一种可提高基因转染效率的纳米粒子和基于该粒子的基因转染试剂的制备方法
【专利摘要】本发明属于生物医药【技术领域】，通过使用一种通过细胞释放的纳米粒子NONPs来提高基因转染效率。该种纳米粒子广泛存在于生物体系以及细胞外的循环系统中，例如支气管肺泡灌洗液、体液、血液、唾液、牛奶或者尿液中。本发明将上述纳米粒子掺入非病毒基因转染载体，可以显著增加基因转染载体的DNA负载能力，同时又不会增加细胞毒性。经实验结果表明，从牛奶中提取的NONPs，掺入PEI基因转染载体，可在几乎不增加细胞毒性的情况下，显著提高基因转染效率。本发明的主要用途为基因转染试剂，可用于细胞生物学研究、生产基因转染制剂以及基因疗法等。
【专利说明】—种可提高基因转染效率的纳米粒子和基于该粒子的基因转染试剂的制备
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种生物体自然产生的纳米粒子(NONPs)，通过掺杂的方式制备高效率的基因转染试剂。
【背景技术】:
[0002]基因转染是真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程，可用于生产基因制品如蛋白质，RNA，抗体等；或将控制基因引入细胞用以调节内在基因/酶的功能用于细胞生物学研究；或修复丢失/损坏的基因用于基因疗法。基因转染技术不仅是研究转基因和基因表达的重要工具，而且是目前基因治疗的关键步骤。理想的基因转染试剂应该具有如下特点:高效转染；安全；低细胞毒性；方法简单；省时、经济。
[0003]目前，主要的基因转染试剂为病毒型转染试剂与人工合成型转染试剂。病毒型转染试剂虽具有整合效率高、可使外源基因在宿主细胞中长期表达等优点，但是由于其基因携带能力有限，缺乏祀向性，易产生免疫源性，且操作危险(Putnam, D.Nat Mater 5,439-451,2006)，因此人们更倾向于使用人工合成型的基因转染试剂。目前人工合成型基因转染试剂主要是阳离子脂质体类、阳离子肽类和阳离子聚合物类，或者是上述几种的复合物。然而，当前的人工合成型基因转染试剂同病毒型试剂相比，仍然具有较低的转染效率，并且毒性高。这在很大程度上限制了它的应用(Mastrobattista,E., et.al.Nat Rev DrugDiscov 5，115-121，2006)。但这同时也说明，人工合成转染制剂在基因转染表现上还有很大的可提升空间。高效率、低毒性的基因转染试剂的研发目前是国际上的热门课题。
[0004]自然产生的纳米粒子(NONPs)在生物体系以及细胞体外循环系统中广泛存在。目前已经有多种NONPs被发现并命名，比如外来体(膜性囊泡)、脱落囊泡、宏粒子、多泡体等等。近期，这些纳米粒子在药`物传递和基因治疗上开始引发科学家和研究者的浓厚兴趣。虽然这些粒子的性质和功能还未被研究透彻，但是他们在细胞通讯方面起着重要作用已经得到广泛认同。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的是克服现有人工合成转染试剂转染率低的不足，提供一种可提高基因转染试剂转染率的纳米粒子(NONPs)，以及使用该粒子制备新型基因转染试剂的方法。
[0006]可提高转染效率的纳米粒子(NONPs)可以从牛奶但不仅限于从牛奶中纯化得到。该NONPs有以下特性:小于200nm的尺寸，如图1 ;表面带有负电荷。由于其表面负电荷，因此不会使DNA发生绑定或者凝结，如图2。通过添加NONPs得到的基因转染试剂具有高效率、低毒性的特点。
[0007]根据文献，制备NONP溶液的简化步骤如下:
[0008]1.经过筛选之后，采用低速离心过滤发去除大粒子，如细胞、大的细胞碎片等；
[0009]2.高速离心过滤法去除生物分子，如蛋白质、核苷酸等；同时制成球状NONPs ；[0010]3.将纯化的NONPs溶解水、或盐水溶液、或细胞培养液、或磷酸盐缓冲液(PBS)、或二甲基亚砜(DMSO)、或二甲基甲酰胺(DMF)、或甘油，或以上以一种或几种的混合液中。采用上述方法，Iml的NONP溶液可通过处理250ml牛奶得到。
[0011]基于上述NONPs的基因转染试剂的制备方法，是将该NONPs以及目前常用的基因转染试剂分散于溶剂中，该溶剂含有水、磷酸盐、或细胞培养液等。步骤如下:
[0012]pEGFP DNA 质粒 0.5 μ g、定量 PEI (0.1%,2μ I)以及 NONPs 4 μ L 混合后溶解入磷酸盐缓冲盐水(PBS)制作成100 μ L溶液。室温下培养30分钟，即可用于细胞的转染。
【专利附图】
【附图说明】:
[0013]图1.自然产生的纳米粒子NONPs的原子力分析图，标尺为500nm。
[0014]图2.1-4列为PEI/DNA带移分析图，5_7列为PEI/N0NP/DNA带移分析图。对应列
(I)N/P = O ； (2) N/P = 8 ； (3) N/P = 16 ； (4) N/P = O ； (5) N/P = O ； (6) N/P = 8 ； (7) N/P =16。样品分别为NONP:4μ L, DNA:100ng，对应实施例1和实施例2。
[0015]图3.(a)为PE1-DNA复合物原子力显微镜结构图，标尺为500nm ； (b)为ΡΕΙ/Ν0ΝΡ/DNA复合物的原子力显微镜结构图,标尺为500nm。
[0016]图4.(a)为H293T细胞在PEI/N0NP/DNA体系中转染48后(N/P = 32)的荧光粉显微镜图；(b)为H293T细胞在PEI/DNA体系中转染48后(N/P = 32)的荧光粉显微镜图。
[0017]图5.(a)为H293T细胞在不同N/P值下的转染效率对比图；(b)为H293T细胞在不同N/P值下的细胞存活率对比图。图中分别给出了相同N/P值下，添加NONPs前后，体系的转染效率及细胞存活率。(c)为H293T细胞在不同NONPs用量时的转染效率；(d)为H293T细胞在不同NONPs用量时的细胞存活率。
[0018]图6.(e)为Hela细胞在不同N/P值下的转染效率对比图；(f)为Hela细胞在不同N/P值下的细胞存活率对比图。图中分别给出了相同N/P值下，添加NONPs前后，体系的转染效率及细胞存活率。(g)为Hela细胞在不同NONPs用量时的转染效率；(h)为Hela细胞在不同NONPs用量时的细胞存活率。
【具体实施方式】:
[0019]可提高转染效率的纳米粒子(NONPs)可以从牛奶但不仅限于从牛奶中纯化得到(C.Admyre, S.M.Johansson, K.R.Qazi, J.J.Filen, R.Lahesmaa, M.Norman, E.P.A.Neve,A.Scheynius, S.Gabrielsson, J.Tmmunol.2007,179,1969-1978)。NONPs 尺寸小，不大于200nm，如图1 ;表面带有负电荷。由于其表面负电荷，因此不会使DNA发生绑定或者凝结，如图2。通过添加NONPs得到的基因转染试剂在不增加试剂毒性的情况下，具备了更高的转染效率。
[0020]实施例1.基于聚乙烯亚胺(PEI)混合NONPs的基因转染试剂对H293T细胞的转染实验
[0021](I)制备聚乙烯亚胺(PEI)混合NONPs的基因载体及基因转染试剂
[0022]选取pEGFP为报告基因(DNA)，聚乙烯亚胺(PEI)为基因转染载体。原子力结果显示PE1-DNA复合物的构造非常紧凑，大小为几十到几百个纳米如图3 (a);而PEI/N0NP/DNA复合物相对松散，原子力显微镜中可以看到独立的DNA线絮如图3(b)。图示表明，NONPs可能会对PE1-DNA的复合产生轻微干扰。
[0023]将pEGFP DNA质粒0.5 μ g、PEI以及NONPs 4 μ L混合后溶解入磷酸盐缓冲盐水(PBS)制作成100 μ L溶液。室温下培养30分钟。添加I %琼脂搪胶的TAE缓冲液(包含40ml三羟甲基氨基甲烷，Iml乙二胺四乙酸)。在Sub-Cell实验条件下(伯乐实验室、80V)培养60分钟。在5% C02，湿度95%，温度37°C的条件下培养H293T细胞，辅以10%牛血清(FCS)，每ml包含5000单元的青霉素、5000 μ g链霉素混合物(可使用0.85%生理盐水溶解青霉素G、链霉素硫化盐的方式获得)。
[0024](2)基因转染效率评价
[0025]将培养的H293T细胞在24孔板以I X 105/孔的细胞密度铺满；转染前放置12小时，使其在转染时细胞约有80%的聚集度。再将步骤I中得到的DNA、PE1、N0NPs复合物溶液辅以细胞培养介质(10% FCS，青霉素/链霉素混合物)，孵育48小时，孵育条件:5%C02，湿度95%，温度37°C。孵育48h后，将细胞分离，使用荧光显微镜可以看到细胞被转染，图
4。使用流式细胞仪进行荧光检测H293T的转染效率，在氮磷比(N/P)为32的时候，转染效率为40%。而同样条件下，未掺杂NONPs的PEI系统，转染效率仅为30%。可以证明，使用NONPs的转染试剂，使H293T细胞转染效率有了大约30%的提升。
[0026](3)基因转染试剂细胞毒性评价
[0027]细胞毒性评价采用台盼蓝染料排斥法。去步骤(2)中分离出的10 I细胞与10 I台盼蓝染料混合，使用细胞计数器进行计数，获得细胞存活率。测得细胞存活率为90%。而同样条件下，未掺杂NONPs的PEI系统，细胞存活率同样约为90%。可以证明，使用NONPs的转染试剂在氮磷比为32的情况下，并未对细胞活性造成明显影响。
[0028](4)采用不同的氮`磷比(N/P)进行基因转染实验
[0029]在不同的N/P值情况下，对比评价添加定量NONPs (4 μ L)前后的基因转染效率和细胞毒性，如图5 (a).可以证明:N/P值低于16时，添加NONPs对转染效率没有大的提升，转染效率都在10%左右；N/P值为32时，添加NONPs的PEI体系转染效率大幅提升了约33%，由30%提升至约40% ；N/P值为80时，添加NONPs的PEI体系转染效率提升了约16%，由43%提升至50%;N/P值为160时，添加NONPs的PEI体系转染效率提升了 34%，由33%提升至50%。
[0030]同时，如图5(b)在N/P值低于80时，细胞存活率均为90%左右；N/P值达到160时，细胞存活率小幅下降至约80%，显示NONPs的细胞毒性开始显现。相对于其对转染效率的显著提升，NONPs的细胞毒性已属非常轻微。
[0031](5)在一定N/P值情况下，采用不同NONPs添加量的基因转染实验
[0032]N/P值为32时，逐步增加NONPs用量，对基因转染效率和细胞毒性进行实验评价。实验结果如图5(c)显示，通过逐步增加NONPs至50 μ L，转染效率也有未添加时的30%逐步增长至43% ;与此同时，图5(d)显示细胞存活率几乎没有下降，显示了添加NONPs的基因转染试剂具有高转染率、低毒性的优越性能。
[0033]实施例2.基于聚乙烯亚胺(PEI)混合NONPs的基因转染试剂对Hela细胞的转染实验
[0034](I)制备聚乙烯亚胺(PEI)混合NONPs的基因载体及基因转染试剂
[0035]除培养的细胞为Hela细胞之外，其他采用原料以及实验步骤同实施例1。[0036](2)基因转染效率评价
[0037]实验步骤同实施例1。孵育48小时后，使用流式细胞仪检测Hela细胞的转染效率，在氮磷比(N/P)为32的时候，转染效率超过50%。而同样条件下，未掺杂NONPs的PEI系统，转染效率仅为40%。可以证明，使用NONPs的转染试剂，使Hela细胞转染效率有了大于25%的提升。
[0038](3)基因转染试剂细胞毒性评价
[0039]采用实施例1的方法，测得Hela细胞存活率为90%。而同样条件下，未掺杂NONPs的PEI系统，细胞存活率同样约为90%。可以证明，使用NONPs的转染试剂在氮磷比为32的情况下，并未对细胞活性造成明显影响。
[0040](4)采用不同的氮磷比(N/P)进行基因转染实验
[0041]在不同的N/P值情况下，对比评价添加定量NONPs (4 μ L)前后的基因转染效率和细胞毒性，如图6(e) (f)。实验显示:N/P值低于16时，添加NONPs对转染效率没有大的提升，转染效率都在10%左右；N/P值为32时，添加NONPs的PEI体系转染效率大幅提升了约25%，由40%提升至约50% ；N/P值为80时，添加NONPs的PEI体系转染效率提升了约10%，由55%提升至约60% ；N/P值为160时，添加NONPs的PEI体系转染效率大幅提升了37%，由40%提升至55%。
[0042]同时，如图6(f)在N/P值低于80时，Hela细胞存活率均为90%左右；N/P值达到160时，细胞存活率小幅下降至约80%，显示NONPs的细胞毒性开始显现。相对于其对转染效率的显著提升，NONPs的细胞毒性已属非常轻微。
[0043](5)在一定N/P值情况下，采用不同NONPs添加量的基因转染实验
`[0044]N/P值为32时，逐步增加NONPs用量，对Hela细胞基因转染效率和细胞毒性进行实验评价。实验结果如图6(g)显示，通过逐步增加NONPs至50 μ L，转染效率也有未添加时的15%逐步增长至50% ;与此同时，图6(h)显示细胞存活率几乎没有下降，显示了添加NONPs的基因转染试剂具有高转染率、低毒性的优越性能。
【权利要求】
1.一种掺杂自然产生的纳米粒子NONPs的非病毒性基因转染载体，它包含自然产生的纳米粒子NONPs和常规非病毒基因转染载体，其特点是高转染效率、低细胞毒性。
2.一种基于权利项I所述的掺杂NONPs的非病毒性基因转染载体制备的基因转染试剂，是将基因载体分散于水、或盐水溶液、或细胞培养液、或磷酸盐缓冲液(PBS)、或二甲基亚砜(DMSO)、或二甲基甲酰胺(DMF)、或甘油，或以上以一种或几种的混合液中。
3.根据权利要求1所述的自然产生的纳米粒子NONPs，包括但不仅限于外来体、膜性囊泡、脱落囊泡、宏粒子、多泡体。
4.根据权利要求1所述的自然产生的纳米粒子NONPs，其特性在于尺寸小，小于200nm。
5.根据权利要求1所述的自然产生的纳米粒子NONPs，其特性在于表面携带负电荷，不会使DNA发生带移或者凝结。
6.根据权利要求1所述的自然产生的纳米粒子NONPs，其特性在于在自然界中广泛存在，可以从支气管肺泡灌洗液、体液、血液、唾液、牛奶或者尿液中但不仅限于上述物质中纯化得到。
7.根据权利要求2所述的基因转染试剂的制备，其特性包含以下步骤(1)和步骤(2): (1)筛选权利要求6所述物质，首先采用低速离心过滤发去除大粒子，如细胞、大的细胞碎片等；再高速离心过滤法去除生物分子，如蛋白质、核苷酸等，同时将NONPs制作成球状；将纯化的NONPs溶解在权利要求2所述溶剂中。 (2)权利要求1中所述常规非病毒基因转染载体以及NONPs混合后溶解入磷酸盐缓冲盐水(PBS)或权利要求2所述溶剂中，即制成转染试剂。加入基因质粒，室温下培养30分钟，即可用于细胞转染。`
【文档编号】C12N15/63GK103865942SQ201210571278
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月18日 优先权日:2012年12月18日
【发明者】刘遵峰, 贾凤美 申请人:常州碳宇纳米科技有限公司