找到盲肠解剖位置后在其下方1～2cm处取结肠组织2cm于1.5mlep管中，所有操作均在冰浴上进行，所得取材立即转移到-80℃保存。(2)总rna提取(a)用精密天平称量10mg结肠组织1.5mlep管中，先加入500μlbufferly，后加入10μlβ-巯基乙醇，用超声破碎仪破碎组织，使组织完全裂解。(b)将裂解的组织液移入dna柱子(置于2ml的收集管中)，13000rpm离心2min，弃掉dna柱子，保留收集管中的液体。(c)在收集管中加入500μl的乙醇，混匀。(d)将收集管中的液体移入rna柱子(置于2ml的收集管中)，13000rpm离心1min，弃掉收集管，将rna柱子放入一个新的收集管中。(e)在rna柱子中加入500μl的bufferrb，13000rpm离心30s，弃掉收集管中的液体，将rna柱子放回收集管中。(f)在rna柱子中加入500μl的rnawashbuffer，13000rpm离心1min，弃尽收集管中的液体，将rna柱子重新放回收集管中。(g)在rna柱子中加入500μl的rnawashbuffer，13000rpm离心30s，弃掉收集管，将rna柱子放入一个新的收集管中。(h)13000rpm离心2min，打开离心管盖子，并在室温中放置10min，以确保乙醇完全挥发。(i)将rna柱子转移到无rna酶的离心管中(1.5ml)，加入30μldepc水，13000rpm离心1min，收集rna溶液，-80℃保存备用。(3)将rna反转成cdna反应体系(10μl)：5×primescriptbuffer2μl、totalrna8μl；反应条件：37℃15分钟，85℃5秒，4℃保持。(4)荧光定量pcr反应反应体系(10μl)：2×sybrpremixextaqⅱ5μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、cdna模板1μl、灭菌水3μl；反应条件：95℃30秒；95℃5秒，55℃30秒，72℃30秒，40个循环，记录ct值阶段；添加溶解曲线。(5)实验结果结果如图4所示。与空白组正常小鼠对比，未经给药的帕金森病小鼠的结肠的炎症因子(tnfα、traf2、tlr4、nfκb，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)表达明显升高，给菌组小鼠结肠的炎症因子(tnfα、traf2、tlr4、nfκb，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)较模型组小鼠明显下降。结果证明模型组小鼠结肠出现炎症，本发明使用粪菌移植有助于降低帕金森病小鼠结肠内炎症现象。五、fmt对mptp诱导的pd小鼠模型的神经保护作用对小鼠黑质行th(多巴胺能神经元标记物，绿色荧光)及iba-1免疫荧光染色(激活的小胶质细胞标记物，红色荧光)。th染色结果(图5)显示模型组th阳性细胞数量少于空白组，而给菌组th阳性细胞数量较模型组增多，说明fmt能明显改善mptp诱导的pd小鼠脑内多巴胺能神经元变性死亡的现象。iba-1染色结果显示模型组小鼠iba-1阳性细胞较空白组明显增多，而给菌组iba-1阳性细胞较模型组减少，说明fmt能抑制mptp诱导的pd小鼠脑内小胶质细胞激活的现象，对神经炎症有抑制作用(n＝3～4)。六、粪便菌群构成差异如图6所示，方点代表空白组小鼠，圆点代表pd小鼠。pc1为第一主坐标，pc3为纵坐标。本发明纳入的10个样本在pc1-pc3坐标系中的分布显示空白小鼠和pd小鼠两组样本有明显的分开趋势且两组样品聚类明显，说明两组间肠道菌群构成具有明显差异且同组样品间相似性明显(n＝5)。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页12