一种基于纳米粒子‑血红蛋白的人造血红细胞的制备方法与流程

本发明属医学生物材料领域，尤其涉及一种基于纳米粒子-血红蛋白的人造血红细胞的制备方法。

背景技术：

血液是人体的重要组成，可以运输氧气、营养物质，排泄二氧化碳和及代谢产物等。血液的缺失会造成人体的重大伤害，甚至死亡。新鲜血液只能保存21到38天，在输入人体之前，还需要检验血液是否含有艾滋、乙肝等病毒，确定血型是否与被输入者血型相配。因为没有及时输血，许多人在战场上、急救室里、灾难中因为失血过多而死。输血是外科手术和内科治疗严重贫血等疾病的重要方法，也是战场救护和自然灾害中急救创伤病人的有效措施。

随着医学的发展，输血在临床上的应用日渐广泛，但是,常规输血存在以下常见的缺点：(1)易感染和传播艾滋病、乙肝、丙肝、西尼罗河病毒等血源性疾病；(2)存在血型不合的风险,使用前需要耗时进行交叉配型；(3)红细胞储存期短,容易发生血液理化性质和生物学特性的变化；(4)血源紧张；(5)溶血反应等。目前临床上使用血浆替代品作为血液代用品，但大部分仅具血液扩容作用，并无携氧、供氧能力。此外，在一些特殊的地方，比如高原、潜水及外太空等高需氧环境下，对血细胞的储氧量提出一定的要求。因此开发制备简易、安全、易用、高效的血液代用品是国际科学界和产业界的研发热点。

血液是由血浆和悬浮于血浆中的血红细胞组成，是维持生理活动和抵御外部致病因素的重要组成成分。20世纪60年代开始，各国科学家从高分子化合物和血红蛋白两方面研究具有载氧功能的血液代用品(lesleyk,2001,proc(baylunivmedcent),14(2),158-161)。血红蛋白类氧载体(hemoglobinbasedoxygencarrier,hboc)血代用品具有扩充血容量和类似红细胞的载氧/释氧功能，体内代谢较快，可及时从体内排出，使机体尽快恢复正常生理微环境等优点，作为新一代血液代用品备受关注，成为开发的热点。血红蛋白类氧载体构思的出发点是模拟生理状态，将血红蛋白与血液环境利用微囊隔离开来，实现模拟红细胞的目的。现有的微囊制备技术具有降解难、生物兼容性差等缺点，其包裹的血红蛋白本身只能携带四当量的氧气，且大多呈无序组合，极大的限制了其携氧能力，因此，难以实现在临床上的应用。

liduan等报道了(acsnano,2012,6897-6904)以纳米碳酸钙为模版，亲水聚乙二醇(peg)为外壳包裹血红蛋白构成人工血红细胞。此法均一性较好，亲水性好。然而，此法反应步骤较繁琐，载氧量低，使其应用受到限制。

yuxiong等报道了(acsnano,2013,7,7454-7461)以碳酸锰为模版，参杂血红蛋白和人血清清蛋白形成人工血红细胞。利用人血清清蛋白能进一步降低免疫原性，使其具备更低的毒性。但是，此法反应步骤较繁琐，载氧量低等缺点也限制了其应用。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于纳米粒子-血红蛋白的人造血红细胞的制备方法，用以克服现有技术中的血红蛋白类氧载体合成步骤繁琐、储氧能力不足、生物兼容性差等的缺点。

为实现上述发明目的，本发明提供的技术方案是：

一种基于纳米粒子-血红蛋白的人造血红细胞的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(s1)将1,3,5-苯三甲酸tma(ii)与铜离子在反应溶剂中回流反应，制备得到粗纳米材料(iii)，反应温度是50-120℃，反应时间为5-24小时；

(s2)粗纳米材料经分离和提纯后得到纳米材料(iii)，纳米材料(iii)经干燥后得到纳米粒子hkust-1；

(s3)纳米粒子hkust-1与血红蛋白利用缩合剂在ph＝4.0～10.0的缓冲盐溶液中进行缩合反应，得到粗人造血红细胞，缩合反应时间为12～48小时，温度为0～80℃；

(s4)粗人造血红细胞经分离和提纯后得到人造血红细胞hkust-1-hb(i)。

进一步地，所述步骤(s1)中，所述铜离子为硝酸铜、水合硝酸铜、氯化铜、水合氯化铜、硫酸铜和水合硫酸铜中的任一种或者多种。

进一步地，所述步骤(s1)中，所述反应溶剂为乙醇、水混合溶液；

优选，乙醇：水比例为1～5:1～5。

进一步地，所述步骤(s1)中，所述1,3,5-苯三甲酸与铜离子的物料比是1:1～5(w/v)。

进一步地，在所述步骤(s3)中，所述缩合剂为n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(edc)的混合物；

或者为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷的混合物(pybop)和1-羟基苯并三氮唑(hobt)的混合物；

或者为4-n,n-二甲基吡啶(dmap)和1-羟基苯并三氮唑(hobt)的混合物；

优选，n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以摩尔比1:1的混合物。

进一步地，在所述步骤(s3)中，所述缓冲盐溶液为磷酸缓冲盐溶液和三羟甲基氨基甲烷缓冲液中任一种或者两种。

进一步地，在所述步骤(s3)中，所述纳米材料iii与血红蛋白的物料比为1:1～1:50(w/v)。

进一步地，在所述步骤(s3)中，纳米材料的提纯采用过滤、透析或离心的方法。

进一步地，在所述步骤(s4)中，人造血红细胞的提纯利用过滤、透析或离心的方法。

本发明的另一个目的是保护一种人造血红细胞i，所述人造血红细胞i由上述技术方案的任一种方法制备得到。

采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

本发明反应条件温和，简便；产物收率高、成本低；反应所用试剂价格不高且容易获得；与现有技术相比，本发明能极大地提高人造血红细胞的储氧量；本发明方法的上述效果为工业生产提供了良好的前景。

本发明的人造血红蛋白采用具备高储氧能力的hkust-1纳米粒子，其储氧能力在30bar，298k时能吸收6molkg^-1氧气；该人造血红蛋白外壳结合了人血红蛋白，提高了该材料的生物兼容性及氧气缓释能力。

附图说明

图1为本发明的人造血红细胞构造示意图；

图2为本发明的1,3,5-苯三甲酸ii的结构图；

图3为本发明的纳米材料iii的晶体结构图；

图4为本发明的步骤(s3)中的偶联反应式。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的结构图及具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明的保护范围仍以权利要求为准，包括在此基础上所作出的显而易见的变化或变动等。

本发明提出的人造血红细胞的制备方法过程如下：

将具有如下结构的均苯三酸ii(结构如图2所示)与铜离子在有机溶剂或无机溶剂条件下回流反应，制备得纳米晶体[cu3(tma)2(h2o)3]n(iii)(晶体结构如图3所示)，其中，tma为1,3,5-苯三甲酸。

上述反应的反应溶剂为乙醇，水，二甲基甲酰胺等；优选，乙醇：水比例为1～5:1～5的混合物，其沸点在70℃以上，此类溶剂具有易得、价格便宜且易回收，反应易控制等优点。反应时间为5-24小时。

本发明化合物iii利用沉淀或离心或过滤的方法分离提纯，并用甲醇、乙醇或丙醇冲洗。总收率为50～90％。

本发明化合物iii在干燥后直接与血红蛋白在缓冲溶液中利用活化剂进行脱水偶联反应(或称缩合反应)，再利用离心或过滤或超滤膜分离提纯制得i，偶联反应式如图4所示。

图1为本发明的人造血红细胞构造示意图。

缩合反应的缩合剂为n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(edc)的混合物；或者为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷的混合物(pybop)和1-羟基苯并三氮唑(hobt)的混合物；或者为4-n,n-二甲基吡啶(dmap)和1-羟基苯并三氮唑(hobt)的混合物；优选为，n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以摩尔比1:1的混合物。

复合物人造血红细胞的提纯采用离心或过滤，并利用显微镜、扫描电子显微镜或透射电子显微镜检测；

本发明利用高压氧仓测试其储氧能力，高压氧仓压力为1～50大气压，储氧能力为0.1-5.5molkg^-1。

本发明利用电化学测试了其氧气释放曲线、释放时间，该人造血红蛋白氧气释放时间为0-48小时。

本发明的耦合反应(或称缩合反应)中，下述反应条件可获得较好的效果：活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐偶联试剂为n-羟基琥珀酰亚胺。化合物iii与血红蛋白的物料比为1:1～1:50(w/v)，反应即可取得预期效果。

hkust-1无机纳米粒子的制备：

实例1：

将1,3,5-苯三甲酸、三水硝酸铜按照摩尔比1:1(5.45g1,3,5-苯三甲酸，6.24g三水硝酸铜)溶解在乙醇(100ml)，水(150ml)混合溶液中，混合溶液在60摄氏度，回流24小时。纳米粒子(iii)利用滤纸过滤并用水、乙醇洗涤。化合物iii于50摄氏度干燥，得到蓝色结晶性粉末hkust-1(5.60g,70％,)。

实例2：

将1,3,5-苯三甲酸、三水硝酸铜按照摩尔比1:3.2(5.45g1,3,5-苯三甲酸,19.30g三水硝酸铜)溶解在乙醇(100ml)，水(150ml)混合溶液中，混合溶液在90摄氏度回流12小时。纳米粒子(iii)利用滤纸过滤并用水、乙醇洗涤。化合物iii于50摄氏度干燥，得到蓝色结晶性粉末hkust-1(5.2g,65％)。

实例3：

将1,3,5-苯三甲酸(5.45g,25.9mmol)、无水硫酸铜(13.28g,83mmol)溶解在乙醇(20ml)，水(100ml)混合溶液中，混合溶液在120摄氏度回流6小时。纳米粒子(iii)利用滤纸过滤并用水、乙醇洗涤。化合物iii于50摄氏度干燥，得到蓝色结晶性粉末hkust-1(3.20g,40％)。

实例4：

将1,3,5-苯三甲酸(5.45g,25.9mmol)、氯化铜(11.15g,83mmol)溶解在乙醇(100ml)，水(150ml)混合溶液中，混合溶液在90摄氏度回流24小时。纳米粒子(iii)利用滤纸过滤并用水、乙醇洗涤。化合物iii于50摄氏度干燥，得到蓝色结晶性粉末hkust-1(5.6g,66％)。

hkust-1-hb的合成：

实例5：

hkust-1(1g)，n-羟基琥珀酰亚胺(1.15g,10mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.9g,10mmol)溶解在pbs(ph＝5)缓冲溶液中，混合溶液在室温下搅拌3小时，血红蛋白(1g)加入到溶液中，混合物在室温下反应。48小时后，混合物置于离心管中在5000rmin^-1离心5分钟。得到0.8g深棕色人造血红细胞。