一种具有抗菌保湿适宜组织粘附的修复材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种具有抗菌保湿适宜组织粘附的修复材料及其制备方法和应用。

背景技术：

理想的组织修复材料应能最大程度地模拟细胞外基质结构和功能，同时具备储存及缓释活性因子的能力，从而指导和促进细胞行为，诱导组织再生。因此，研究和设计“结构和功能仿生”的修复材料是当今生物医学材料发展的重要方向。通过静电纺丝得到的纳米纺丝纤维具有较大的比表面积、可调控的孔隙率和较好的延展性，并且能模拟天然细胞外基质结构和功能，能够广泛的应用在人造血管、皮肤创伤修复以及骨组织工程等修复医学的各个方面。天然及合成高分子材料、陶瓷材料等均可用于静电纺丝纤维的制备，其中，人工合成高分子材料由于其优良的力学性能及易加工性在静电纺丝修复材料的研究中应用最为广泛。然而，此类合成高分子材料制备的纺丝纳米纤维往往具备较差的亲水性、生物活性因子吸附性、组织粘附性及细胞亲和性。

将人工合成高分子材料与天然高分子材料进行复合纺丝或与活性因子如生长因子、药物等进行共纺等是目前用于改善人工合成高分子纳米纺丝纤维性能的重要手段。将天然高分子及人工合成高分子材料进行复合纺丝，是赋予纺丝纤维良好力学及生物学性能的重要手段，然而此法往往需要寻找合适的共溶剂，这极大地限制了纺丝原料的选择范围。采用共纺技术实现活性因子的负载虽一定程度上能够提高材料的生物学活性，然而纺丝工艺条件对负载因子的活性有一定影响，且基于高分子材料对特殊溶剂的需求也会极大程度限制活性因子的选择范围。层层自组装技术是一种可用于对修复材料进行表面修饰的重要技术手段，其反应条件温和、操作简单、经济，且自组装层本身就可作为生物活性因子及药物的天然储存库。然而，层层自组装修饰层虽具有良好的生物学活性，但其在生理环境下的稳定性往往不够，也难以真正实现对负载因子或药物缓释的效果。

因此，仍需研究一种生物学活性好、结构和功能仿生，并能够负载药物或生物活性因子并实现其缓释，还具有较好稳定性的组织修复材料。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有抗菌保湿适宜组织粘附的修复材料，本发明提供的修复材料具有良好的抗菌和保湿性能，并具有较好的组织粘附性；其可作为水溶性药物及生物活性因子的稳定、高效缓释载体，适用于组织工程应用领域尤其是皮肤修复领域。

本发明的另一目的在于提供上述具有抗菌保湿适宜组织粘附的修复材料作为载体在水溶性药物及生物活性因子负载中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述具有抗菌保湿适宜组织粘附的修复材料在组织工程领域中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有抗菌保湿适宜组织粘附的修复材料，所述修复材料的制备方法如下：

s1：对透明质酸溶液进行巯基化修饰并控制游离巯基含量为100～200μmol·g^-1，经透析、冷冻干燥即得巯基化透明质酸；

s2：对壳聚糖溶液进行马来酰化改性并控制乙酰基含量为1500～2000μmol·g^-1，经透析、冷冻干燥即得马来酰化壳聚糖；

s3.将纳米纺丝纤维经多巴胺溶液浸泡后充分水洗，然后将纳米纺丝纤维依次浸入巯基化透明质酸溶液和马来酰化壳聚糖溶液中吸附，吸附完后洗脱；

s4：重复吸附、洗脱步骤若干次后即得巯基化透明质酸和马来酰化壳聚糖交替吸附的修复材料；

其中，巯基化透明质酸溶液的浓度为0.25～0.75mg·ml^-1，所述马来酰化壳聚糖溶液的浓度为0.25～0.75mg·ml^-1。

通过静电纺丝技术制备的纳米纺丝纤维具有较大的比表面积、可调控的孔隙率和较好的延展性、吸附性，且能模拟天然细胞外基质结构和功能等优势，成为了修复材料发展的新方向，然而单纯的人工合成高分子纳米纺丝纤维往往不具有抗菌、保湿性。需要对其进行适当的修饰与改性，以提高其用于创面修复的可行性。与单纯通过壳聚糖与透明质酸修饰相比，本发明通过对壳聚糖与透明质酸的化学改性，将其用于纺丝纤维修饰后可赋予修复材料良好的抗菌能力，无需进行额外的抗菌药物负载。

天然高分子自组装修饰层虽然具有良好的生物学活性，然而其在生理环境下的稳定性往往不够，需通过化学或物理交联手段提高其稳定性。本发明通过对透明质酸和壳聚糖进行化学修饰，在分子间引入具有反应活性的巯基及双键，使其在对纳米纺丝纤维进行自组装修饰过程中可以原位形成分子内交联，达到稳定透明质酸和壳聚糖修饰层的效果。同时，避免了事后小分子化学交联剂的使用，从而减少了后续的一系列小分子清洗等步骤，也一定程度上规避了小分子化学交联剂存在的潜在毒性作用。

本发明通过自组装生物功能化修饰对纳米纺丝纤维进行改性，在维持纳米纺丝纤维基体材料良好性能的基础上改善了其生物学功能，经修饰所得的修复材料具有良好的抗菌和保湿性能，其持水性也得到了明显的改善，还具有较好的组织粘附性。另外，本发明提供的生物功能化修饰后的纳米纺丝纤维能够承受诸如ph、高离子强度以及机械力等外界环境压力，可作为药物载体、组织工程支架或伤口修复材料应用在生物医学组织工程领域。

本发明方法采用层层自组装技术对纺丝纤维进行修饰，反应介质为水溶液，修饰过程在室温下进行，后续生物活性因子或药物的负载亦是在此条件下开展，不会引起材料的降解和变性，也不会影响负载因子的生物学活性。

优选地，所述游离巯基含量为100～200μmol·g^-1。

优选地，所述乙酰基含量为1500～2000μmol·g^-1。

优选地，巯基化透明质酸溶液的浓度为0.5mg·ml^-1，所述马来酰化壳聚糖溶液的浓度为0.5mg·ml^-1。

优选地，s4中重复吸附、洗脱步骤9～11次。

优选地，s1中选用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺对透明质酸水溶液进行活化处理；选用半胱氨酸盐酸盐对透明质酸进行巯基化修饰。

优选地，s2中壳聚糖和马来酸酐的摩尔比为0.5～2:1。

优选地，s3中巯基化透明质酸溶液的ph为5～7，马来酰化壳聚糖溶液的ph为3～5。

上述具有抗菌保湿适宜组织粘附的修复材料作为载体在水溶性药物或生物活性因子负载中的应用也在本发明的保护范围之内。

上述具有抗菌保湿适宜组织粘附的修复材料在组织工程领域中的应用也在本发明的保护范围之内。

优选地，所述修复材料在皮肤修复领域中的应用。

在本发明中，所述修饰层主要通过高分子间功能团的反应实现其在纺丝纤维表面的自组装。

在本发明中，所述s3中的纳米纺丝纤维可以是聚乳酸纳米纺丝纤维，也可以根据修复医学领域需求选用本领域的其它高分子纳米纺丝纤维如聚乳酸羟基乙酸纳米纺丝纤维等。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过对现有的纳米纺丝纤维进行生物功能化修饰，提供了一种具有良好抗菌和保湿性能的修复材料，该修复材料还具有较好的组织粘附性。本发明提供的修复材料可作为水溶性药物或生物活性因子的稳定、高效缓释载体，适用于组织工程应用领域尤其是皮肤修复领域。另外，本发明用于制备修复材料的方法和体系容易操作和控制，实验条件温和、成本低，避免了高能源的投入，具有较大的推广应用价值。

附图说明

图1为改性前后的透明质酸及壳聚糖的核磁谱图；

图2为不同修饰条件下聚乳酸纳米纺丝纤维的形貌结构；

图3为自组装修饰前后聚乳酸纳米纺丝纤维的亲疏水性图；

图4为自组装修饰前后聚乳酸纳米纺丝纤维的抗菌能力图；

图5为自组装修饰前后聚乳酸纳米纺丝纤维的组织粘附能力图（*p<0.05）；

图6为自组装修饰前后聚乳酸纳米纺丝纤维内胰岛素的缓释行为；

图7为不同纺丝纤维表面脐带间充质干细胞增殖行为（*p<0.05）。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步的说明，所举实例只用于解释本发明，但本发明要求保护的范围不局限于实例所表述的范围。

实施例1一种具有抗菌保湿适宜组织粘附的修复材料

（1）聚乳酸纳米纺丝纤维的制备

将7wt%的聚乳酸粉末溶解于dcm/dmf混合液中并装入20ml注射器中并固定于微量注射泵上，采用削平的针头作为喷射细流的的毛细管，毛细管内径为0.4mm，电场强度0.8kv·cm^-1，接收距离12cm，挤出量1ml·h^-1。将纺丝得到的纤维收集到旋转滚筒上，真空干燥去除残留的有机溶剂即可得聚乳酸纳米纺丝纤维。

（2）聚乳酸纳米纺丝纤维的自组装修饰

①透明质酸的巯基化改性

配制透明质酸（ha）水溶液，依次加入终浓度为50mmol·l^-1的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐（edac）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs），调节体系ph约为5～6。避光、室温搅拌反应一定时间后，在反应体系中加入一定量半胱氨酸盐酸盐，控制游离巯基含量在160μmol·g^-1左右，调节体系ph约为5，避光、室温搅拌反应5h后，透析3天，冷冻干燥后即可得巯基化ha（tha）。

②壳聚糖的马来酰化改性

将完全溶解的1wt%的壳聚糖（chi）溶液置于三口烧瓶中，根据chi重复单元与马来酸酐摩尔比为1:1的投料比向壳聚糖溶液中加入马来酸酐，控制乙酰基数目为1971μmol·g^-1左右，室温下避光反应24h后透析3天，以除去杂质和未反应的小分子，冷冻干燥后即可得马来酰化chi（ma-chi）。

③高分子聚电解质溶液的配置

各聚电解质溶液的配制如下：

多巴胺（2mg·ml^-1）溶解于tris-hcl（ph为8.5）溶液中；

将巯基化修饰后的ha（0.5mg·ml^-1）溶解于水溶液中，马来酰化chi（0.5mg·ml^-1）溶解于0.1m醋酸溶液中，磁力搅拌过夜使其充分溶解；同时配制同等浓度的天然ha和天然chi溶液作为对比。

上述各溶液在使用前，除了多巴胺与tha溶液之外，所有溶液的ph值均调至4。

④自组装修饰

聚乳酸纳米纺丝纤维经75%乙醇浸润后充分水洗，首先将其转移至2mg·ml^-1的多巴胺溶液中浸泡4h，然后充分水洗，使其在纺丝纤维表面组装上一层带正电的多巴胺基础层。经多巴胺修饰后的纳米纺丝纤维依次浸入tha与ma-chi溶液中，每一层吸附12分钟后都伴随着洗脱步骤（3×3min），洗脱液为水溶液；同时将多巴胺修饰后的纳米纺丝纤维依次浸入ha与chi溶液中，同等条件处理作对比。

重复以上步骤多次最终在多巴胺基础层上分别得到11层ha与chi及tha与ma-chi交替吸附的纳米纺丝纤维。

对上述经自组装修饰后的聚乳酸纳米纺丝纤维的形貌特征等物化性能进行检测，测试结果如下。

物化性能测试

（1）活性基团的鉴定

图1为改性前后的透明质酸及壳聚糖的核磁谱图，从图1可以看出，经过巯基化改性后的ha与马来酰化改性的chi分子上成功地引入了巯基与双键。此外，通过ellman’s测试和马来酸标准曲线法更进一步证实成功地对ha和chi进行了巯基化和马来酰化改性，其中巯基含量为160μmol·g^-1左右，乙酰基数目为1971μmol·g^-1左右。

（2）自组装修饰后的聚乳酸纳米纺丝纤维的形貌结构

图2分别为纯聚乳酸纳米纺丝纤维（plla）、多巴胺修饰后聚乳酸纳米纺丝纤维（da），天然chi与ha层层自组装修饰后聚乳酸纳米纺丝纤维（chi-ha）以及ma-chi与tha层层自组装修饰后聚乳酸纳米纺丝纤维（mchi-tha）的形貌结构。

从图2可以看出，经过ma-chi与tha修饰后聚乳酸纺丝纤维表面粗糙度有了明显的提高，这表明ma-chi和tha已经成功地吸附到聚乳酸纳米纺丝纤维上。

（3）自组装修饰后的聚乳酸纳米纺丝纤维的亲水性、保湿、持水能力

接触角（wca）检测是反应材料表面亲疏水性的重要手段，随着材料表面亲水性的增加，其wca值将降低。

由图3可以看出，经chi和ha或ma-chi与tha修饰后的纺丝纤维的亲水性都有了明显的提高。而进一步对材料的吸水、保湿性进行研究后发现，纯聚乳酸纺丝纤维的吸水、保湿能力分别为20.48%±6.44和12.31%±3.13，而经ma-chi和tha修饰后材料的吸水、保湿能力高达527.78%±25.46和56.87%±10.54，表明通过此法制备的修复材料具有良好的吸水、保湿效果。

（4）自组装修饰后聚乳酸纳米纺丝纤维抗菌性能

由图4可见，纯聚乳酸纳米纺丝纤维本身无抗菌性，周围未见抑菌圈，而经天然chi及ha修饰后的聚乳酸纳米纺丝纤维周围亦未见明显抑菌圈，提示其不具有抗菌能力。相反地，聚乳酸纳米纺丝纤维通过ma-chi与tha自组装修饰后纺丝纤维周围出现了明显的抑菌圈，抑菌圈宽度约为6.53mm±1.54，表明该修复材料具有明显的抗菌、抑菌能力。

（5）自组装修饰后聚乳酸纳米纺丝纤维组织粘附性能

图5为自组装修饰前后聚乳酸纳米纺丝纤维的组织粘附能力图，由图5可知，经自组装修饰后尤其是ma-chi与tha修饰后的纳米纺丝纤维的组织粘附能力有了显著的提高。我们推测，这可能是由于tha分子上的巯基可与组织内糖蛋白的富含半胱氨酸的亚结构域形成二元键，从而产生更强的组织粘附能力。

应用试验例一实施例1提供的修复材料在胰岛素负载中的应用

在我们前期研究中发现无血清条件下，一定浓度的胰岛素具有显著的促进脐带间充质干细胞增殖的能力。在此基础上，我们利用以实施例1中纺丝纤维修饰后的自组装高分子层为载体，通过简单浸泡的方式实现胰岛素在纺丝纤维内的负载，并对其理化性能进行测试。

（1）胰岛素缓释效果

图6为自组装修饰前后聚乳酸纳米纺丝纤维内胰岛素的缓释行为，由图6结果可见，经过ma-chi与tha修饰后的纺丝纤维内负载的胰岛素其缓释控释效果有了明显提高，胰岛素的释放能够持续到15天以后。

（2）细胞学评价

生物材料用于皮肤创面修复的一个重要因素即要求其具有促创面修复能力，前期实验在二维培养条件下发现一定浓度的胰岛素能够在无血清条件下明显的促进脐带间充质干细胞增殖。本专利利用自组装修饰层作为胰岛素载体，发现经ma-chi与tha修饰后的纺丝纤维可以明显提高胰岛素的缓释效果。图7为不同纺丝纤维表面脐带间充质干细胞增殖行为，由图7可知，负载胰岛素后的纺丝纤维可以显著促进细胞增殖，提示通过利用本专利发明的修复材料负载上胰岛素可以实现加速皮肤创面愈合的效果。

本发明通过对聚乳酸纳米纺丝纤维进行生物功能化修饰，得到了一种具有良好抗菌、保湿、适宜组织粘附性的修复材料，同时该技术还可推广应用于其他的高分子纳米纺丝纤维修饰上，以及其他组织工程应用领域。