眼镜蛇毒作为杀灭痤疮丙酸杆菌的用途和由其组成的抑制痤疮化妆品的制作方法

本发明涉及眼镜蛇毒作为杀灭痤疮丙酸杆菌的用途和由其组成的抑制痤疮化妆品。

背景技术：

痤疮是一种常见的毛囊、皮脂腺慢性炎症疾病,主要发生于面部，表现为粉刺、丘疹和脓疱等皮肤损害，并可引起色素沉着和瘢痕等持久的皮肤外观改变。痤疮是影响人类外貌的最常见皮肤病变，青少年中有大约90％发生过不同严重程度的痤疮，在25-34岁的成年人群中发生率也高达80％。新的更安全有效的抗痤疮治疗方法一直备受重视。

痤疮发病原因复杂，它与雄性激素分泌旺盛，皮脂腺分泌增多，毛囊和皮脂腺内皮脂瘀积，以及痤疮丙酸杆菌等细菌大量增生繁殖等因素有关。其中，痤疮丙酸杆菌是诱发炎症性丘疹、脓疱形成的主要病原菌，是造成皮肤损伤和长久性外观改变的重要原因。有效地杀灭痤疮丙酸杆菌对于痤疮的治疗有着极为重要的意义。

眼镜蛇毒有显著的抗菌作用，对葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、肺炎双球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏杆菌、霍乱弧菌、变形杆菌等各种革兰氏阳性或阴性菌，以及厌氧菌等均具有杀灭作用。然而，眼镜蛇毒能否有效地杀灭痤疮丙酸杆菌，用于皮肤痤疮的治疗还未见报道。

此外，已有的研究证实，各种眼镜蛇毒所含的毒性成分的类型是基本相同的。但由于受到产地、饲养、性别和年龄等诸多因素的影响，眼镜蛇毒各毒性成分的氨基酸序列和毒性的大小存在差异，所占的比例也不完全相同，不同来源的眼镜蛇毒的毒性大小相差可以非常悬殊。毒性强的眼镜蛇毒的使用危险性无疑会更高。另外，由于皮肤的屏障作用，眼镜蛇毒中的大分子成分（主要是蛋白酶类）是无法透过皮肤的。但这些蛋白酶类大多具有组织消化作用，在接触破损皮肤时可能会进一步加重组织的损伤。

因此，如何筛选皮肤使用安全的眼镜蛇毒（包括未经提取的粗毒和经过精制的眼镜蛇毒），以及如何制备得到去除大分子蛋白酶类作用的眼镜蛇毒（经过精制的眼镜蛇毒），并如何将特定含量的经过安全筛选的眼镜蛇毒应用到抑制痤疮化妆品中，用于皮肤痤疮的治疗，还未见相关报道。

技术实现要素：

本发明的首要目的旨在给出眼镜蛇毒作为杀灭痤疮丙酸杆菌的用途。

所述眼镜蛇毒选自符合眼镜蛇毒皮肤外用安全性筛选试验的未经提取的粗毒和/或经过精制的蛇毒。

其中，所述眼镜蛇毒皮肤外用安全性筛选试验采用剪皮小鼠致死毒性试验：

1）实验动物：昆明种小鼠10只，雌雄各5只，体重19~23g；

2）蛇毒样品：称取眼镜蛇毒粗毒或精制蛇毒冻干粉适量，用纯净水配制成10mg/ml蛇毒溶液，5000r/min离心20min，取上清，过0.22mm滤膜除菌，备用；

3）实验过程：在小鼠背部剪去面积至少0.5cm²的全层皮肤，正常饲养24小时后，按0.5ml/g体重在创面上均匀滴加10mg/ml蛇毒上清；

4）结果判断：观察3日无小鼠死亡，即最小致死量大于5.0mg/kg体重。

对未经提取的粗毒和/或经过精制的蛇毒进行安全性筛选，选择毒性低的未经提取的粗毒和/或经过精制的蛇毒有助于保证其皮肤使用的安全性，只要符合上述眼镜蛇毒皮肤外用安全性筛选试验的眼镜蛇毒均为本发明所述的未经提取的粗毒和/或经过精制的蛇毒。

其中，所述未经提取的粗毒杀灭痤疮丙酸杆菌的最低抑菌浓度mic为15.6mg/ml。

其中，所述经过精制的蛇毒可以通过各种分离或变性等技术，如超滤提取、分子筛层析、离子交换柱层析、蛋白变性和沉淀等制备方法得到。通过这些制备方法可以有效减少或去除蛇毒蛋白酶的作用，从而进一步提高眼镜蛇毒皮肤使用的安全性。

其中，所述超滤提取制备方法，包括如下步骤：5.0g眼镜蛇粗毒加250ml纯净水溶解，5000r/min离心20min，取蛇毒上清；蛇毒上清通过2万分子量的超滤膜进行超滤，超滤压力0.4mpa，通过超滤膜的部分即为减毒的经过精制的蛇毒（精制眼镜蛇毒样品1）；冷冻干燥成冻干粉保存。所述通过超滤提取制备方法得到的经过精制的蛇毒杀灭痤疮丙酸杆菌的最低抑菌浓度mic为31.3mg/ml。

其中，所述分子筛层析制备方法，包括如下步骤：sephadexg75层析柱（4.5×110cm）用20mmph7.6的磷酸盐缓冲液（pbs）平衡；10.0g眼镜蛇粗毒加70mlpbs溶解，5000r/min离心20min，取上清上sephadexg75层析柱进行分子筛层析分离，洗脱的流速约150ml/h，蛋白检测仪测定洗脱液在280nm的吸收峰，结果如图1所示；最先洗脱的峰ⅰ舍弃，其余各洗脱峰（ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ）合并；合并的组分上sephadexg10层析柱（7.0×120cm）脱盐，收集洗脱的蛋白主峰，即为减毒的经过精制的蛇毒（精制眼镜蛇毒样品2）；冷冻干燥成冻干粉保存。所述通过分子筛层析制备方法得到的经过精制的蛇毒杀灭痤疮丙酸杆菌的最低抑菌浓度mic为7.8mg/ml。

其中，所述离子交换柱层析制备方法，包括如下步骤：cm-sepharosefastflow层析柱（3.6×30cm）用20mmph5.6的醋酸-醋酸钠缓冲液平衡；5.0g眼镜蛇粗毒加200ml上述醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，5000r/min离心20min，取上清上cm-sepharosefastflow柱进行离子交换层析分离，洗脱的流速约500ml/h，蛋白检测仪测定流出液在280nm的吸收峰；未吸附的蛇毒组分舍弃，吸附的蛇毒组分用含0.5mnacl的醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱并收集，结果如图2所示的峰ⅲ；峰ⅲ组分上sephadexg25分子筛层析柱（7.0×120cm）脱盐，收集洗脱的蛋白主峰，即为减毒的经过精制的蛇毒（精制眼镜蛇毒样品3）；冷冻干燥成冻干粉保存。所述通过离子交换柱层析制备方法得到的经过精制的蛇毒杀灭痤疮丙酸杆菌的最低抑菌浓度mic为15.6mg/ml。

其中，所述蛋白变性和沉淀制备方法，包括如下步骤：5.0g眼镜蛇粗毒加100ml纯净水溶解，在沸水内加热10min，5000r/min离心20min，取蛇毒上清；蛇毒上清即为灭活和去除了高分子量蛋白质的减毒的经过精制的蛇毒（精制眼镜蛇毒样品4）；冷冻干燥成冻干粉保存。所述通过蛋白变性和沉淀制备方法得到的经过精制的蛇毒杀灭痤疮丙酸杆菌的最低抑菌浓度mic为62.5mg/ml。

此外，本发明还公开了一种包含上述眼镜蛇毒的抑制痤疮化妆品。

其中，所述眼镜蛇毒的添加量占抑制痤疮化妆品总重量的0.01-1.0wt%。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明采用符合眼镜蛇毒皮肤外用安全性筛选试验的未经提取的粗毒和/或经过精制的蛇毒应用到抑制痤疮化妆品中，能够有效杀灭痤疮丙酸杆菌，所有化妆品配方的抑菌率均＞99.7%，通过对238例痤疮患者试用本发明由眼镜蛇毒组成的抑制痤疮化妆品，发现对痤疮患者的有效率在81.1%~86.6%，平均起效时间为2.7±1.1~3.1±0.9天，试用过程中没有痤疮患者面部皮肤出现明显不良反应。

附图说明

图1为分子筛层析制备方法中蛋白检测仪测定洗脱液在280nm的吸收峰；

图2为阳离子交换柱层析制备方法中蛋白检测仪测定洗脱液在280nm的吸收峰。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。

抗痤疮丙酸杆菌活性测定：

以蛇毒样品的最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration，mic)代表其抗痤疮丙酸杆菌的活性。

1.蛇毒样品：

（1）检测样品包括通过皮肤安全性筛选的眼镜蛇毒的粗毒样品（蛇毒冻干粉），以及精制眼镜蛇毒样品1、样品2、样品3和样品4。

（2）蛇毒样品的制备：分别称取各眼镜蛇毒样品冻干粉适量，用注射用水将蛇毒样品稀释至1000mg/ml，5000r/min离心20min，取上清，过0.22mm滤膜除菌。

2.痤疮丙酸杆菌培养：

（1）菌种复苏：痤疮丙酸杆菌菌株接种在疱肉培养基，在无氧条件下37℃恒温培养48h。

（2）菌悬液制备：挑取培养基上痤疮丙酸杆菌，用灭菌生理盐水校正至0.5麦氏比浊标准(约1.5´10⁸cfu/ml)，再用bd培养液稀释成1.0´10⁶cfu/ml的菌悬液。

（3）微量板制备及点种：取一次性无菌96孔u型底培养板一个，向每孔加入bd培养液100ml，在每排的第1孔分别加入浓度为1000mg/ml眼镜蛇毒样品溶液100ml，混匀后吸取100ml至第2孔，混匀后再吸取100ml至第3孔，如此连续倍比稀释至第11孔，从第11孔中吸取100ml弃去，第12孔为不含药物的生长对照。再向每孔分别加入痤疮丙酸杆菌悬液100ml，放入恒温培养箱中在37℃条件下无氧培养48h。

3.判断标准：完全抑制细菌生长的药物稀释度最高的小孔的蛇毒样品浓度即为该样品的最低抑菌浓度（mic）。

应用实施例1：由眼镜蛇毒组成的抗粉刺霜

组分配比（%为质量百分数）

硬脂酸5

氢氧化钾0.7

十六十八醇2

单甘酯1

白油10

甘油5

氮酮0.6

茶树油5

未经提取的粗毒0.05

苦参素1

尼泊金甲酯0.1

香精适量

去离子水余量

应用实施例2：由眼镜蛇毒组成的抗粉刺露

组分配比（%为质量百分数）

蒲公英提取物1

精制蛇毒样品10.1

甘草酸二钾0.2

氮酮0.6

丙二醇4

carbomer9400.3

氨甲基丙醇0.15

尼泊金甲酯0.1

香精适量

去离子水余量

应用实施例3：由眼镜蛇毒组成的抗粉刺凝胶

组分配比（%为质量百分数）

精制眼镜蛇毒样品20.03

氮酮0.6

sepigel3054

95%乙醇40

去离子水余量

应用实施例4：由眼镜蛇毒组成的抗粉刺乳

组分配比（%为质量百分数）

白油5

十六十八醇2.5

单苷酯2

ipp4

cosmacolemi4

二甲基硅油2

尼泊金甲酯0.15

尼泊金丙酯0.05

novela2.5

丙二醇6

汉生胶0.1

aristoflexavc0.4

苯氧乙醇0.5

精制眼镜蛇毒样品30.05

去离子水余量

应用实施例5：由眼镜蛇毒组成的抗粉刺霜

组分配比（%为质量百分数）

十六十八醇2

地蜡1

单苷酯2

芦荟油3

gtcc5

二甲基硅油5

尼泊金甲酯0.15

尼泊金丙酯0.05

winsier5.0

1，3-丁二醇5

苯氧乙醇0.5

尿素囊0.2

精制眼镜蛇毒样品40.4

去离子水余量

取上述应用实施例1-5的化妆品进行抑制痤疮丙酸杆菌活性的测试（参照《消毒技术规范》2002年版-2.1.11.3.2），测试结果如表1所示：

表1

自愿试用应用实施例1-5所述的由眼镜蛇毒组成的抑制痤疮化妆品的痤疮患者的效果

1）痤疮患者：年龄15~35岁，男女比例大约各占一半。患者在接受祛痘产品试用前2周内未使用过抗炎或抗菌药物，也未接受过任何针对痤疮的处理措施。

2）使用方法：清洁面部后，试用品均匀涂于面部患处，每日早晚各1次，观察4周。

3）观察指标：试用前及试用中观察皮损及不良反应情况，并记录起效时间。痤疮皮损的观察指标为皮肤的粉刺、丘疹、脓疱数目的变化；不良反应主要观察有无出现瘙痒、皮疹、刺痛、脱屑等皮肤反应；起效时间是指用药后皮疹减轻达到20%以上的天数。

4）疗效判定：疗效=（治疗前皮损计数-治疗后皮损计数）/治疗前皮损计数×100%。疗效分4级：痊愈为皮损计数减少≥90%以上；显效为皮损计数减少60%～89%；好转为皮损计数减少20%～59%；无效为皮损计数减少<20%。总有效率=痊愈率+显效率。

5）结果：痤疮患者使用后疗效如表2所示，实施例痤疮患者的有效率在81.1%~86.6%，平均起效时间为2.7±1.1~3.1±0.9天，试用过程中没有痤疮患者面部皮肤出现明显不良反应。

表2

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